铁筷子醇提物对大鼠佐剂性关节炎作用及机制研究-李梦

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第19卷 第3期 2017 年 3 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 19 No. 3 Mar .，2017
类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是
一种全身性自身免疫性疾病[1]
，其主要特征为关节的肿胀、疼痛和功能障碍，病因尚不明确，病情反复发作，给患者的身心健康带来了巨大的伤害。

目前，RA 仍属一种难治性疾病，不合理用药率较高。

传统医药治疗本病具有疗效稳定、副作用小等特点，日益被人们所关注。

铁筷子（Chimonanthus praecox ）是腊梅科腊梅属（Chimonanthus ）植物腊梅[Chimonanthus praecox （L.）Link.]及山腊梅（Chimonanthus nitens Oliv.）的根，性辛味温，具有镇痛、理气、活血及化瘀的功效，临床上主要用来治疗风湿痹痛、跌打损伤肿痛、脘腹疼痛等[2]，是苗族人民用于治疗类风湿性关节炎的常用药物，具有长期的使用历史。

前期药理实验中已经证实，铁筷子醇提物具有抗炎镇痛作用，但其能否用于自身免疫性疾病如RA 的治疗鲜有报道。

佐剂性关节炎模型（Adjuvant Arthritis，AA）是评价防治RA 药物的常用
动物模型之一，其发病机理、病变部位和病变性质都
与人RA 相似。

本研究通过观察铁筷子醇提物对AA 大鼠的治疗作用，以及对AA 大鼠血清中TNF-α和PAF 含量的影响，探讨其作用机制，旨在为开发治疗RA 的有效药物提供实验依据。

1 材料与仪器1.1 实验动物
SPF 级SD 大鼠72只，雌雄各半，体重（200±20）g，由中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供（动物合格证书编号：2012-0003）。

1.2 药品与试剂
铁筷子，采自贵阳市乌当区三江镇农场，经贵阳中医学院药学院生药教研室鉴定为腊梅科腊梅属植物腊梅的根。

采集来的铁筷子水洗弃其杂物后，晒干，打成粗粉，用酒精浸泡17 h，78%乙醇热回流提取，减压浓缩，蒸干得浸膏。

雷公藤片，福建汇天生物药业有限公司。

灭活卡介苗（BCG）10 mg/mL，
铁筷子醇提物对大鼠佐剂性关节炎作用及机制研究
李梦，李亚烽，钱海兵
（贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002）
摘 要：
目的：观察苗药铁筷子醇提物对佐剂性关节炎模型（AA）大鼠的作用，并探讨其作用机制。

方法：建立大鼠佐剂性关节炎模型，观察AA 大鼠的一般情况、足肿胀情况，计算免疫器官系数；采用酶联免疫法测定大鼠血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血小板活化因子（PAF）的含量。

结果：与模型组比较，铁筷子醇提物能够改善AA 大鼠的一般情况，抑制大鼠足肿胀，对免疫器官没有明显影响；可明显降低AA 大鼠血清中TNF-α、PAF 的含量。

结论：铁筷子醇提物对佐剂性关节炎大鼠具有一定的治疗作用，其作用机制可能与降低TNF-α、PAF 的水平有关。

关键词：铁筷子；醇提物；佐剂性关节炎；肿瘤坏死因子-α；血小板活化因子
中图分类号：R684.3 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2017) 03- 0019- 03
收稿日期：2016-08-09
基金项目：贵州省科技厅联合基金项目（黔科合中药字[2012]LKZ7030）；贵阳市科技计划项目（筑科合同[2011204]22号）作者简介：李梦（1991-），女，江西抚州人，硕士研究生，研究方向：中药及民族药效物质基础及作用机制研究。

