（完整版）高碘酸氧化和Smith降解

（完整版）⾼碘酸氧化和Smith降解
⾼碘酸氧化和Smith降解
原理：⾼碘酸氧化和Smith降解
⾼碘酸可选择性断裂糖分⼦中的邻⼆羟基或邻三羟基处,⽣成相应的多糖醛,甲醛或甲酸.反应定量进⾏,每开裂1个C—C键消耗1分⼦⾼碘酸.通过测定⾼碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置,直链多糖的聚合度,分⽀多糖的分⽀数等.Smith降解是将⾼碘酸氧化产物还原后酸⽔解,再鉴定⽔解产物,从⽽推断糖苷键的位置与分⽀点等.以葡萄糖为例,以1—2或1 —4位键合的糖基经⾼碘酸氧化,平均每个糖基消耗1分⼦⾼碘酸,且⽆甲酸释放;1—3位键合的糖基不被⾼碘酸氧化;1—6位键合的糖基或⾮还原末端糖基经⾼碘酸氧化,消耗2分⼦⾼碘酸同时释放1分⼦甲酸.
准备物品：
容量瓶（25ml * 2，50ml * 2；茶⾊为好）、锡纸、碱式滴定管、定量滤纸；
⾼碘酸钠、⼄⼆醇、溴甲酚(红)紫指⽰剂、0.005N NaOH(由0.1N NaOH稀释20倍制得，使⽤前⽤邻苯⼆甲酸氢钾标定)、NaBH4或KBH4、50% HAc、1M H2SO4、BaCO3、⼄醇。

实验步骤：
（1）准确配置30mM NaIO4 50ml （320.8mg NaIO4，定容⾄50ml），⽤锡纸包好避光，取0.1ml稀释⾄25ml，223nm处测定吸光值⼤于0.6⽅可使⽤。

（注：此溶液必须现⽤现配。

）（2）准确称取糖样50mg（记录下准确质量），⽤少量⽔溶解于50ml容量瓶中，然后加⼊30 mM NaIO425ml，蒸馏⽔定容，使NaIO4终浓度为15mM。

⽤锡纸包好避光，放置在低温暗处反应，间隔时间(0、6、12、24、36、48、60……⼩时)取样0.1ml，⽤蒸馏⽔稀释250倍，以蒸馏⽔作空⽩对照，在223nm波长处测光密度值，直到光密度值恒定为⽌。

（3）同时将剩余的30mM NaIO4稀释为15mM，与反应样品同样放置作为对照，待反应结束时取出0.1ml，稀释250倍后，⽤蒸馏⽔按不同⽐例稀释，每浓度三个重复，测定223nm处的
（4）通过查标准曲线，计算出⾼碘酸的消耗量。

消耗⾼碘酸的量（mmol）=(反应前⾼碘酸浓度-反应后⾼碘酸浓度)*反应体积
（5）取2ml上述氧化液，加1滴溴甲酚(红)紫作指⽰剂，⽤0.005N NaOH溶液滴定，计算得甲酸⽣成量。

甲酸⽣成量（mmol）=（NaOH的准确浓度*滴定⽤的体积/2ml）*反应体积（6）加⼄⼆醇终⽌⾼碘酸氧化反应。

流⽔及蒸馏⽔各透析24⼩时。

浓缩⾄10ml，加⼊KBH4 70mg 还原过夜。

⽤50% ⼄酸中和⾄pH为6 7，流⽔及蒸馏⽔各透析24⼩时。

取1/3⼲燥后做完全酸⽔解和GC分析，剩余部分进⾏Smith降解。

（2）加⼊等体积的1M H2SO4，25℃⽔解40⼩时，BaCO3中和⾄pH为6，⽤定量滤纸过滤，滤液⽤蒸馏⽔透析8⼩时，袋外部分⼲燥做GC分析，滤液再⽤流⽔蒸馏⽔各透析24⼩时，袋内部分⽔浴浓缩到适当体积，加⼄醇醇析，离⼼，上清及沉淀部分⼲燥后分别做完全酸⽔解和GC分析。

