重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达及菌的破碎

重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达及超声破碎
一．实验目的：
(1)了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。

(2)了解降解物阻遏的现象及其机理。

二．实验原理：
本实验使用的是载体是已重组好的 pQE31-BTI ，宿主细胞为大肠杆菌，目的基因的产物为融合蛋白，目的蛋白为荞麦胰蛋白酶抑制剂GBTI，非目的蛋白即融合部分为标签6×His，可用于亲和层析分析。

本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。

操纵子是原核基因表达的协调单位。

通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。

乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成，如下图1所示：
乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。

(1)诱导表达
当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。

阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因不能转录，也就不能翻译出蛋白质。

也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态，如下图2所示：
当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖，异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向3’端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA，然后翻译出蛋白质。

也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导，如下图3所示：
乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。

IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）是异乳糖的结构类似物。

由于IPTG不会被分解，它的诱导作用是持久的。

(2)葡萄糖降解物的阻遏作用
代谢物基因激活蛋白（Catabolite gene Activation Protein）CAP，又称cAMP受体蛋白属于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。

CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP 结合区。

当CAP与cAMP结合后，就可结合DNA促进乳糖操纵子的转录。

葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP 的浓度，抑制乳糖操纵子的转录。

本实验使用的表达载体pGFPuv 上含有乳糖操纵子的调节序列，目的基因表达的是带 6×His 的重组绿色荧光蛋白。

在IPTG的诱导下，融合蛋白表达可增强105倍，并且可用金属螯合亲和层析分离纯化，最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。

三．材料与试剂：
(1)材料
工程菌：BL21(DE3)Pet28a-pod
(2)试剂
LB 液体培养基：蛋白胨（tryptone）10g、酵母粉（yeast extract）5g、NaCl 10g，加800mL双蒸水溶解，用10M NaOH调pH至7.2-7.5，定容至1000mL。

分装，高压灭菌，4℃保存。

卡那霉素溶液：无菌双蒸水配成100mg/mL，分装，-20℃保存，使用终浓度为50μg/mL
或100μg/mL。

IPTG溶液（100 mM）：将238.3mg IPTG溶解于10mL双蒸水，0.22μm细菌滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用，贮存浓度为100 mM。

超声平衡缓冲液：50mM Tris-HCl, pH7.0
四．实验仪器：
超净工作台、低温摇床、高速冷冻离心机、超声破碎仪等。

五．实验步骤、现象、结果及分析：
1. 挑取BL21(DE3)pET28a-pod 的单菌落接种到5mlLB液体培养基（含卡那，终浓度为100μg/mL）
2. 诱导表达
1#不需处理，2#加入5μL IPTG至终浓度为0.1mM，于37℃、250rpm培养4h。

3. 收菌破碎细胞
菌液分别收集到2个1.5mLEp离心管中(收3次），编上相应编号。

离心，弃上清(10000rpm 离心1min)。

加入缓冲液Tris-HCl(pH7.3,50mM)，超声波破碎，离心，取上清。

4. SDS-PAGE鉴定重组蛋白是否表达及其分子量。