生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用

生物检测技术PCR及其在兽医微生物检测中的应用
作者：何旭孙代鹏
来源：《畜牧兽医科学》2018年第08期
摘要：目前，在生物检测技术当中所采用的PCR技术，是一种基于聚合酶链式反应的技术手段，也被称为无细胞分子克隆系统技术。

首先对现阶段PCR生物检测技术的基本原理和特征进行简述，并以此为基础，总结分析了PCR技术在兽医领域微生物检测当中的应用方法，从而探究技术的发展方向。

关键词：微生物检测;生物检测技术;PCR;发展
中图分类号：S852.2
文献标识码：B doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2018.08.007
0 前言
PCR技术最早出现于1985年的美国getus公司，这种技术检测方法在特定的DNA片段当中能够进行微量扩散，从而达到检测目的。

在研究领域，PCR技术较高的灵敏度和特异性特点。

随着技术发展与创新，目前PCR技术应用更加广泛，除了在基因克隆方面得到长足应用外，在兽医领域的治疗诊断中，也得到了充分的运用。

因此，探究PCR技术，对实现微生物的精准检测意义十分重大。

1 PCR技术的原理与应用特征
1.1 PCR技术原理
在已知技术的作用下，各种DNA片段序列会得到有效扩增，再加上人工合成DNA片段的相互作用，可以在两条链的末端进行互补，从而将核苷酸引物突显出来，在该种方式的作用之下，待检DNA序列在酶的作用下会出现扩增，该项技术也被人们称之为PCR技术。

通俗意义上来讲，PCR就是体外人工选择性扩增DNA的一种方法，它类似于生物体内的DNA的复制。

在整个反应过程之中，DNA模板会经历变性、退火和延伸3个过程，并由若干个循环序列组成。

首先，在高温作用下，DNA模板会出现变性解链，之后在通过降温，促使寡核苷酸和模板DNA链在三端出现退火现象。

另外，在聚合酶的作用下，有4种DNTP底物存在，并在模板互补过程中形成新的链条。

除此之外，在单一拷贝过程中，基因可以将25～ 30作为基数，最终扩展到100万～200万之间[1]。

在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。

平台期会使原先由于错
配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。

因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。

到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝[2]。

1.2 PCR技术特征
在PCR反应结束之后，便会产生新的引物，这种还包括各种聚合酶及缓冲液，其基本技术特征主要集中的以下几方面：首先是引物，在DNA片段扩增过程中，主要涉及到寡核苷酸作用下，PCR扩展特性中的关键因素得到了有效突显，在引物设计过程中，还能对PCR扩展成效进行突显。

一般来说，由于碱基在链条之中的不断重复，引物间的Tm将会与标准值更加接近，避免GC含量出现过高情况。

其次是DNA聚合物特点，截止到目前，PCR在扩展之中可以对DNA聚合酶进行充分应用，且应用类型为TagDNA，该类型主要在水生栖热菌作用下产生，具有极强的热稳定性。

如果PCR的扩展能力较高，便会对具体的DNA特性产生影响。

一般来说，在100 uL反应体系的作用下，2单位的PCR技术将会得到有效应用。

另外，由于耐热聚合酶在RNA反转录过程中大量增加，操作程序出现较大简化，从而实现转录效率的进一步提升。

最后，为了将检测效率进行提升，相关研究人员对缓冲液进行了积极应用，在此过程中，缓冲液的主要类型为10～50 mol的HCI体系，切记不能将Tag酶和缓冲液较差使用[3]。

2 PCR技术在曾医微生物检测中的应用
通过对兽医微生物检测工作的分析可知，传统方法用于微生物监测，步骤十分繁琐，且局限性较强，具体表现为：这种检测方法要求待测样品经被检测微生物富集培养一段时间后，直至微生物数量达到既定的相应水平，方可分离并进行检测。

