pheS基因作为反向筛选标记的原理和应用

pheS基因作为反向筛选标记的原理和应用
摘要
反向筛选是一种在大量候选菌株中快速筛选出目标菌株的方法，常用于基因敲除、基因组编辑等实验中。

反向筛选的关键是选择合适的反向筛选标记，即能够使目标菌株在特定条件下存活，而使非目标菌株死亡或失活的基因或序列。

pheS基因是编码苯丙氨酸-tRNA合成酶α亚基的基因，参与蛋白质的合成。

它在不同的细菌中有不同的序列，可以用来作为分子标记进行细菌的鉴定和分类。

pheS基因的突变形式pheS可以使细菌对有毒的苯丙氨酸类似物对氯苯丙氨酸（PCPA）敏感，从而实现反向筛选。

利用pheS作为反向筛选标记，可以在不留下抗生素抗性基因等外源序列的情况下，实现细菌基因组的精确编辑。

这种方法已经成功应用于金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌等细菌中。

本文介绍了pheS*作为反向筛选标记的原理和应用，并讨论了其优缺点和发展前景。

正文
1. 反向筛选的概念和意义
反向筛选是一种在大量候选菌株中快速筛选出目标菌株的方法，常用于基因敲除、基因组编辑等实验中。

反向筛选与正向筛选相对应，正向筛选是指在大量候选菌株中选择出具有某种特定性状或功能的菌株，例如抗生素抗性、荧光表达等。

反向筛选则是指在大量候选菌株中排除掉不具有某种特定性状或功能的菌株，例如敏感性、失活性等。

反向筛选的关键是选择合适的反向筛选标记，即能够使目标菌株在特定条件下存活，而使非目标菌株死亡或失活的基因或序列。

常用的反向筛选标记有两类：一类是利用外源序列或化合物对细胞产生毒性或抑制作用，例如I-SceI内切酶、ccdB毒素、sacB基因等；另一类是利用内源序列或化合物对细胞产生敏感性或依赖性，例如galK基因、rpsL基因、pheS基因等。

反向筛选相比正向筛选有以下优点：（1）可以避免使用抗生素抗性基因等外源序列作为正向筛选标记，减少对环境和人体健康的潜在风险；（2）可以提高筛选效率和准确度，减少假阳性和假阴性结果的出现；（3）可以扩大可操作的细菌范围，包括一些难以培养或难以转化的细菌。

2. pheS基因作为反向筛选标记的原理
pheS基因是编码苯丙氨酸-tRNA合成酶α亚基的基因，参与蛋白质的合成。

苯丙氨酸-tRNA合成酶是一种异源二聚体，由α亚基和β亚基组成，负责将苯丙氨酸与相应的tRNA结合，形成苯丙氨酸-tRNA复合物。

苯丙氨酸-tRNA复合物是蛋白质合成过程中的必需物质，如果缺乏或失活，会导致细胞死亡或停止生长。

pheS基因在不同的细菌中有不同的序列，可以用来作为分子标记进行细菌的鉴定和分类。

pheS基因的突变形式pheS可以使细菌对有毒的苯丙氨酸类似物对氯苯丙氨酸（PCPA）敏感，从而实现反向筛选。

PCPA 是一种能够与pheS产生的苯丙氨酸-tRNA合成酶结合，形成不稳定的PCPA-tRNA复合物，阻断蛋白质的合成，导致细胞死亡或停止生长的
化合物。

而野生型的pheS产生的苯丙氨酸-tRNA合成酶则不会与PCPA 结合，因此不受其影响。

利用pheS作为反向筛选标记，可以在不留下抗生素抗性基因等外源序列的情况下，实现细菌基因组的精确编辑。

具体步骤如下：（1）将含有pheS和目标基因敲除片段（例如同源重组臂）的质粒转化到细菌中；（2）在含有抗生素和PCPA的培养基上筛选出转化菌株；（3）将筛选出的转化菌株在不含抗生素和PCPA的培养基上进行稀释培养；（4）在含有PCPA但不含抗生素的培养基上进行二次筛选；（5）通过PCR或测序等方法验证目标基因是否被敲除。

