第五章大肠杆菌基因工程
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解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的 轨道
质粒拷贝数
质粒扩增时序的控制
pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子 在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60
PL MCS
在42℃时，拷贝数迅速增至300 - 600
在此温度下，受体细胞染色体上的CI基
pCP3
因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 Apr
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的序列的影响：
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
外源基因全合成
按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适 宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在 大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
同步表达相关tRNA编码基因 对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分
ori
因此，用一种手段同时控制质粒拷
贝数和基因的表达
3 大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
包涵体型异源蛋白的表达
包涵体及其性质
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它 们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不 溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从 而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和 脂多糖等非蛋白分子
启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的
密码子
生物体对密码子的偏爱性
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码 子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：
生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体 fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子 占90%以上的绝对优势
Ptrp 除去色氨酸
Ptrp
Ptrp
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA） 高效转录
Otrp 高效转录
Otrp
启动子的可控性
启动子
l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏，很难直接诱导控制。在基因
Ptrp
工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋 在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌
ATC GAA GGT CGC G1AA2GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC
Tcr
蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
于一些终止作用较弱的终止子，通常 然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子
启动子最佳距离的探测
目的基因
E
E
A
启动子
目的基因
E
E
A 酶切开 Bal31酶解
启动子的筛选
启动子
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质 粒上报告基因galk的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
Apr ori
pKO1
终止密码子 galK
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人
终止子也可以象启动子那样，通过 稳定性大约是在细胞质中的10倍
生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体
ori
特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因
筛选Apr、Tcs的转化子
组DNA中克隆筛选
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的 频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大 肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’， 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基 中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将 mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起 始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
cAMP CAP
Plac 葡萄糖代谢
Plac
Plac UV5
高效转录
O cAMP浓度降低
基底水平转录
O 高效转录
O
启动子
启动子的可控性
色氨酸
色氨酸启动子Ptrp的可控性： 阻遏蛋白
基底水平转录
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达
密码子与反密码子相互作用的自由能 中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；
细胞内tRNA的含量
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程 大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高 效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略 可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：
终止子
强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临
因此，用一种手段同时控制质粒拷
基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制
被酶美促国 裂F解D法A批止准为子安全是的基来因工自程受大体生肠物 杆菌rRNA操纵子上的
以包涵体形式表达目的蛋白的操作
rrnT T 以及T7噬菌体DNA上的Tf。对 融合蛋白表达质粒的构建原则：
启动子的可控性
启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
基底水平转录 阻遏蛋白
O 诱导
高效转录 O
启动子的可控性
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
培养罐中迅速升温非常困难，因
Ptrp
此常使用一个双质粒控制系统，
用色氨酸间接控制目的基因表达
阻遏作用
cI857 PL
A
色氨酸 PL
A
目的基因 B
表达 B
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
以分泌形式表达目的蛋白的优缺点 占90%以上的绝对优势
Apr
pCP1
可以采用二聚体终止子串联的特殊结 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（
DNA体内重组的基本原理
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞
构，以增强其转录终止作用 （IAA）
随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠
子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含 有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞 中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠 杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个 高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体 细胞对外源基因高效表达的制约作用
第五章大肠杆菌基因工程
1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势
质粒拷贝数
质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达 数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生 长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增 殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进 而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降
含有外源启动子活性的重组克隆
启动子的构建
启动子
启动子
-35 区序列
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
TTGACA TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
-10 区序列
GATACT TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响：
大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区 形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均 会导致翻译起始效率不同程度的降低
质粒拷贝数
质粒扩增时序的控制
pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子 在28℃时，每个细胞的质粒拷贝数为60
PL MCS
在42℃时，拷贝数迅速增至300 - 600
在此温度下，受体细胞染色体上的CI基
pCP3
因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 Apr
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的序列的影响：
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半 乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20 倍
外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
外源基因全合成
按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适 宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在 大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
同步表达相关tRNA编码基因 对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分
ori
因此，用一种手段同时控制质粒拷
贝数和基因的表达
3 大肠杆菌基因工程菌的构建策略
包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
包涵体型异源蛋白的表达
包涵体及其性质
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它 们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不 溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从 而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和 脂多糖等非蛋白分子
启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 进Plac介导的转录。葡萄糖 代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型，即Plac UV5
目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的
密码子
生物体对密码子的偏爱性
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码 子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：
生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体 fX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子 占90%以上的绝对优势
Ptrp 除去色氨酸
Ptrp
Ptrp
Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA） 高效转录
Otrp 高效转录
Otrp
启动子的可控性
启动子
l噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏，很难直接诱导控制。在基因
Ptrp
工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋 在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌
ATC GAA GGT CGC G1AA2GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC
Tcr
蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
于一些终止作用较弱的终止子，通常 然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列的影响：
一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效 率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而 言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅 度降低
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素
2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子
启动子最佳距离的探测
目的基因
E
E
A
启动子
目的基因
E
E
A 酶切开 Bal31酶解
启动子的筛选
启动子
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质 粒上报告基因galk的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
Apr ori
pKO1
终止密码子 galK
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人
终止子也可以象启动子那样，通过 稳定性大约是在细胞质中的10倍
生物基因组中的碱基含量 在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体
ori
特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因
筛选Apr、Tcs的转化子
组DNA中克隆筛选
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的 频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大 肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之 间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’， 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基 中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将 mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起 始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列
cAMP CAP
Plac 葡萄糖代谢
Plac
Plac UV5
高效转录
O cAMP浓度降低
基底水平转录
O 高效转录
O
启动子
启动子的可控性
色氨酸
色氨酸启动子Ptrp的可控性： 阻遏蛋白
基底水平转录
色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达
密码子与反密码子相互作用的自由能 中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少； 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；
细胞内tRNA的含量
密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程 大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高 效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略 可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：
终止子
强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终 供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临
因此，用一种手段同时控制质粒拷
基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制
被酶美促国 裂F解D法A批止准为子安全是的基来因工自程受大体生肠物 杆菌rRNA操纵子上的
以包涵体形式表达目的蛋白的操作
rrnT T 以及T7噬菌体DNA上的Tf。对 融合蛋白表达质粒的构建原则：
启动子的可控性
启动子
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起，在没有诱导物 存在时，整个操纵子处于基 底水平表达；诱导物可以使
P 乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
启动子Plac介导的转录大幅 提高
P
基底水平转录 阻遏蛋白
O 诱导
高效转录 O
启动子的可控性
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率
培养罐中迅速升温非常困难，因
Ptrp
此常使用一个双质粒控制系统，
用色氨酸间接控制目的基因表达
阻遏作用
cI857 PL
A
色氨酸 PL
A
目的基因 B
表达 B
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
以分泌形式表达目的蛋白的优缺点 占90%以上的绝对优势
Apr
pCP1
可以采用二聚体终止子串联的特殊结 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（
DNA体内重组的基本原理
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞
构，以增强其转录终止作用 （IAA）
随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠
子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利。例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含 有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞 中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。为了提高人尿激酶原cDNA在大肠 杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个 高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体 细胞对外源基因高效表达的制约作用
第五章大肠杆菌基因工程
1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势
质粒拷贝数
质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达 数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生 长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增 殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进 而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降
含有外源启动子活性的重组克隆
启动子的构建
启动子
启动子
-35 区序列
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
TTGACA TTGATA TAGACA TTGACA TTTACA TTGACA
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
-10 区序列
GATACT TATAAT TAATGT TTAACT TATAAT TATAAT
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响：
大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50% 而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’ 端非编码区 形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均 会导致翻译起始效率不同程度的降低