丽江滇重楼和白芨根腐病病原菌鉴定

贵州农业科学 2019,47(5):28〜30Guizhou Agricultural Sciences
［文章编号］1001-3601(2019)05-0153-0028-03
Plant Protection ・ Microorganism ・ Edible and Medicinal Fungi
丽江滇重楼和白芨根腐病病原菌鉴定
赵彩呈"，洪英娣2,刘丽2,张珍荫/熊正勇°，伍建榕
(1.西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室，云南昆明650224； 2.西南林业大学云南省森林灾害
预警与控制重点实验室，云南昆明650224； 3.云南省玉龙纳西族自治县森林病虫防治检疫站，云南丽江
674100； 4.云南省宁菠县林业局，云南 宁菠674300)
［摘 要］为滇重楼和白芨根腐病的防治提供参考依据，对分离自滇重楼和白芨根腐病根部的菌株DB- R 进行病原菌形态观察及分子生物学鉴定。

结果表明：滇重楼染病后根茎逐渐腐烂，最后整株萎蔦，根茎部 腐烂变软；白芨染病后块茎开始出现水渍状腐烂，后块根彻底变黑腐烂；病原菌菌体呈规则圆形，生长迅速， 不易被污染，菌丝初期为白色丝状，后变为紫红色；在构建的系统发育树中，获得的菌株DB-R 与尖砲镰刀菌 (MK156762)聚为一群。

引起滇重楼和白芨根腐病的病原菌为尖孑包镰刀菌。

［关键词］滇重楼；白芨；根腐病；病原菌；尖孑包镰刀菌［中图分类号］S567 ［文献标识码］A
Identification of Pathogen of Root Rot of Paris polyphylla var. yunnanensis and
Bletilla striata
ZHAO Caicheng^2, HONG Yingdi 2, LIU Li 2,
ZHANG Zhenyin 3 , XIONG Zhengyong 4 , WU Jianrong^2*
*［收稿日期］2019-01-22
［基金项目］国家自然科学基金项目(31360198,31860208);西南林业大学科技创新基金项目(C17123)；云南省高校基础研究产业化项目
(2016CYH14);西南林业大学木棉纤维人工林产业化培育省级创新团队项目(2018HC014)；三区人才支持项目(201602150,
21602128)
［作者简介］赵彩呈(1995 — ),女，在读硕士，研究方向：植物保护。

E-mail ： 1043637531@qq. com
*通讯作者：伍建榕(1963-)，女，教授，博士生导师，从事森林病理学和资源微生物利用研究。

E-mail ： 1176279044@qq. com
(1. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in the Southwest Region , Kunming , Yunnan 650224 ； 2. Key Laboratory
of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province , Southwest Forestry University , Kunming , Yunnan 650224； 3. Forest Protection Station in Yulong County , Lijiang, Yunnan 674100； 4. Forestry Bureau in Ninglang County , Ninglang, Yunnan 674300, China)
Abstract : In order to provide a reference for the prevention and treatment of Paris polyphylla var. yunnanensis and Bletilla striata of root rot, the pathogen morphology and molecular biology identification of DB-R strain isolated from the roots of P. polyphylla var. yunnanensis and B. striata of root rot were carried out. Results ： The rhizome of P ・ polyphylla var. yunnanensis decayed gradually after being infected, and finally the whole plant wilted and the rhizome decayed and became soft ； After £・ striata infection 9 the tuber began to appear water-stained rot. The pathogen body was regular and round, growing rapidly and not easy to be polluted. In the phylogenetic tree constructed? the strain DB-R and fusarium oxysporum (MK156762) were clustered together. Fusarium oxysporum was the cause of the root rot of P ・ polyphylla var. yunnanensis and B striata.
Key words ： Paris polyphylla var. yunnanensis^ Bletilla striata ； root rot ； pathogen ； fusarium oxys ­porum
滇重楼(Paris polyphylla var . yunnanensis ) 也称七叶一枝花，属百合科，具有消肿止痛、清热解
毒和抑菌的作用，可以用于医治咽喉肿痛、跌打损 伤、止血祛痰等症状，临床上可有效止血，治疗外科 炎症、神经性皮炎等。

白芨(Bletilla striata)为兰科 白芨属植物,花叶可供观赏，茎含大量具有特殊黏度
特性的白芨胶，可应用于化妆品中，根则是珍贵的中
药材原料，能够有止血凝血、消肿止痛等作用。

随着 滇重楼、白芨的集约化种植，品种退化和病虫害严重 影响其产量和质量口心。

目前,对滇重楼的研究大多
在分类、栽培技术、化学成分和药理作用等方面⑺，
在病虫害防治方面特别是病害国内外相关报道较 少3门，而滇重楼和白芨根腐病在生产中发生普遍， 是危害滇重楼和白芨的主要病害之一。

