15825576_甲状旁腺素1-34对卵巢切除大鼠椎间盘软骨终板Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达的影响

㊃论 著㊃
[收稿日期]2017-09-19;[修回日期]2017-10-12
[基金项目]河北省医学科学研究重点课题(20170137
)[作者简介]骆阳(1982-)
,男,河北石家庄人,河北医科大学第三医院主治医师,医学博士,从事骨外科疾病诊治研究㊂
甲状旁腺素(1-34
)对卵巢切除大鼠椎间盘软骨终板Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达的影响
骆 阳,齐 璨,罗鹏远,梁少博
(河北医科大学第三医院创伤急救中心,河北省骨科生物力学重点实验室,河北石家庄050051
) [摘要] 目的探讨甲状旁腺素(p a r a t h y r o i dh o r m o n e ,P T H )(1-34)对卵巢切除(o v a r i e c t o m y ,O V X )大鼠椎间盘软骨终板Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达的影响㊂方法30只3月龄雌性S D 大鼠随机分为3组:假手术组(S h a m )㊁卵巢切除组(O V X )及卵巢切除+甲状旁腺素(1-34)组(O V X+P T H )㊂O V X 组及O V X+P T H 组行双侧卵巢切除术
后12周,O V X+P T H 组大鼠给予皮下注射P T H (1-34)(30μg ㊃k g -1㊃d -1
)
㊂连续用药12周后,处死大鼠并收集标本㊂各组大鼠软骨终板行v a nG i e s o n 染色及组织学观察,Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原行免疫组织化学染色分析㊂结果软骨终板经v a nG i e s o n 染色显示,S h a m 组软骨终板形态正常,而O V X 组软骨终板内可见大量骨样组织形成,并且在骨样组织中可见髓腔形成及血细胞的出现,O V X+P T H 组软骨终板内可见少量骨样组织形成及少量髓腔出现㊂免疫组织化学染色显示,O V X 组软骨终板内Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达显著高于S h a m 组(P <0.05),而O V X+P T H 组Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达显著低于O V X 组(P <0.05)㊂结论皮下注射甲状旁腺素(1-34)可有效抑制O V X 大鼠椎间盘软骨终板Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原的表达㊂
[关键词] 椎间盘;软骨终板;胶原Ⅰ型;胶原Ⅹ型;甲状旁腺素 d o i :10.3969/j .i s s n .1007-3205.2018.02.008 [中图分类号] R 681.1 [文献标志码] A [文章编号] 1007-3205(2018)02-0155-05
T h e e f f e c t o f p a r a t h y r o i dh o r m o n e (1-34)o n t h e e x p r e s s i o n s o f t y p eⅠc o l l a g
e na n d t y p eⅩc o l l a g e n i n t h e c a r t i l a g e e n d p
l a t e o no v a r i e c t o m i z e d r a tm o d e l L U O Y a n g ,Q IC a n ,L U OP e n g -y
u a n ,L I A N GS h a o -b o (1.D e p a r t m e n t o f O r t h o p a e d i cS u r g e r y ,t h eT h i r d H o s p i t a l o f H e b e iM e d i c a lU n i v e r s i t y ,K e y L a b o r a t o r y
o f O r t h o p a e d i cB i o m e c h a n i c s o f H e b e iP r o v i n c ,S h i j i a z h u a n g 0
50051,C h i n a )[A b s t r a c t ]O b j
e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e
f f e c t s o f p a r a t h y r o i dh o r m o n e (P T H )(1-34)o n t h e e x p r e s s i o n s o f t y p e Ⅰc o l l a