⾼碘酸氧化、Smith降解
实验原理：
⾼碘酸氧化和Smith降解：
⾼碘酸可选择性断裂糖分⼦中的邻⼆羟基或邻三羟基处,⽣成相应的多糖醛,甲醛或甲酸.反应定量进⾏,每开裂1个C—C键消耗1分⼦⾼碘酸.通过测定⾼碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置,直链多糖的聚合度,分⽀多糖的分⽀数等.Smith降解是将⾼碘酸氧化产物还原后酸⽔解,再鉴定⽔解产物,从⽽推断糖苷键的位置与分⽀点等.以葡萄糖为例,以1—2或1 —4位键合的糖基经⾼碘酸氧化,平均每个糖基消耗1分⼦⾼碘酸,且⽆甲酸释放;1—3位键合的糖基不被⾼碘酸氧化;1—6位键合的糖基或⾮还原末端糖基经⾼碘酸氧化,消耗2分⼦⾼碘酸同时释放1分⼦甲酸.。

⾼碘酸氧化是⼀种选择性的氧化反应，它只能作⽤于多糖分⼦中连⼆羟基或连三羟基处。

当连⼆羟基的C-C键被氧化断开后，产⽣相应的醛；当连三羟基的C-C键被氧化断开后，产⽣甲酸及相应的醛。

此反应定量进⾏，每断开1molC-C键，消耗1mol⾼碘酸，每⽣成1 mol 甲酸对应消耗2mol⾼碘酸。

因此，通过测定⾼碘酸消耗量及甲酸⽣成量，便可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及⽀链多糖的分⽀数⽬等。

⾼碘酸氧化产物经硼氢化钾还原，得到的多糖醇⽤稀酸在温和条件下⽔解，可发⽣特异性降解，称为Smith降解。

Smith降解的特点是只打断被⾼碘酸破坏的糖苷键，⽽未被⾼碘酸氧化的糖残基仍连在糖链上。

这样，多糖醇经Smith降解，就可以得到
⼩分⼦的多元醇和未被破坏的多糖或寡糖⽚断，对这些产物进⾏分析，便可以推断出糖苷键的键型及其位置。

下⾯以各种键型连接的葡聚糖为例，反应式如下：
以1→2或1→2,6位糖苷键连接的葡聚糖反应式：
O
O... OHC
CH2OH
O...
O
O...
O...
CH2OH
HOH2C
4
CH2OH
CHOH
CH2OH
H+
2
CH2OH
以1→或1→6位糖苷键连接的葡聚糖反应式：
O OH
OH CH 2O...
O...
4
H +
OH
O CH 2OH
O...
H O
H 2C O CH 2OH
O...＋IO 4-
CHO
+
HCOOH
CH2OH
⽢油⼄⼆醇
以1→4或1→4,6位糖苷键连接的葡聚糖反应式：
O O...
OH CH 2OH
O...
4
H +
OH
CHO OHC O CH 2OH
O...
O...H
O
H
2C
H
O H 2C O
CH 2OH
O...
O...
⾚鲜醇
＋⼄⼆醇
IO 4-
以1→3、1→3,6、1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→2,3,4位糖苷键连接的葡聚糖反应式：
4
H +
O OH
OH
CH 2OH
OH
OH
由此可见：
（1）1mol 1→或1→6位糖苷键连接的葡聚糖被⾼碘酸氧化时消耗2 mol ⾼碘酸，⽣成1 mol 甲酸；
（2）1mol 1→2或1→2,6、1→4、1→4,6位糖苷键连接的葡聚糖被⾼碘酸氧化时只消耗⾼碘酸，不⽣成甲酸；
（3）不被⾼碘酸氧化的⼰糖残基糖苷键型为：1→3、1→3,6、1→2,3、1→2,4、1→3,4、1→2,3,4；
（4）产⽣⽢油的⼰糖残基糖苷键型为：1→、1→6、1→2、1→2,6；（5）产⽣⾚藓醇的⼰糖残基糖苷键型为：1→4、1→4,6；参考⽂献。