因此，对滇 重楼和白芨根腐病病原进行鉴定，以期为该病害的
防治提供理论依据。

1
材料与方法
1.1 材料
1.1.1 滇重楼和白芨 样品采于丽江市玉龙县太
赵彩呈等丽江滇重楼和白芨根腐病病原菌鉴定
ZHAO Caicheng et al Identification of Pathogen of Root Rot of Paris polyphylla var.yunnanensis and Bletilla striata・29・
安乡和宁菠县甘海子村的重楼及白芨种植基地。

1.1.2主要试剂真菌试剂盒为E.Z.N.A™-Fungal DNA Kit(100)和D3390-01(Omega Biotek)；ITS】,ITS4通用引物；PCR扩增混合液为2X Power Taq PCR Master Mix,BM2000DNA Marker；DM0101(Biomed)；DDH2O；1X TAE缓冲液；琼脂糖;DNA stains o
1. 1.3仪器及工具电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、冷冻离心机、数显恒温水浴锅、分析天平、旋涡混合器、液氮罐(10L)、PCR自动化系列分析仪、制冰机、基因枪等病原菌的分离和鉴定
1. 1.4培养基马铃薯琼胶培养基(PDA),配方：洗净去皮马铃薯200g,煮30min,用纱布滤去马铃薯,加蒸憎水补足1000mL,加入葡萄糖或蔗糖20g、琼胶20g加热至完全融化后，于121°C高压灭菌20min,冷却至55°C左右加入0.03g/L链霉素，混合均匀后倒平板待用。

1.2病原菌的分离与培养
1. 2.1根样处理将根部样品流水冲洗4h,用毛刷轻轻刷去表面泥土，在超净工作台上将病根置于75%酒精浸泡30s进行表面消毒后，置于0.1%升汞消毒3min,无菌水冲洗数次后置于灭菌滤纸吸干，最后放于PDA培养基25°C下进行培养。

1. 2.2病原真菌的纯化病原菌在25°C黑暗条件下培养5〜7d,待菌丝从病根上长出后，将长出的菌丝挑至PDA培养基上继续培养5〜7d,获得纯化菌株，接种在试管PDA斜面上,4°C冰箱保存备用。

1.2.3病原菌的形态学鉴定对纯化后的病原菌拍照、记录分离到的菌株数，参考MCLEAN等对菌落特征进行描述，测量菌落大小、记录菌落颜色、质地等形态特征。

根据菌落形态特征，参考《真菌鉴定手册》和《真菌分类学》,对分离到的病原菌进行初步的分类、鉴定。

1.2.4病原菌ITS-分子序列鉴定
1)菌株培养及采集。

将一4°C条件下保存的纯化菌株转接于PDA培养基上活化，于25°C培养箱中避光培养3〜7d。

待菌丝生长充足后于超净工作台上用无菌签刮下1〜2g菌丝放入1.5mL离心管中，于一2CTC冰箱中保存备用。

2)菌株DNA的提取。

利用真菌试剂盒提取分离菌的DNA：将装有菌丝的1.5mL离心管置于液氮中，速冻后用研磨棒迅速将菌丝研磨至粉末状备用，DNA提取方法参照试剂盒内说明书。

3)PCR反应。

反应体系25m L：DNA模板5yL约50ng9Mg2+浓度为1.5mmol/L9dNTPs浓度为0.2mmol/L,引物稀释为5pmol,Taq DNA 聚合酶为0.75U o反应程序：94°C下预变性3min；94°C变性30s,52°C退火30s,72°C延伸1min,30个循环；72°C延伸10min o
4)PCR扩增产物的检测。

架好清洗干净的制胶模板，将0.5g琼脂糖粉、50mL IX TAE缓冲液倒入干净的三角瓶中，于微波炉中加热使琼脂糖融化,冷却至45°C左右时加0.4m L核酸染料(4°C)并摇晃混匀。

慢慢倒入制胶模板中，不应有气泡。

放置20min,待胶凝固后，将其取出并放入装有IX TAE缓冲液的电泳槽中。

用基因枪分别将5m L PCR样品、DNA Maker加入点样孔中，于100V电压下电泳30min o在凝胶成像系统下观察500〜700bp的基因片段长度，将PCR产物送往测序公司测序。

5)菌株比对鉴定。

序列测定结果采用NCBI 进行比对，得到同源性99%及以上的序列，再利用ClustalXl.83、BioEditSequence Alignment Edi­tor,PAUP,Tree View等软件对所得序列进行分析，建造系统发育树。