g e na n dt y p e Ⅹc o l l a g e n i nt
h ec a r t
i l a g ee n d p
l a t eo no v a r i e c t o m i z e d (O V X )r a tm o d e l .M e t h o d s T h i r t y f e m a l e S p r a g u e -D a w l e y r a t s ,3m o n t h o f a g e ,w e r e r a n d o m l y
d i v i d
e d i n t ot h r e e g r o u p s :t h es h a m -o p e r a t e d (S h a m )g r o u p a n dt w oo v a r i e c t o m i z e d g r o u p
s t r e a t e dw i t h v e h i c l e o r P T H (1-34)(30μg ㊃k g -1㊃d -1
)
f o r t w e l v ew e e k s .T r e a t m e n tw a s s t a r t e d a f t e rt w e l v e w e e k s p o s t -O V X a n d c o n t i n u e df o rt w e l v e w e e k s .A tt h ee n d o fe x p
e r i m e n t ,h i s t o l o g y a n di mm u n o h i s t o c h e m i s t r y a n a l y s i s w e r e p e r
f o r m e dt o a l l
g r o u p
s .R e s u l t s T h e c a r t i l a g e e n d p l a t e i n t h eS h a m g r o u p a p p e a r e dn o r m a l .I n t h eO V X g r o u p ,t h e c a r t i l a g e e n d p l a t e s h o w e d d e g e n e r a t i v e c h a n g e s ,w h e r e t h e b o n y t i s s u e s t h a t c o n t a i n e d b o n em a r r o w ,h e m a t o p
o i e t i c l i n e a g e c e l l s a n d m i n e r a l i z e d b o n e ,b e c a m e m o r e o b v i o u s .I n c o n t r a s t ,t h e h i s t o l o g i c a l m o r p h o l o g y i nt h e O V X +P T H g r o u p s h o w e daf e w e rb o n y t i s s u e sf o r m e di nt h ec a r t i l a g
e e n d p l a t e .T h e r e s u l t s o fm o l e c u l a r a n a l y s i s r e v e a l e d a s i g n i
f i c a n t i n c r e a s e i n t y p e Ⅰc o l l a g
e na n d t y p eⅩc o l l a g e ne x p r e s s i o n s i nt h e O V X g r o u p t h a nt h a t i nt h eS h a m g r o u p (
P <0.05),a n d ㊃
551㊃第39卷第2期2018年2月
河
北
医
科
大
学
学
报
J O U R N A L O F H E B E I M E D I C A L U N I V E R S I T Y
V o l .39 N o .2
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m a r k e dr e d u c t i o n s i nt h e t y p eⅠc o l l a g e na n dt y p eⅩc o l l a g e ne x p r e s s i o n s i nt h eO V X+P T H g r o u p t h a n t h a t i n t h eO V X g r o u p(P<0.05).C o n c l u s i o n P T H(1-34)t r e a t m e n tw a s e f f e c t i v e i n r e d u c i n g t h e e x p r e s s i o no f t y p eⅠc o l l a g e n a n d t y p eⅩc o l l a g e n i n t h e c a r t i l a g e e n d p l a t e i nO V X r a t s.
