翻堆对蛋鸡粪堆肥甲烷排放的影响

翻堆对蛋鸡粪堆肥甲烷排放的影响
刘俊专;王燕;廖新俤;吴银宝;胖是
【摘要】采用蛋鸡粪和锯末堆肥,研究不同翻堆频率对堆肥甲烷排放量的影响.结果表明,在40d的堆肥过程中,翻堆频率为4次/d、2次/d、1次/d、1次/3d、1次/6d和不翻堆时,甲烷排放总量分别为28.60L、50.07L、70.85L、76.48L、90.74L 和59.33L,与不翻堆相比,高翻堆频率(4次/d、2次/d)降低了甲烷排放总量,低翻堆频率(1次/3d、1次/6d)增加甲烷的排放总量.高翻堆频率显著降低产甲烷菌的多样性指数和产甲烷菌的总量,而低翻堆频率显著增加了产甲烷菌的总量.因此,不同翻堆频率可能是通过影响堆体氧气含量以及产甲烷菌多样性和总量来改变甲烷排放总量.【期刊名称】《家畜生态学报》
【年(卷),期】2014(035)002
【总页数】6页(P42-47)
【关键词】翻堆频率;蛋鸡粪;堆肥;甲烷排放
【作者】刘俊专;王燕;廖新俤;吴银宝;胖是
【作者单位】华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642;华南农业大学动物科学学院,广东广州510642
【正文语种】中文
【中图分类】S811.6
随着全球温室效应的日益加剧，温室气体研究备受各国学者关注。

甲烷(CH4)作为重要的温室气体之一，其增暖潜势约是二氧化碳(CO2)的23倍，对全球变暖的贡
献率为19%，仅次于CO2(55%)，且甲烷排放每年正以0.9%的速度持续增加[1]。

农业生产是 CH4的重要排放源，40%的 CH4排放源于农业生产[2]。

其中畜禽粪
便是最为重要的排放源之一，全球约有9%的生物性 CH4源于畜禽粪便的管理和
应用过程中[3-5]。

因此研究畜禽粪便管理利用过程中甲烷排放对全球甲烷减排，
减轻全球温室效应具有重要意义。

堆肥是实现畜禽粪便无害化、减量化和资源化的主要途径，同样也是减少畜禽粪便温室气体排放的重要方式[6-7]。

在堆肥过程中甲烷排放约占初始总有机碳的
0.01%～8.0%[4]。

翻堆可以促进堆体升温、物料降解及腐熟，但也可能影响CH4排放。

近年研究表明，翻堆可显著减少CH4的排放[8-9]；而也有学者研究发现，翻堆会增加CH4的排放[6,10]。

这可能是因为不同研究采用的翻堆频率不同，从
而导致翻堆对CH4排放产生不同影响。

但目前鲜见专门研究翻堆对CH4排放影
响的相关报道。

因此，本试验通过设定不同的翻堆频率，研究其对CH4排放所产生的影响，并对影响CH4生成的微生物菌群进行分析，为堆肥过程中合理翻堆及CH4减排提供依据。

1.1 堆肥原料与试验分组
新鲜的蛋鸡粪便采自中山市白石鸡场产蛋鸡舍，传输带收集粪便、打包，第2天
运输至试验现场。

锯末购自河源市东源县某木材加工厂。

堆肥原料主要成分见表1。

将鸡粪和锯末按鲜重湿重比为7.64︰1，控制堆体物料初始重约150 kg，初始
C/N为10左右，含水率68%。

按照4次/d、2次/d、1次/d、1次/3d、1次/6d和不翻堆6个不同翻堆频率，
分为A、B、C、D、E和F(对照组)6个处理。

A组每天09︰00、15︰00、21︰
00和03︰00翻堆，B组每天09︰00和21︰00翻堆，其他各组在翻堆当天的
09︰00翻堆。

试验时间为40 d。

1.2 堆肥设备
采用自行设计的动态箱式堆肥试验装置，内部配有搅拌装置以及温度探头，对堆肥过程中的温度实时监测。

堆肥箱长×宽×高为60 cm×60 cm×80 cm，体积为288 L。

箱体结构见图1。

1.3 测定指标及方法
1.3.1 气样采集及CH4浓度测定堆肥前15 d，每天分别在09︰00～10︰00、14︰00～15︰00和20︰00～21︰00 3个时间段，收集1 h内由箱体出气口排出的所有气体，混匀后用1 L铝箔袋采集气样，用于测定CH4浓度。