通讯作者：钱海兵（1977-），男，河南卫辉人，教授，博士，研究方向：中药及民族药效物质基础及作用机制研究。

Effects of Alcohol Extract from Chimonanthus Praecox on
Adjuvant Arthritis Rats and Their Mechanisms
LI Meng，LI Yafeng，QIAN Haibing
（Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，Guizhou，China）
Abstract：Objective ：To study the effects of alcohol extract from Chimonanthus praecox on adjuvant
arthritis rats and their mechanism. Methods ：To establish the adjuvant arthritis model in rats，and then to observe the paw swelling，calculate coefficient of immune organs and detect the levels of TNF-α，PAF in the serum of AA rats by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）. Results ：The alcohol extract from Chimonanthus praecox could improve the general situation，effectively inhibit the articular swelling of AA rats and the levels of TNF-α and PAF in the serum were decreased significantly，but it had no significant effects on the immune organs，compared with model group. Conclusion ：The alcohol extract from Chimonanthus praecox had certain therapeutic effects on adjuvant arthritis rats，and its mechanism might be related to the reduction of the levels of TNF-α，PAF.
Keywords：Chimonanthus praecox ；alcohol extract；adjuvant arthritis；tumor necrosis factor α；platelet activating factor
DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2017.03.005
辽宁中医药大学学报19卷
中国卫生部上海生物制品研究所。

ELISA试剂盒，海蓝基生物科技有限公司。

免疫组化抗体由Santa Cruz公司提供。

1.3仪器
游标卡尺0~150 mm，台州市航宇工量刃具有限公司；电子分析天平FA1004A，上海精宏试验设备有限公司；电动匀浆机S25，德国IKA。

2 方法
2.1完全弗氏佐剂（CFA）及AA大鼠模型的制备
取高压灭菌后的石蜡油和羊毛脂按3∶1的体积比例混合，在碎冰上边匀浆边加入卡介苗，制备成含卡介苗10 mg/mL的完全弗氏佐剂，于大鼠左足跖皮内注射，复制成AA大鼠模型。

在致炎的10 d后，以致炎大鼠对侧足掌是否出现肉眼可观察到的肿胀，结合千分尺测得的足掌厚度为标准，确定造模是否成功。

2.2动物分组及给药
取72只健康SD大鼠，随机分为6个组，即空白组，模型组，雷公藤组（31.5 mg/kg），铁筷子醇提物高、中、低剂量组（生药量为7.0、3.5、1.75 g/kg）。

于造模成功的第2天开始灌胃，每天1次，连续给药30 d，给药体积为10 mL/kg。

2.3指标的检测
2.3.1 一般情况的观察
观察各组大鼠的精神、皮毛光泽程度、关节活动、进食量、体重增长等情况。

考察铁筷子醇提物对AA大鼠一般情况的影响。

2.3.2 后足掌厚度的测量
在第1、5、10、15、20、25、30、35、40天，用精密至0.02 mm的游标卡尺测量大鼠后足掌的厚度，每只大鼠的脚掌厚度以左右两只后脚掌厚度的平均数表示[3]。

考察各造模组大鼠在足掌注射完全弗氏佐剂后，足掌厚度的改变情况，以确定造模是否成功，进而考察铁筷子醇提物对各给药组AA大鼠足掌厚度的影响。

2.3.3 脏器系数
处死大鼠后取大鼠脾脏、胸腺和肾上腺，分别于分析天平上称重，并根据公式：脏器系数=脏器重（g）/大鼠体重（g）来计算大鼠脏器系数。

考察铁筷子醇提物对各给药组AA大鼠免疫器官脏器系数的影响。

2.3.4 血清中TNF-α、PAF测定
末次灌胃24 h后股动脉取血，分离血清。

依据ELISA试剂盒说明书检测TNF-α、PAF的含量。

2.3.5 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件处理实验数据，计量资料采用均数±标准差（x—±s）表示，P<0.05表示有统计学意义，P<0.01表示有显著性差异。

3 结果与分析
3.1一般情况的观察
空白组大鼠状态良好，未发现明显异常表现。

模型组大鼠左后足掌在致炎后逐渐开始肿胀，并于第3 h左右达到高峰，持续3 d后逐渐消退，于第8~10天后出现继发性免疫炎症，致炎对侧足掌出现肿胀，耳部及尾部出现结节，同时伴有精神萎靡、活动量减少、毛发发黄、摄食减少、体质量增长减慢等
现象。