[K e y w o r d s]i n t e r v e r t e b r a ld i s c;c a r t i l a g ee n d p l a t e;c o l l a g e nt y p eⅠ;c o l l a g e nt y p eⅩ; p a r a t h y r o i dh o r m o n e
腰背部疼痛是中老年人的常见病,大约60%的人在70岁之前会出现腰痛症状㊂引起腰背部疼痛的主要原因是椎间盘发生了退行性改变,而导致椎间盘退变的因素包括正常的老化过程㊁椎体生物力学性能改变㊁椎间盘营养供给异常以及椎间盘细胞外基质代谢失衡等,其中椎间盘营养供给异常是导致椎间盘退变的重要因素㊂椎间盘主要通过软骨终板以弥散的方式在椎体与椎间盘之间进行物质交换㊂软骨终板的增厚㊁钙化将严重影响其弥散营养物质的能力,导致椎间盘营养障碍,从而加速椎间盘退变的进程[1]㊂本课题组前期研究结果显示卵巢切除(o v a r i e c t o m y,O V X)大鼠椎体骨量减少与椎间盘退变呈正相关性,应用骨质疏松药物[阿仑膦酸钠㊁鲑鱼降钙素㊁甲状旁腺素(p a r a t h y r o i dh o r m o n e, P T H)(1-34)]进行干预,可以有效延缓卵巢切除大鼠腰椎间盘退变进程[2-8]㊂因此,本研究旨在观察P T H(1-34)对卵巢切除大鼠软骨终板Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达的影响㊂
1材料与方法
1.1动物来源及分组30只3月龄雌性S p r a g u e-
D a w l e y(S D)大鼠,S P F级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,随机分为3组,每组10只:假手术组(S h a m)㊁卵巢切除组(O V X)和卵巢切除+甲状旁腺组(O V X+P T H)㊂所有大鼠均分笼饲养,自由摄食水,室温(24ʃ2)ħ,自然光照,动物饲料购自北京维通利华实验动物技术有限公司㊂
1.2骨质疏松大鼠模型制备用10%的水合氯醛按3m L/k g剂量对大鼠腹腔麻醉,取侧卧位,以后方髂骨嵴上2c m㊁脊柱旁1c m处为中心备皮,碘伏消毒术区,铺手术巾㊂以后方髂骨嵴上2c m㊁脊柱旁1c m处纵行切开,依次切开皮肤㊁皮下组织及筋膜组织,钝性分离肌层,暴露腹腔㊂于切口下方脂肪组织中暴露卵巢及输卵管(成熟卵巢为淡红色菜花状,黄豆大小,与输卵管相连,表面有不规则结节状卵泡),用镊子将卵巢及其周围的软组织提起后,丝线结扎周围组织及输卵管,切除卵巢,将切除卵巢后的组织还纳回腹腔,逐层缝合手术切口,关闭腹腔㊂应用碘伏对切口周围进行消毒㊂对侧卵巢切除依照此方法进行㊂S h a m组只行背部切开手术,即暴露卵巢但不切除㊂
1.3药物干预及标本采集卵巢切除术后12周, O V X+P T H组皮下注射甲状旁腺素(1-34)(美国S i g m a公司),剂量为30μg㊃k g-1㊃d-1㊂再连续给药12周后以过量麻醉的方法处死所有大鼠㊂切开大鼠背部皮肤,锐刀分离附着在脊柱上的肌肉及其他软组织,L4~5椎体及其椎间盘置于10%福尔马林中性缓冲液中保存㊂固定完成后将标本置于10% E D T A脱钙液中进行脱钙,每3d更换1次脱钙液,大约3个月左右脱钙完成㊂之后对标本依次进行冲洗㊁梯度脱水㊁透明㊁浸蜡㊁石蜡包埋等处理㊂使用切片机对包埋好的蜡块进行切片㊂石蜡切片进行v a n G i e s o n染色,Ⅰ型胶原㊁Ⅹ型胶原进行免疫组织化学染色㊂
1.4检测方法
1.4.1椎间盘v a nG i e s o n染色石蜡切片常规脱蜡至水㊂W e i g e r t铁苏木素染5~10m i n,水洗㊂1%盐酸酒精分化,流水冲洗㊂v a n G i e s o n染液染1~2m i n;倾去染液,直接用95%酒精急速分化数秒;无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片㊂光镜下观察㊂
1.4.2免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡至水㊂3%过氧化氢封闭,复合酶消化,滴加抗兔Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原多克隆抗体(购自武汉博士德), 4ħ冰箱过夜㊂滴加生物素标记的二抗㊂滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液㊂D A B显色㊂苏木精复染,盐酸酒精分化,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片㊂光镜下观察㊂