采用安捷伦气相色谱仪(7890A)FID检测器测定CH4浓度，色谱柱采用
Agilent19091P-Q04。

CH4排放量的计算公式如下：
F=(C1-C2)V
式中：F为CH4排放量(mL)，C1为出气口CH4浓度(μL/L)，C2为进气口CH4浓度(μL/L)，V为出气口总流量(m2)。

1.3.2 总DNA提取堆肥样品微生物总DNA采用OMEGA公司E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit试剂盒提取。

1.3.3 产甲烷菌普通PCR扩增以总DNA为模板，采用巢式PCR法进行扩增，试验所用引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

首先采用Met86F和
Met1340R为引物(表2)[11]，扩增产甲烷菌16S rRNA基因片段，目的片段大小为1 254 bp，反应体系采用25 μL的扩增体系，其中Premix Ex TaqTM Version2.0 12.5 μL，引物Met86F(10 pmol/μL)0.5 μL，引物Met1340R(10
p mol/μL)0.5 μL，DNA模板0.5 μL，加无菌ddH2O至体积25 μL。

PCR条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，54 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s。

34个循环，最后72 ℃延伸10 min，然后4 ℃保温，反应结束后取5 μL PCR产物用2%
琼脂糖凝胶于130 V电泳23 min，然后通过凝胶成像系统观察PCR产物，并拍
照记录，确认PCR扩增出目的产物后用于下一步PCR的模板；再采用产甲烷菌的特异性引物对GC-Arc344F和519R(表2)[12]，扩增产甲烷菌16S rRNA基因上
的V3可变区，用于DGGE分析。

反应体系采用50 μL的扩增体系，其中Premix Ex TaqTM Version2.0 25.0 μL，引物GC-Arc344F(10 pmol/μL)1.0 μL，引物Arc519R(10 pmol/μL)1.0 μL，DNA模板1.0 μL，加无菌ddH2O补充体积到
50 μL。

PCR条件为95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，56 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s。

34个循环，72 ℃延伸7 min，然后4 ℃保温，反应结束后取5 μL PCR产物用2%琼脂糖凝胶于130 V电泳23 min，然后通过凝胶成像系统观察PCR产物，并拍照记录。

1.3.4 实时荧光定量PCR 将已知浓度的产甲烷菌质粒DNA用双蒸灭菌水按1∶10 倍稀释8个梯度，每个梯度3个重复，同时作3个阴性对照，进行实时荧光定量PCR 反应。

采用引物GC-Arc344F和519R(表2)[12]，采用20 μL反应体系，其中10 pmol/μL的引物各0.5 μL，2×SYBR Green qPCR Supermix 10 μL，超纯水8 μL。

95 ℃预变性1 min，变性 15 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸25 s，循
环40次。

反应结束后，由溶解曲线判定PCR反应的特异性，根据荧光曲线的Ct
值以及标准曲线技术定量结果[13]。

堆肥样品中产甲烷菌拷贝数计算公式如下：
拷贝数(Copies/g)=
1.4 数据分析
试验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，多重比较采用邓肯极差检验法，显著水平P值设为0.05。

2.1 CH4排放总量
由图2可见，翻堆频率为4次/d(处理A)、2次/d(处理B)、1次/d(处理C)、1次
/3d(处理D)、1次/6d(处理E)和不翻堆(处理F)时，甲烷排放总量分别为28.60 L、50.07 L、70.85 L、76.48 L、90.74 L和59.33 L。

本试验中，甲烷排放量最高的
翻堆频率为1次/6d(E组)，最低的翻堆频率为4次/d(A组)。

与不翻堆相比，在高翻堆频率下(4次/d和2次/d)，甲烷的排放量减少，且随翻堆频率的增加而甲烷排放量降低。

2.2 CH4排放量随堆肥时间变化
如图3所示，各处理在堆肥初期甲烷排放量最大，这与很多学者的研究结果一致[6-7,14-15]。

随堆肥时间的延长，甲烷排放量基本呈逐渐下降的趋势，但B、C
组在9至11 d出现一个甲烷排放小高峰，可能与B、C组此时温度上升较快有关。

堆肥前12 d，各组甲烷排放量大小顺序为A<B<D<E<F<C，方差分析表明：堆
肥前12 d各组甲烷排放量差异不显著(P>0.05)。

但从堆肥第13 d至结束各组甲
烷排放量大小顺序为A<B<F<C<D<E，A组显著低于C、D、E组(P<0.05)，B
组显著低于D、E组(P<0.05)，F组显著低于D、E组(P<0.05)，C组显著低于D、E组(P<0.05)。

