黑龙江省番茄白粉病病原鉴定

黑龙江省番茄白粉病病原鉴定
李帅;朱路路;李景富;许向阳;姜景彬
【摘要】通过收集东北农业大学日光温室中的番茄白粉菌,并对其进行形态和分子鉴定及分析,明确了该白粉病的病原种类及其分类地位.根据分生孢子的显微形态观察初步确定为新番茄粉孢菌(Oidium neolycopersiciL.Kiss).进一步根据真菌rDNA-ITS序列检测分析后发现该病原菌与新番茄粉孢菌(O.neolycopersici)的相似性为100％,并对与其相似性较高的序列构建进化树分析发现,本试验研究的白粉菌与其他国家和地区的白粉菌相似性不高,这可能是由于哈尔滨地区白粉菌自身小种进化的原因.
【期刊名称】《植物保护》
【年(卷),期】2014(040)004
【总页数】4页(P112-114,129)
【关键词】新番茄粉孢菌;形态特征;ITS;进化树
【作者】李帅;朱路路;李景富;许向阳;姜景彬
【作者单位】东北农业大学园艺学院蔬菜系,哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院蔬菜系,哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院蔬菜系,哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院蔬菜系,哈尔滨150030;东北农业大学园艺学院蔬菜系,哈尔滨150030
【正文语种】中文
【中图分类】S482.2
1986年，在荷兰发现由番茄粉孢菌(Oidium lycopersici)引起的番茄白粉病[1]，
随后科研人员相继报道了番茄白粉病在世界范围内的蔓延[2-5]，白粉病成为严重
威胁番茄生产的全球性病害。

1990年，贾菊生报道新疆发生番茄白粉病，经鉴定病原菌无性世代为Oidiopsis taurica Salmon，有性世代为鞑靼内丝白粉菌[Leveillula taurica (Lev.) Arn.][6]。

黑龙江[7]、辽宁[8]、河南[9]、吉林[10]等地也有番茄白粉病的相关报道。

我国已经报道能够引起番茄白粉病的病原菌主要有蓼白粉菌(Erysiphe polygoni DC)[7]、鞑靼内丝白粉菌[8]和新番茄粉孢菌(Oidium neolycopersici L. Kiss)[9-10]引发。

本试验利用形态学和分子生物学方法，对东
北农业大学日光温室中白粉菌进行鉴定分析，明确该病原菌的种类及其分类地位，同时对哈尔滨地区白粉病病原菌进行鉴定以及对不同国家和地区的白粉病病菌生理小种进行进化树分析，为白粉病的防治提供依据。

1.1 病原菌采集、纯化及保存
2011年9月在东北农业大学园艺实验站日光温室的番茄(‘东农706’)叶片上采
集白粉病病原菌。

病原菌纯化采用单孢直接挑取分离法[11]。

挑取的单孢接种在番茄(‘Moneymaker’)幼苗上，置于光照培养箱(上海博迅SPX-250B-G)中培养，光周期L∥D=16 h∥8 h，温度20～25 ℃，相对湿度80%。

病原菌保存方法：将已发病叶片置于健康四叶期番茄幼苗上方，轻轻拍打叶柄部位，使粉状物落在新叶片上完成接种，被接种叶片一般在接种后1周左右开始出现病
症[12]。

1.2 番茄白粉病的症状及病原菌形态特征观察
观察番茄植株发病症状，包括病斑颜色、大小和形状。

对病原菌形态进行观察，包括菌丝形态和结构、分生孢子形态和萌发方式、分生孢子梗形态以及是否产生闭囊壳等。

参考柴荣耀等的方法[11]进行病原菌种类的鉴定，使用AMG显微照相记录病原菌特征。

1.3 病原菌基因组DNA的提取、核糖体DNA的ITS区扩增及序列分析
将采自东北农业大学日光温室的病原菌编号为Htpm1。

试验选取3株发病植株的叶片，用盖玻片从发病叶片上分别刮取至少100 mg病菌混合物，液氮充分研磨，使用北京康为世纪公司细菌基因组提取试剂盒(Bacteria Gen DNA Kit)提取病原菌基因组DNA，-20 ℃保存。

引物ITS4、ITS5、ITS6[12]，其中ITS5-ITS6组合用于初始 PCR，ITS4-ITS5组合进行半巢式PCR扩增，引物由华大基因公司合成,引物序列见表1。