1.5统计学方法应用S P S S15.0统计学软件分析数据㊂计量资料比较分别采用F检验和L S D-t 检验㊂P<0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1软骨终板组织学观察结果卵巢切除术后24周,椎间盘软骨终板经v a nG i e s o n染色结果显示: S h a m组椎间盘软骨终板结构正常,软骨终板内含
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有大量的透明软骨细胞,细胞排列规则;O V X 组软骨终板内可见透明软骨层中大量骨样组织形成,在骨样组织中可见髓腔及血细胞;与O V X 组相比,
O V X+P T H 组软骨终板可见少量的骨样组织及髓
腔形成,透明软骨细胞排列较规则(图1
)
㊂图1 各组大鼠腰椎间盘软骨终板v a nG i e s o n 染色结果(ˑ200)A.S h a m 组;B .O V X 组;C .O V X+P T H 组
F i g u r e1 v a n
G i e s o n s t a i n i n g o f c a r t i l a g ee n d p l a t e i ne a c h g r o u p (ˑ200)2.2 软骨终板免疫组织化学染色结果 对大鼠软
骨终板进行Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原免疫组织化学染色结果发现:S h a m 组软骨终板中Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达较弱;O V X 组软骨终板内Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达显著高于S h a m 组(P <0.05)
,呈强阳性表达;与O V X 组相比,O V X+P T H 组软骨终板内Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达较弱(图2)㊂O V X 组Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达显著高于S h a m 组,O V X+
P T H 组Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达显著低于O V X
组,差异均有统计学意义(P <0.05
),见表1
㊂图2 各组大鼠软骨终板Ⅰ型胶原㊁Ⅹ型胶原免疫组织化学染色结果(ˑ400)A.S h a m 组Ⅰ型胶原;B .O V X 组Ⅰ型胶原;C .O V X+P T H 组Ⅰ型胶原;D.S h a m 组Ⅹ型胶原;E .O V X 组Ⅹ型胶原;F .O V X+
P T H 组Ⅹ型胶原
F i g u r e2 I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a s s a y f o r t y p e I c o l l a g e na n d t y p eXc o l l a g e n i n t h ec a r t i l a g ee n d p l a t ea m o n g
t h e t h r e e g r o u p
s (ˑ400)㊃
751㊃河北医科大学学报 第39卷 第2期
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表1各组大鼠软骨终板Ⅰ型胶原㊁
Ⅹ型胶原免疫组织化学染色积分光密度值
T a b l e1T h e I O Do f t y p eⅠc o l l a g e na n d t y p eⅩc o l l a g e n
i n i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g
(n=10,x-ʃs,I O D值)组别Ⅰ型胶原Ⅹ型胶原
S h a m组314.00ʃ22.05314.60ʃ19.48
O V X组426.50ʃ35.17*515.20ʃ27.78*
O V X+P T H组375.80ʃ32.46*#442.50ʃ29.73*# F34.291152.087
P0.0000.000
*P<0.05与S h a m组比较 #P<0.05与O V X组比较(L S D-t检验)
3讨论