上述分析表明，翻堆对堆肥升温期甲烷的排放没有显著影响，但在堆肥高温期和降温期，高频翻堆会显著降低甲烷的排放，翻堆频率越低甲烷排放量越大。

2.3 翻堆前后CH4排放强度差异
图4是不同天数翻堆前后1 h内收集的气体中甲烷浓度的比较。

由图4知，各处
理翻堆后甲烷浓度均高于翻堆前，且翻堆频率较低(1次/3 d和1次/6 d)时，翻堆前后浓度差别最大。

说明翻堆会促进甲烷的挥发，翻堆后甲烷排放强度会增大，在翻堆频率较低时，翻堆后甲烷排放强度增加越多。

2.4 产甲烷菌多样性
堆肥过程中各组产甲烷菌多样性指数H′的变化见表3。

由表3可知，各组产甲烷
菌多样性指数H′的变化趋势基本一致，在堆肥开始时各组产甲烷菌多样性指数H′
为2.38～2.67之间，在堆肥中期由于堆体温度较高，产甲烷菌活性受到抑制，各
组产甲烷菌多样性指数H′明显下降，到堆肥后期，由于堆体温度的下降，各组产
甲烷菌多样性指数H′又开始升高。

在整个堆肥过程中，各组产甲烷菌多样性指数H′大小顺序为C<A<B<D<F<E。

方差分析表明：各组产甲烷菌多样性指数H′差异显著(P<0.05)；E组显著高于A、B、C、D组(P<0.05)，F组显著高于A、B、C组(P<0.05)，其它各组之间差异均不显著(P>0.05)。

上述分析表明，高翻堆频率会降低产甲烷菌的多样性，这也可
能是高翻堆频率降低甲烷排放总量的主要原因。

2.5 产甲烷菌总量
各组产甲烷菌拷贝数介于1.77×104～7.02×107copies/g DM之间(表6)。

且各
组产甲烷菌拷贝数随堆肥时间的变化规律基本一致，均表现为堆肥初始产甲烷菌含量最高，然后快速下降，在堆肥的6～12 d后，开始缓慢上升。

这可能是因为堆
肥初始，堆体内的产甲烷菌尚未适应堆体环境，产甲烷菌数量迅速下降，当适应之后，又受堆体温度的升高及堆体可利用碳源和氮源的限制，而缓慢增加。

整个堆肥过程中，各组产甲烷菌拷贝数对数值A组<B组<F组<C组<D组<E组，方差分
析表明：差异显著(P<0.05)。

A组显著低于其他各组(P<0.05)，B组显著低于C、D、E组(P<0.05)，F组显著低于E组(P<0.05)，其他各组差异不显著(P>0.05)。

说明在高翻堆频率下，翻堆可显著降低产甲烷菌的数量；而在低翻堆频率下，翻堆会增加产甲烷菌的数量。

这与高翻堆频率会减少CH4的排放，而低翻堆频率会增加CH4的排放的结果相一致。

本研究中，与不翻堆相比，高翻堆频率能减少甲烷的排放量，且随翻堆频率的增加而甲烷排放量降低，低翻堆频率增加了甲烷的排放。

这可能有以下两个原因：(1)
在高翻堆频率下，堆体内氧气浓度上升较快，堆体内大部分区域氧气浓度较高，抑制了甲烷的生成[5-7]。

低翻堆频率下堆体氧气浓度较低，堆体大部分区域处于厌
氧状态，适合产甲烷菌活动产生甲烷，而翻堆促进了甲烷的挥发，同时堆体内的甲烷能被甲烷氧化细菌氧化，而翻堆促进了甲烷的挥发，使被氧化的甲烷减少，从而促进甲烷的排放[4]。

(2)通过影响产甲烷菌多样性及总量来影响甲烷排放。

荧光定
量PCR研究表明，产甲烷菌数量的研究表明高翻堆频率可显著降低产甲烷菌的数量；而低翻堆频率会增加产甲烷菌的数量。

这与高翻堆频率会减少CH4的排放，而低翻堆频率会增加CH4的排放的结果相一致。

可能是因为翻堆频率越高，前期堆体温越快，越有利于堆体物料降解，且翻堆频率越高高温持续时间越长。

而高温期持续时间越长，对产甲烷菌活性的抑制作用也越强，导致高翻堆频率显著降低产甲烷菌的多样性指数和产甲烷菌的总量，从而降低了甲烷的排放。

同时高翻堆频率还促进了蛋鸡粪堆肥含水率的降低，而高含水率会降低堆体的通气性能，降低了堆体的烟囱效应，进一步导致了堆体内部氧气缺乏，从而导致低翻堆频率甲烷排放增加。