PCR 反应体系(25 μL): Taq-PCR reaction mixture(15 μL)包括1.5 mmol/L MgCl2，800 μmol/L dNTPs，2.5U Taq DNA polymerase(Taq PCR Master Mix Kit; Qiagen, Tokyo, Japan)，以及0.2 μmol/L 引物各1 μL，模板DNA 1
μL，无菌蒸馏水7 μL。

初始 PCR 反应程序：95 ℃ 预变性2 min；95 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸2 min。

半巢式PCR使用1 μL
初始PCR产物作为模板，PCR程序同上，退火温度调整为60 ℃。

PCR产物4 ℃保存。

将3个 PCR 产物纯化后送至华大基因(BGI)有限公司进行2次重复测序。

将测得
的序列在GenBank中进行BLAST分析，利用MEGA4.0软件进行进化树分析。

2.1 番茄白粉病症状
番茄白粉病多发于叶片、叶柄部位，病菌主要从下部叶片逐渐扩展到上部新生叶片。

观察发现菌斑仅在叶片上表面形成。

发病初期(图1a)，叶片上表面有白色粉状霉点，叶片发病部位出现褪绿点。

粉状霉点是病原菌的菌丝、分生孢子梗及分生孢子，起初分布稀疏，随后逐渐融合在一起，增厚，形成不规则形状并覆盖大面积叶片。

发病后期(图1b)病叶变为褐色，逐渐枯萎皱缩，但不脱落。

2.2 番茄白粉菌形态特征
分生孢子椭圆或圆柱形，无色，透明，平均32.2 μm×17.3 μm(n=150) (图2a)。

分生孢子单生于分生孢子梗顶端，分生孢子梗直立(图2b)，无分支，透明，平均71.5 μm×6.21 μm(n=100)。

脚胞通常有1～2个细胞。

菌丝上形成浅裂叶片形状的附着胞(图2c)，芽管在分生孢子两端或近端处萌发，末端形成附着胞，附着胞
多为乳突形 (图2d)。

未发现有闭囊壳。

观察结果与Kiss所述相吻合[3]，因此鉴
定该病原菌为新番茄粉孢菌(Oidium neolycopersici L. Kiss)。

2.3 番茄白粉菌核糖体DNA的ITS区扩增及序列分析
对提取的番茄白粉菌DNA的ITS区进行PCR扩增，所得片段长度为687 bp，GenBank登录号为JQ972700。

BLAST分析表明与新番茄粉孢菌
(O.neolycopersici)相似性为100%，进一步证明该菌为新番茄粉孢菌。

将得到的ITS序列与NCBI上相似性较高的序列进行比对，采用MEGA4.0软件进行聚类分析,检测方法用自展法(Bootstrap)。

分析结果如图3所示，所有序列分为几个大支，我国台湾地区、西班牙和我国哈尔滨地区的白粉病菌分别单独为一支，可能是其自身小种进化的原因。

匈牙利、美国和英国番茄白粉菌的相似性极高，法国、韩国、中国河南地区、荷兰、日本和中国辽宁地区的番茄白粉菌相似性也极高。

这种差异说明地域的不同并非是白粉菌生理小种变异的直接原因。

白粉病一直是番茄育种和生产中的主要病害之一，高温高湿是适宜白粉菌生长的条件，不同的生态地理环境容易引发白粉菌生理小种的变异[13-15]。

Kiss报道引起
番茄白粉病的病原菌有两个种，即番茄粉孢菌(O.lycopersici)和新番茄粉孢菌(O.neolycopersici)，但至今未发现该菌的有性世代[3]。

国内有关番茄白粉病的研究多见于发生情况和病原鉴定[10]，黑龙江省未有新番茄粉孢菌引起番茄白粉病的相关报道，本研究首先对东北农业大学日光温室的白粉菌进行形态观察，初步鉴定结果显示引起哈尔滨地区番茄白粉病的病原菌为新番茄粉孢菌，进一步利用真菌rDNA-ITS序列的保守性对采自哈尔滨的番茄白粉病病菌进行PCR扩增检测分析，
从分子水平上验证了此菌为新番茄粉孢菌。

通过构建进化树发现，哈尔滨与国内其他地区以及国外的白粉菌均有差异，但差异很小，法国、荷兰、匈牙利、日本、韩国、法国等国家番茄白粉菌的相似性极高，种间差异很小，这说明地域差异并不是白粉菌生理小种产生差异的直接原因，可能与其自身分化有关。

本试验从形态和分子两方面对番茄白粉菌进行观察鉴定，并对相似性高的序列进行系统进化分析，以期对番茄白粉病菌有更深入的了解，并为番茄白粉病的防治提供重要的理论依据。

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