椎间盘退变的具体发病机制尚不清楚,椎间盘退变的病因㊁发病机制成为近年来研究的重点㊂目前,用于研究椎间盘退变的动物模型有很多种,如纤维环穿刺法[9-13],软骨终板损伤法[14],髓核注射消化酶法[15-18]等㊂本课题组前期研究结果显示,卵巢切除大鼠椎体骨量减少与椎间盘退变呈正相关性[2,4-7]㊂并且经骨质疏松治疗药物(阿仑膦酸钠或鲑鱼降钙素)干预可有效延缓卵巢切除大鼠腰椎间盘退变进程㊂椎间盘作为人体内最大的无血管器官,其营养主要通过软骨终板将椎体血窦中的营养物质以弥散的方式进行供给,如果椎间盘软骨终板发生改变,将进一步影响椎间盘的营养供给[19]㊂因此,本研究通过卵巢切除术建立骨质疏松相关椎间盘退变动物模型,应用P T H(1-34)进行干预,通过组织学染色及免疫组织化学染色等方法,进一步说明P T H(1-34)对卵巢切除大鼠软骨终板营养代谢的影响㊂
椎间盘退变的具体发病机制尚不明确,在引起椎间盘退变的各种原因中,软骨终板结构和功能的完整性在椎间盘退变过程中的作用越来越受到了人们的重视㊂软骨终板是位于椎体与椎间盘之间的薄层透明软骨,厚度约为1mm,软骨终板上存在许多微孔,是椎间盘进行营养物质交换及代谢产物进出的通道㊂软骨终板下层的微小血管是椎间盘营养主要来源,营养物质经软骨终板的弥散作用进入到椎间盘㊂椎间盘的营养通路包含软骨终板营养通路与纤维环外侧营养通路㊂软骨终板对于维持脊柱生物力学传导㊁应力重新分布的过程起着至关重要的作用,与椎间盘一起共同维持着脊柱的正常形态和生理功能㊂
正常情况下,软骨终板退变是一个自然老化的过程,但同时受到多种因素的影响,并且在受到炎
症㊁异常应力分布等情况下加速其退变过程㊂软骨
终板退变在椎间盘退变过程中发挥着重要的作用㊂
软骨终板的退变早于椎间盘的退变,有证据显示椎
间盘退变是从软骨终板开始的[20]㊂各种因素作用于软骨终板引起软骨终板细胞外基质成分减少㊁水
分丢失㊁细胞凋亡,导致钙化软骨层逐渐增厚,而钙
化软骨的增多将引起软骨终板营养通路受阻,椎间
盘营养减少及代谢废物的集聚,最终导致椎间盘细
胞代谢障碍而出现凋亡坏死,引起椎间盘退变的发
生㊂在本研究中,大鼠椎间盘软骨终板经v a n G i e s o n染色后发现,O V X组软骨终板内可见透明软骨层中大量骨样组织形成,在骨样组织中可见髓腔及血细胞;与O V X组相比,O V X+P T H组软骨终板可见少量的骨样组织及髓腔形成,透明软骨细胞排列较规则㊂
椎间盘退变过程中,软骨终板细胞外基质代谢
的改变亦发挥着重要的作用㊂软骨终板属于透明软
骨,主要由透明软骨细胞及丰富的细胞外基质组成,
不含有神经㊁血管等组织㊂当软骨细胞功能发生改
变时,基质的合成及代谢过程亦会发生相应的改变,
从而导致软骨终板生物力学功能及生理功能随之发
生变化,进一步导致椎间盘退变的发生㊂Ⅰ型胶原是脊椎动物体内最丰富的胶原,主要由成骨细胞㊁成纤维细胞合成㊂正常椎间盘软骨终板内主要为Ⅱ胶原表达,当软骨终板出现钙化时,钙化组织及其周边细胞外基质中出现Ⅰ型胶原表达㊂Ⅰ型胶原的表达提示软骨终板退变的发生㊂此外,本研究同时对软骨终板内Ⅹ型胶原进行免疫组织化学染色及定量分析㊂Ⅹ型胶原的表达与软骨终板钙化密切相关㊂Ⅹ型胶原在人类出生后即从椎间盘的基质中消失,而当椎间盘发生退变时,在软骨细胞中重新出现㊂Ⅹ型胶原是由肥大软骨细胞合成分泌的,在软骨骨化和基质钙化过程中发挥着重要的作用㊂Ⅹ型胶原与基质血管相连可能会激活钙通道,引起钙离子快速流入基质血管,同时钙离子可以促进Ⅹ型胶原的产生[21]㊂Ⅹ型胶原的增加为钙化提供适宜的环境,不正常的钙化可能会影响椎间盘的营养,从而引发病理变化[22]㊂Ⅹ型胶原的表达与椎间盘软骨终板钙化密切相关㊂在本研究中,O V X组与S h a m组相比,软骨终板内骨样组织及其周边的软骨基质中Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原呈强阳性表达,而O V X+P T H 组软骨终板内Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达明显低于O V X组㊂提示P T H可有效抑制卵巢切除大鼠椎
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间盘软骨终板的退变进程㊂
综上所述,皮下注射甲状旁腺素(1-34)可有效抑制卵巢切除大鼠腰椎间盘软骨终板内钙化组织的形成,并可有效降低Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原的表达㊂[参考文献]
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(本文编辑:刘斯静)
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骆阳等甲状旁腺素(1-34)对卵巢切除大鼠椎间盘软骨终板Ⅰ型胶原及Ⅹ型胶原表达的影响
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