3. pheS*作为反向筛选标记的应用
利用pheS*作为反向筛选标记，可以在不留下抗生素抗性基因等外源序列的情况下，实现细菌基因组的精确编辑。

这种方法已经成功应用于金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌等细菌中。

金黄色葡萄球菌是一种广泛分布于人类和动物皮肤和黏膜上的革兰阳性球菌，是引起皮肤、软组织、呼吸道、心血管、中枢神经系统等多种感染的重要病原体。

金黄色葡萄球菌具有高度的耐药性和毒力因子，给临床治疗带来了巨大挑战。

为了深入研究金黄色葡萄球菌的耐药性和毒力因子的分子机制，需要对其基因组进行精确的编辑和操作。

然而，金黄色葡萄球菌的基因组编辑受到了其自身的限制，例如转化效率低、抗生素抗性基因有限、同源重组频率低等。

为了克服这些困难，研究人员利用pheS作为反向筛选标记，成功地在金黄色葡萄球菌中实现了单基
因和多基因的敲除。

他们首先构建了一个含有pheS和目标基因敲除片段的质粒，将其转化到金黄色葡萄球菌中，在含有PCPA的培养基上进行筛选，然后在不含PCPA的培养基上进行稀释培养，最后在含有PCPA 但不含抗生素的培养基上进行二次筛选，从而获得目标基因敲除的菌株。

他们验证了该方法的高效性和准确性，并用其成功地敲除了与耐药性和毒力因子相关的多个基因，例如mecA、agrA、sarA等。

该方法为金黄色葡萄球菌的功能基因组学研究提供了一种新的工具。

炭疽芽孢杆菌是一种革兰阳性芽孢杆菌，是引起人畜共患的严重传染病炭疽病的病原体。

炭疽芽孢杆菌具有高度的耐受性和毒力，是一种潜在的生物恐怖主义武器。

为了深入研究炭疽芽孢杆菌的致病机制和防治策略，需要对其基因组进行精确的编辑和操作。

然而，炭疽芽孢杆菌的基因组编辑也面临着一些挑战，例如转化效率低、抗生素抗性基因有限、同源重组频率低等。

为了解决这些问题，研究人员利用pheS作为反向筛选标记，成功地在炭疽芽孢杆菌中实现了单基因和多基因的敲除。

他们首先构建了一个含有pheS和目标基因敲除片段的质粒，将其转化到炭疽芽孢杆菌中，在含有PCPA的培养基上进行筛选，然后在不含PCPA 的培养基上进行稀释培养，最后在含有PCPA但不含抗生素的培养基上进行二次筛选，从而获得目标基因敲除的菌株。

他们验证了该方法的高效性和准确性，并用其成功地敲除了与芽孢形成、毒力因子合成、代谢途径等相关的多个基因，例如spo0A、lef、cya等。

该方法为炭疽芽孢杆菌的功能基因组学研究提供了一种新的工具。

4. pheS*作为反向筛选标记的优缺点和发展前景
利用pheS*作为反向筛选标记，可以在不留下抗生素抗性基因等外源序列的情况下，实现细菌基因组的精确编辑。

这种方法具有以下优点：（1）可以避免使用抗生素抗性基因等外源序列作为正向筛选标记，减少对环境和人体健康的潜在风险；（2）可以提高筛选效率和准确度，减少假阳性和假阴性结果的出现；（3）可以扩大可操作的细菌范围，包括一些难以培养或难以转化的细菌；（4）可以实现单基因和多基因的敲除，甚至可以实现基因组的大片段的删除或插入。

然而，利用pheS作为反向筛选标记，也存在一些局限性和不足，例如：（1）需要构建含有pheS和目标基因敲除片段的质粒，这可能需要一定的时间和成本；（2）需要使用PCPA作为反向筛选条件，这可能需要特殊的实验设备和操作规范；（3）需要考虑pheS*与细菌本身的pheS 的同源性，避免出现交叉反应或重组；（4）需要考虑细菌对PCPA的耐受性或适应性，避免出现筛选失效或逃逸。

因此，利用pheS作为反向筛选标记，还有一些改进和优化的空间，例如：（1）寻找更简便和高效的构建含有pheS和目标基因敲除片段的质粒的方法，例如利用CRISPR-Cas系统等；（2）寻找更安全和便捷的反向筛选条件，例如利用其他苯丙氨酸类似物或pheS特异性抑制剂等；
（3）寻找更适合不同细菌种类的pheS变体，例如利用进化工程等方法进行优化和定制；（4）寻找更有效地防止细菌对PCPA产生耐受性或适应性的方法，例如利用其他反向筛选标记进行联合筛选等。

总之，利用pheS*作为反向筛选标记，是一种在不留下抗生素抗性基因等外源序列的情况下，实现细菌基因组的精确编辑的新方法。

这种方法已经成功应用于金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌等细菌中，并展示了其高效性和准确性。

这种方法为细菌功能基因组学研究提供了一种新的工具，并有望在其他细菌中得到推广和应用。

同时，这种方法还有一些改进和优化的空间，需要进一步的研究和探索。