相比之下，PCR技术则可有效避免上述弊端，在兽医微生物检测中，这种检测技术仅需通过特定的核苷酸引物，快速分析并确定样本中的微生物种类[4]。

在实际检验过程中，具体检测流程为：提取细菌靶DNA，采用过滤处理方法或离心处理方法，从待检样品中分离出细菌细胞;对细菌细胞进行裂解处理，经过核酸纯化处理后，为后续检验奠定基础。

除了这种方法，出于便捷性目的，还可以通过直接裂解待检样品中细菌细胞的方式，抽提其中所在的核酸。

以大肠杆菌检测为例，在传统检测模式下，需将待检牲畜样品、细菌置于含乳糖的革兰阴性菌环境下，持续培养一段时间后，再进行分离，最后进行检测。

整个大肠杆菌检测耗时3～5d，甚至更长，且检测方法相对繁琐，一旦其中一个环节出现问题，可能导致最终检测结果受到影响。

而在兽医大肠杆菌检测中引入PCR技术后，整个检测流程被简化为：根据大肠杆菌类，设计适宜的PCR反应序列，利用PCR、扩增样本中的uidA基因、lacZ基因，此时，即可检出样本中的大肠杆菌以及大肠杆菌类[5]。

鸡养殖是我国养殖行业的主要构成。

随着养殖业的不断发展，鸡病问题逐渐受到人们的重视。

为了保障养殖行业的良性发展，可引入PT-PCR技术，具体检测流程如下：为鸡胚接种病毒，制取适量鸡胚尿囊液标本，从其中提纯RNA，按照规范流程完成CDNA的制备，建立
PCR反应序列并进行反应，再次进行鸡胚接种后，可获取充足的双股RNA片段，且该RNA 片段特征具有可克隆特征，为病鸡死亡率的控制提供良好的技术支持。

目前，PCR技术已经在各个生物领域得到初步的应用，从而衍生出比较新颖的技术形式。

通过PCR与其他技术的联用还可以解决生产技术的难题。

但在实际操作与运用过程中还存在一些问题。

例如：水产动物养殖生产者缺乏实验设备或实验设备不够先进、DNA萃取过程不当、实验试剂上的问题等，这些情况容易使检测的结果不够理想，失去生物检测原有的意义[6]。

快速、简便、灵敏的PCR检测方法为水产养殖动物的疾病诊断带来希望。

随着PCR技术的不断完善以及与其他新技术的联合应用，将会极大地推动畜牧及水产养殖业的有效发展[7]。

3 结束语
综上所述，在目前的生物检测技术手段当中，PCR技术以其独特的精准度优势在兽医微生物检测领域得到了充分的运用。

而技术手段方面，检测人员中需要将多试剂进行试管液相杂交，就可以完成较高灵敏度的快速诊断，最终提升检测诊断效率。

参考文献
[1]郑凤娇，郑小玲，刘楠.血清样本急性心肌梗死生物标志物的高通量悬浮芯片检测技术研究[J].基因组学与应用生物学，2017， 36 （12）：5014-5020.
[2]陈诺，唐善虎，岑璐伽，等.多重PCR技术在食品微生物检测中的应用进展[J]中国畜牧兽医，2010，37（ 10）：72-75
[3]李芳，康怀彬，马红燕.食品中农兽药残留生物传感检测技术的研究进展[J].食品工业科技，2017，38（4）：396-400.
[4]林佳琪，苏同成，苏文金，等.数字PCR技术及应用研究进展[J].生物工程学报，2017，33（2）：170-177.
[5]沈兰，王锐萍，史海涛，等.PCR技术在快速检测沙门氏菌中的应用[J].基因组学与应用生物学，2012，31 （1）：90-94.
[6]李竹红，刘德培，梁植权.改进的反向PCR技术克隆转移基因的旁侧序列[J].生物化学与生物物理进展，1999 （6）：600-602+623
[7]王皓，康现江，王琦.重组PCR技术研究进展和应用[J].中国生物工程杂志，2007（5）：153-156.。