犬化脓性链球菌感染创伤模型的建立与分析

2019年第9期 吉林畜牧兽医·实验研究·
ShiYan YanJiu
犬化脓性链球菌感染创伤模型的建立与分析
曲 歌1,2, 杨 婷2, 尹柏双2
1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118；2吉林农业科技学院动物科技学院, 吉林
吉林市 132101
摘 要：通过对犬化脓性链球菌感染创伤模型的建立，为犬皮肤创伤化脓性链球菌感染治疗研究提供基础。

18只试验犬，分为3组，犬臀部皮肤分别以刺刮创口菌液淋浇、刀刮直线形创伤菌液淋浇和刀刮月牙形创口菌液注射三种方法进行建模。

结果表明，刀刮月牙形创口菌液注射法建模成功率达83.33%，刀刮直线形创伤菌液淋浇建模成功率达33.33%，刺刮创口菌液淋浇建模成功率达16.67%。

结果提示，刀刮月牙形创口菌液注射法为最佳的犬化脓性链球菌感染创伤造模方法。

关键词：犬；化脓链球菌；感染；模型；建立
皮肤是动物抵抗外来伤害的第一道屏障，具有调节体温、呼吸、分泌、排泄等功能[1，2]。

创伤是由于在机械性因素作用下，引起皮肤有创口的开放性损伤；感染是指动物有机体与侵入体内的致病性微生物相互作用所产生的局部和全身反应[3]。

当皮肤受到创伤时，致病菌侵入表皮、真皮、皮下组织引起的炎症反应[4]，造成化脓感染，导致皮肤创伤延期愈合或不能愈合。

感染得不到及时有效的治疗而引发多种并发症，甚至是休克。

目前，国内外研究者在遵守动物福利与保护法的前提下实施动物麻醉，采用损伤动物皮肤的方式建立创伤模型[5，6]。

化脓性链球菌是引起犬皮肤创伤感染的主要病原菌之一，临床上常用抗生素及多种抗炎类药物对皮肤创伤的感染进行治疗，但感染菌类不同采取的治疗性用药应有所差别。

为此，本试验通过对犬化脓性链球菌感染创伤模型的建立，为开展犬皮肤创伤化脓性链球菌感染治疗药物筛选的研究提供模型动物。

1 材料
1.1 实验动物
试验犬18只，年龄2～3岁之间，体重10±2 kg，雌雄兼备。

由吉林农业科技学院提供。

试验犬在20～25 ℃条件下的饲养室内饲养，采食同一犬粮、不限饮水，饲养2周后进行试验。

1.2 主要仪器
离心机、恒温培养箱（美国，THERMO公司），显微镜（日本奥林巴斯株式会社），手术台（泰州博宇润兽用器械公司），电子天平（上海精密仪器仪表有限公司），全自动高温高压灭菌锅（上海申安医疗器械厂）等。

1.3 主要试剂及药品
硫酸阿托品购于山东海河动物药业有限公司，舒泰-50购于法国维克公司，化脓性链球菌菌株HSC5购于ATCC公司，Todd-Hewitt培养基、脱脂绵羊血和琼脂糖购于上海生物工程有限公司。

2 方法
2.1 化脓性链球菌培养
将保存于-80 ℃的化脓性链球菌菌株取出，使用含有0.2%酵母提取物和100 μL的脱脂绵羊血的Todd-Hewitt培养基，在37 ℃并且没有震荡及搅拌的情况下培养18 h，对菌株进行复苏。

使用1.8%的液体培养基在37 ℃下震荡过夜，对菌种进行活化。

在含有1.4%细菌培养琼脂的固体培养基上37 ℃过夜培养，挑取生长好的菌板进行CFU计算。

2.2 模型建构
2.2.1 实验动物准备：建模前试验犬禁食12 h，肌注硫酸阿托品0.01 mg/kg，10 min后肌注舒泰0.06 mL/kg实施麻醉，并于后臀部进行术部消毒。

2.2.2 建模方法：试验采用以下三种建模方法。

第一种：1～6号犬的后臀部使用针将犬皮肤进行刺刮，造成1 cm×1.5 cm的伤口，将5 μL
含有1×106 CFU 化脓性链球菌的 PBS 液混匀后淋浇于创面之上。

第二种：7～12号犬的臀部用手术刀刮出1 cm×1.5 cm 的伤口至渗血，将5 μL 含有1×106 CFU 化脓性链球菌的PBS 液混匀后淋浇于创面之上。

第三种：13～18号犬臀部用手术刀切开1 cm×1.5 cm 长月牙形切口后，深入真皮层，渗血后将5 μL 含有1×106 CFU 化脓性链球菌的PBS 液混匀进行创口皮下注射感染。