给予铁筷子醇提物治疗后，上述症状皆有一定的好转。

3.2铁筷子醇提物对AA大鼠足肿胀的影响
实验结果显示铁筷子醇提物可以抑制AA大鼠的足肿胀，在大鼠CFA注射足掌后，大鼠致炎对侧足掌厚度增加，造模各组与空白组足掌厚度比较，具有差异性（P<0.05），表示AA模型复制成功。

铁筷子醇提物高、中、低剂量组在不同的时间段均有一定抑制AA大鼠足肿胀的作用，其中高剂量组和中剂量组作用明显，与模型组比较具有统计学意义（P<0.05），结果见表1。

表1 铁筷子醇提物对AA大鼠足掌厚度的影响（n=12，x—±s）组别
剂量
（mg/kg）
足掌厚度（mm）
1 d10 d20 d30 d40 d
空白组- 5.05±0.06 5.11±0.11 5.25±0.04 5.27±0.03 5.30±0.03模型组- 5.07±0.05 6.97±0.08*9.68±0.09*9.09±0.08*8.32±0.05*高剂量组664 5.01±0.13 6.98±0.067.79±0.06#7.66±0.08#7.31±0.08#中剂量组332 5.13±0.09 6.94±0.107.81±0.05#7.72±0.07#7.30±0.14#低剂量组166 4.98±0.12 6.99±0.067.92±0.077.82±0.057.66±0.05雷公藤组31.5 5.07±0.087.07±0.047.80±0.09#7.53±0.11#7.20±0.12#注：模型组与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3.3铁筷子醇提物对AA大鼠免疫器官脏器系数的影响
实验结果显示铁筷子醇提物对AA大鼠的免疫器官没有明显抑制作用，模型组AA大鼠脾脏、胸腺、肾上腺系数与空白组比较有差异（P<0.05），铁筷子醇提物各剂量组的脏器系数与模型组比较没有明显差异（P>0.05），雷公藤组脏器系数与模型组相比有差异（P<0.05），结果见表2。

表2 铁筷子醇提物对AA大鼠脏器
系数的影响（%，n=12，x—±s）
组别
剂量
（mg/kg）
脾脏系数胸腺系数肾上腺系数 空白组- 0.15±0.020 0.080±0.010 0.0150±0.0010
模型组- 0.24±0.019* 0.140±0.012* 0.0201±0.0014*
高剂量组6640.233±0.020 0.130±0.021 0.0198±0.0024
中剂量组3320.224±0.022 0.136±0.020 0.0209±0.0017
低剂量组1660.230±0.028 0.132±0.017 0.0203±0.0013
雷公藤组31.5 0.17±0.013# 0.094±0.015# 0.0172±0.0024#注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3.4铁筷子醇提物对AA大鼠血清TNF-α及PAF浓度的影响
实验结果显示铁筷子醇提物能够降低AA大鼠血清中TNF-α及PAF的浓度，模型组与空白组比较，血清中的TNF-α及PAF表达升高（P<0.05）；铁筷子醇提物各剂量组均可以降低血清中TNF-α及PAF表达，其中铁筷子醇提物高、中剂量组与模型组比较具有统计学意义（P<0.05），结果见表3。

表3 铁筷子醇提物对AA大鼠TNF-α、PAF
浓度的影响（TNF-α：n=12，PAF：n=6，x—±s）组别
剂量
（mg/kg）
TNF-α浓度
（ng/L）
雄鼠PAF浓度
（ng/L）
雌鼠PAF浓度
（ng/L）空白组-23.46±7.672987.72±89.11 841.60±12.91
模型组-56.99±14.14*4301.14±54.32*1821.12±28.83**
高剂量组66434.47±6.73#3275.54±51.02# 1087.7±26.17#
中剂量组33238.33±7.84#3520.06±111.70#1225.29±29.35#
低剂量组16647.60±13.414086.67±102.061394.45±13.90
雷公藤组31.529.55±11.31#3253.37±67.72#1084.09±16.21#注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