不同天数翻堆前后1 h内收集的气体中，各处理翻堆后甲烷浓度均高于翻堆前，且翻堆频率较低(1次/3 d和1次/6 d)时，翻堆前后浓度差别最大。

说明翻堆会促进甲烷的挥发，翻堆后甲烷排放强度会增大，在翻堆频率较低时，翻堆后甲烷排放强度增加越多。

这主要是因为翻堆促进了堆体内部气体的交换，使堆体内的甲烷大量挥发，导致翻堆后甲烷排放强度的短暂增大，而低翻堆频率时，堆体处于厌氧状态区域更大，堆体内蓄积的甲烷更多，因此翻堆后排放强度大幅增加。

在蛋鸡粪和锯末堆肥过程中，堆肥初期CH4排放量最大，翻堆对堆肥升温期CH4的排放没有显著影响，但在堆肥高温期和降温期，与不翻堆相比，高翻堆频率(4
次/d和2次/d)会减少CH4的排放，而低翻堆频率(1次/3 d和1次/6 d)会增加CH4的排放。

同时，高翻堆频率会显著降低产甲烷菌的多样性指数和产甲烷菌的
总量，而低翻堆频率显著增加了产甲烷菌的总量，这可能是导致在不同翻堆频率下，CH4排放量变化的重要原因。

综合不同时期翻堆对CH4排放量、堆肥进程以及成本的影响，2次/d可以降低甲烷的排放，为较合适的翻堆频率。

*[通讯作者]廖新俤(1968-)，男，福建人，教授，博士生导师，主要从事家畜废弃物管理、家畜营养生态与畜舍环境控制的研究。

E-mail:***************.cn 【相关文献】
[1]林而达,李玉娥.全球气候变化和温室气体清单编制方法[M].北京: 气象出版社,1998.
[2]Thompson A G,Wagner-Riddle C,Fleming R.Emissions of N2O and CH4 during the composting of liquid swine manure[J].Environmental Monitoring and
Assessment,2004,91(1/3): 87-104.
[3]Tao J,Schuchardt F,Guoxue L.Effect of turning and covering on greenhouse gas and ammonia emissions during the winter composting[J].Transactions of the
CSAE,2011,27(10):212-217.
[4]Mosier A,Kroeze C,Nevison C,et al.Closing the global N2O budget: Nitrous oxide emissions through the agricultural nitrogen cycle: OEDC/IPCC/IEA phase II development of IPCC guideline for national greenhouse gas methodology[J].Nutrient Cycling in Agroecosystems,1998,52(2-3):225-248.
[5]Steed J,Hashimoto A G.Methane emissions from typical manure management systems[J].Bioresource Technology,1994,50(2):123-130.
[6]Ahn H K,Mulbry W,White J W,et al.Pile mixing increases greenhouse gas emissions during composting of dairy manure[J].Bioresource Technology,2011,102(3):2 904-2 909.
[7]Park K H,Jeon J H,Jeon K H,et al.Low greenhouse gas emissions during composting of solid swine manure[C]∥ Animal Feed Science and Technology Special Issue: Greenhouse Gases in Animal Agriculture-Finding a Balance between Food and Emissions,2011,166-167:550-556.
[8]江滔,Schuchardt F,李国学.冬季堆肥中翻堆和覆盖对温室气体和氨气排放的影响[J].农业工程学报,2011,27(10):212-217.
[9]Szanto G L,Hamelers H M,Rulkens W H,et al.NH3,N2O and CH4 emissions during passively aerated composting of straw-rich pig manure[J].Bioresource
Technology,2007,98(14):2 659-2 670.
[10]Hao X,Chang C,Larney F J,et al.Greenhouse gas emissions during cattle feedlot manure composting[J].Journal of Environmental Quality,2001,30(2):376-386.
[11]Wright A,Pimm C.Improved strategy for presumptive identification of methanogens
using 16S riboprinting[J].Journal of Microbiological Methods,2003,55(2):337-349. [12]Zhou M,Hernandez-Sanabria E,Guan L L.Characterization of variation in rumen methanogenic communities under different dietary and host feed efficiency conditions,as determined by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis analysis[J].Applied and Environmental Microbiology,2010,76(12):3 776-3 786.
[13]Whelan J A,Russell N B,Whelan M A.A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR[J].Journal of Immunological Methods,2003,278(1-2):261-269. [14]Jiang T,Schuchardt F,Li G,et al.Effect of C/N ratio,aeration rate and moisture content on ammonia and greenhouse gas emission during the composting[J].Journal of Environmental Sciences-China,2011,23(10):1 754-1 760.
[15]Shen Y,Ren L,Li G,et al.Influence of aeration on CH4,N2O and NH3 emissions during aerobic composting of a chicken manure and high C/N waste mixture[J].Waste Management,2011,31(1):33-38.。