2结果与分析
2.1根腐病病状
滇重楼从染病部位开始根茎逐渐腐烂，但在发病早期滇重楼病症表现不显著，后期地上部分叶片因根部吸收水分及养分能力减弱，边缘变黄焦枯，萎焉易拔起,最后整株萎蕭，根茎部腐烂变软。

白芨染病从块茎处开始出现水渍状腐烂，后块根彻底变黑腐烂，地上部茎叶先表现叶尖枯黄叶片失绿,后出现大面积褐色枯斑枯死(图Do
图1滇重楼(左)和白芨(右)根腐病地上部分症状
Fig.1Aboveground symptom of root rot of Paris polyphylla var.yunnanensis(left)and Bletil­
la(right)
2.2病原菌的形态特征及培养性状
从图2看出，分离菌(DB-R)菌体呈规则圆形，生长迅速，不易被污染，菌丝初期为白色丝状，后变为紫红色。

图2DB・R培养3d(左)和7d(右)后的性状Fig.2Morphological characteristics of DB-R after3days (left)and7days
(right)
贵州农业科学
Guizhou Agricultural Sciences ・30・
2.3病原菌的分子鉴定
利用通用引物ITS】和ITS4扩增DB-R的
rDNA-ITS序列，获得500〜750bp长度的DNA片
段（图3）。

将序列测定结果利用NCBI进行Blast
比对，找到同源性达99%的序列（GenBank登录号
为MK156762），在构建的系统发育树中，DB-R与尖
抱镰刀菌Fusarium oxysporum（MK156762）相聚
一群，且自举值达100%（图4）。

因此，确定引起滇
重楼和白芨根腐病的病原真菌为尖抱镰刀菌。

1
2000bp
1000 bp
750 bp
500 bp
M
注：M为2000bp的DNA Maker,1为菌株DB-R O
Note：M,2000bp DNA Marker；1,strain DB-R.
图3菌株DB-R的rDNA-ITS基因序列PCR产物电泳图谱
Fig.3Electrophoretograms for PCR products of rDNA-
ITS gene sequences of DB-R strain
100
76
80C
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56
图4基于rDNA-ITS序列构建的菌株DB-R系统发育树Fig.4Phylogenetic tree of DB-R strain constructed based on rDNA-ITS sequences 3结论与讨论
尖抱镰刀菌可危害茄科、豆科、林果及花卉等100多种植物，寄主范围广泛,种内含多个寄主专化型,在致病性上具有丰富的遗传多样性山切。

虽然试验确定引起滇重楼和白芨根腐病的病原真菌是尖抱镰刀菌{Fusarium oxysporum），但该菌株是否是滇重楼、白芨专化型还需通过与其他相关植物进行对比接种试验。

传统真菌学分类以形态学特征为主要依据，并遵循柯赫氏法则进行病原真菌的鉴定。

但仅以病原真菌形态特征为分类依据，外界环境条件的影响很大，有时也很难获得其有性无性抱子形态，甚至有些真菌不易或不形成繁殖器官，不仅不便于真菌的分类鉴定，而且不能充分反映出物种进化及种群间亲缘关系。

rDNA-ITS介于18SrDNA和28SrDNA 之间，ITS在真菌种间变异丰富，但在同种内不同真菌间高度保守，可以提供丰富的遗传信息，应用分子生物学方法鉴定真菌性病害已经成为一种重要手段：13'15］o研究结合传统真菌形态学和rDNA-ITS 序列分析，鉴定出危害滇重楼和白芨根腐病的病原真菌。

参阅植物病原真菌学的相关研究皿⑻，不仅对DB-R的形态学特征进行了比对，而且在构建的基于rDN A-ITS序列的系统树中，DB-R与尖抱镰刀菌Fusarium（MK156762）自举值达100%的聚在一起，确定引起滇重楼和白芨根腐病的病原真菌为能够为尖抱镰刀菌。

滇重楼和白芨都是土生土长的药材，长期的自然选择，使得其适应于该产地环境及植物的病原日益增多，而通过人工驯化后，植物的抗性往往降低，加之不当的栽培管理技术，使得种植区病害发生严重，甚至绝收。

滇重楼及白芨的经济价值主要为根部，尖刀镰抱菌的危害不但能直接造成根部腐烂，还影响地上部的生长发育，间接地对其根部膨大成长产生影响，以此造成恶性循坏，导致绝收，严重阻碍当地药材生产发展。

对于滇重楼、白芨根腐病病原菌的确定，不但能够帮助寻求滇重楼和白芨根腐病病害有效的防治方法，并为后续生防菌农药制剂的生产及其他生物防治的选择提供基础资料，还为种植地的经济发展做出贡献。

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(责任编辑：聂克艳)。