造模后用无菌创巾将实验犬创口覆盖，防止其他细菌的感染。

颈部使用充气型伊丽莎白项圈固定，防止抓、咬创口，放于20～25 ℃的无菌饲养室内饲养。

2.3 模型评估
2.3.1 表象观察：参考国家卫生部医改司医院感染检测小组制订的医院感染诊断标准
[7]
，以
伤口出现红肿热痛伴有脓液渗出即为造模成功。

2.3.2 创液涂片镜检：在感染24 h 后挑取创液涂片，进行瑞氏染色镜检观察，具体方法参照文献报道
[8]。

2.3.3 创液培养鉴定：将脓性创液进行细菌培养，挑取菌落，革兰氏染色鉴定。

3 结果与分析
3.1 创伤感染鉴定结果
结果见图1、2所示，瑞氏染色发现创液中
有大量的白细胞，白细胞中间有大量分布成团的革兰氏阳性菌；脓性创液培养后在培养基中生长大量菌落，菌落经瑞氏染色镜检确定为化脓性链
球菌。

图1 创液革兰氏镜检结果
图2 脓性创液培养结果
3.2 创伤建模结果
结果见表1所示，第一组6只试验犬在感染48 h 之后，1只犬创面红肿、脓液渗出，建模成功率为16.67%。

第二组试验犬在造模48 h 后，有2只犬出现创面红肿、脓液渗出，建模成功率为33.33%。

第三组试验犬在感染24 h 后，有5只犬出现创口湿润、创面红肿，48 h 后创口出现脓包、大量脓液渗出，建模成功率为83.33%。

表1 建模成功率
组别感染只数
成功率第一组
116.67%第二组233.33%第三组
5
83.33%
4 讨论
在感染之前，为保证菌种的活性，需将购置的菌种传代培养3次以上
[9]
，在感染之前要确保
菌种无其他细菌的污染。

模型应选择在便于观察不易抓挠的部位，犬的后臀部是最佳建模部位。

在切口时，要在无菌的条件下进行，保持深度均匀，面积可控。

创口愈合是一个复杂的过程，对于药物疗效的评价需要从创伤感染到创口愈合进行跟踪研究，因此动物模型目前在伤口愈合研究中是必不可少的[10]。

目前，我国大多采用较为简单的造模方法。

本试验采用刺刮创口菌液淋浇、刀刮直线形创伤菌液淋浇和刀刮月牙形创口菌液注射三种方法进行建模。

结果表明，刀刮月牙形创口菌液注射法建模方法最佳。

(下转第4页）
表2 锌对产蛋鸡生产性能的影响
指标对照组试验A组试验B组试验C组平均产蛋率/%86.3±2.587.5±2.886.7±3.388.0±3.6平均蛋重/g62.7±1.062.6±1.462.7±1.563.3±1.5平均日采食量/g114.7±2.5113.5±1.2113.8±1.5114.3±2.2平均料蛋比 2.14±0.05 2.06±0.07 2.09±0.05 2.06±0.04平均死亡率/% 0.880.340.650.55
3 讨论
锌是动物生长中不可或缺的微量元素，会影响动物的生理功能。

在蛋鸡的喂养过程中，鸡体缺锌会导致产蛋量的下降，种蛋孵化率低，鸡蛋品质也会大打折扣，因此在实际中通常会在日粮中添加锌源[1]。

不同锌源对蛋鸡生产性能的影响也不同。

蛋鸡对锌的需要量在30～50 mg/kg范围内[2]，本文选择的含量为34.5 mg/kg，符合蛋鸡的生理需求。

本文研究结果显示，对照组的蛋鸡死亡率最高，试验A组最低，试验A组低于对照组、试验B组、试验C组58.66%、43.65%、32.14%，差异有统计学意义（p＜0.05）；试验A组、试验B组、试验C组的产蛋率略高于对照组；对照组的平均料蛋比与采食量相对较高，差异有统计学意义（p＜0.05）。

说明一水硫酸锌和乳酸锌在基础日粮中加入后，蛋鸡的生产性能未发生明显的改变，添加乳酸锌后蛋鸡的产蛋率、蛋重有着略微的提高，日采食量和料蛋比有了略微的下降。

综上所述，锌对蛋鸡生产性能有着较大的影响，在基础日粮中加入乳酸锌的效果最佳，能够更好的提高蛋鸡生产性能。

参考文献：
[1] 张亚男,齐晓龙,武书庚,等. 硫酸锌和蛋氨酸锌 对产蛋后期蛋鸡生产性能、蛋品质及抗氧化性能的 影响[J].动物营养学报,2013,25(12):2873～2882.
[2] 齐 茜,李佶隆,马淑雪,等.羟基蛋氨酸锌对产蛋 后期蛋鸡生产性能、蛋品质和免疫相关基因表达的 影响[J].动物营养学报,2018,30(12):4939～ 4946.吉
(上接第2页）
5 结论
试验结果表明，刀刮月牙形创口菌液注射法为最佳的犬化脓性链球菌感染创伤造模方法，建模成功率达83.33%。

参考文献：
[1] Hirabayashi T, Anjo T, Kaneko A, et al. PNPLA1 has a crucial role in skin barrier function by directing acylceramide biosynthesis[J]. Nature Communications,2017,8,146～149. [2] Joanna N, Bednarski I A, Aleksandra L. The effect of an emollient with benfothiamine And Biolin prebiotic on the improvement of epidermal skin function:[J].Advances in De- rmatology & Allergology/postpy Dermatologii
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吉。