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19卷辽宁中医药大学学报
4 讨论
免疫功能异常、关节滑膜炎症、关节软骨及骨破坏是RA三大病理环节[4]。

RA滑膜的炎症反应涉及多种细胞因子，其中肿瘤因子-α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）被认为是关节疾病病理过程中促进软骨基质的破坏及功能退化最重要的细胞因子之一[5]。

TNF-α是一种单核因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，作为主要促炎细胞因子，它可以与多种类的组织因子和基质蛋白相互交互，使RA关节滑膜细胞增殖，诱导刺激滑膜细胞产生炎症因子、蛋白激酶及前列腺素E[6-7]，促进血管翳形成，直接损害组织，导致软骨和骨破坏[8]。

目前阻断TNF-α的生物制剂广泛应用于临床，TNF-α拮抗剂不仅能够有效、迅速地控制炎症反应，且能停止甚至修复已经损坏了的关节。

血小板活化因子（Platelet activating factor，PAF）是血小板活化后释放的一种炎症介质[9]，具有释放氧自由基等物质、促使中性粒细胞游走的作用，被认为是 RA滑膜持续性病变一个重要因素[10]。

有研究表明[11]，PAF可促进TNF、IL-2、IL-6的合成和释放，参与前列腺素和白三烯的合成，在转录水平上调C0X-2的表达，还可通过刺激RA滑膜细胞和软骨细胞，减少胶原蛋白和蛋白多糖合成，增加糖蛋白降解，加重炎症反应，损害骨质。

另外，研究发现[12]RA患者疾病活动期关节的滑液中存在着活性的PAF，且PAF 水平明显高于健康人群，证明PAF和RA疾病发展有一定的相关性。

本研究结果显示，铁筷子醇提物可改善AA大鼠一般情况，且可明显抑制大鼠关节肿胀，表明其具有减轻AA大鼠局部组织水肿、减缓病程进展的作用。

但其对免疫器官的影响并不明显，表明铁筷子醇提物抗AA大鼠的作用机制可能与调节免疫无关；铁筷子醇提物治疗组与模型组相比较，大鼠血清中TNF-α以及PAF水平明显降低。

因此推测，铁筷子醇提物治疗RA的机制之一可能是通过降低TNF-α、PAF水平，控制滑膜炎症的发生，从而减轻关节软骨及骨的损坏。

综上所述，苗药铁筷子醇提物对类风湿性关节炎具有良好疗效，这为其治疗类风湿性关节炎的临床应用提供了实验依据[13-15]。

◆
参考文献
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2015，17 ( 12 )：5.
外痔的诊断依据、证候分类、疗效评定
——中华人民共和国中医药行业标准《中医内科病证诊断疗效标准》（ZY/T001.1-94）
外痔系发生于齿线以下的静脉曲张团块或赘皮。

1 诊断依据
（1）肛缘皮肤损伤或感染，呈红肿或破溃成脓，疼痛明显。

多见于炎性外痔。

（2）肛缘皮下突发青紫色肿块，局部皮肤水肿，肿块初起尚软，疼痛剧烈，渐变硬，可活动，触痛明显。

多见于血栓性外痔。

（3）排便时或久蹲，肛缘皮有柔软青紫色团块隆起（静脉曲张团），可伴有坠胀感，团块按压后可消失。

多见于静脉曲张性外痔。

2 证候分类
（1）气滞血瘀：肛缘肿物突起，排便时可增大，有异物感，可有胀痛或坠痛，局部可触及硬性结节。

舌紫，苔淡黄，脉弦涩。

（2）湿热下注：肛缘肿物隆起，灼热疼痛或有滋水，便干或溏。

舌红，苔黄腻，脉滑数。

（3）脾虚气陷：肛缘肿物隆起，肛门坠胀，似有便意，神疲乏力，纳少便溏。

舌淡胖，苔薄白，脉细无力。

多见于经产妇、老弱体虚者。

3 疗效评定
（1）治愈：症状消失，痔消失。

（2）好转：症状改善，痔缩小。

（3）未愈：症状及体征均无变化。

21。