临床分子诊断学：地中海贫血电泳及结果分析
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❖迁移速度： 超螺旋的DNA>线状DNA >开环
DNA 。
缓冲液
❖DNA的泳动受缓冲液的组成和离子强 度的影响。
缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很 慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量 的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性
❖最常用的缓冲液是1×TAE(Tris-醋酸EDTA)和TBE(Tris-硼酸-EDTA)。
配制成1×TAE稀释缓冲，待用。
2、胶槽准备
①取出胶板和梳子，将胶板放入胶槽中; ②将梳子垂直插入到胶槽的小凹槽内，梳齿底 端和板面有1mm的间隙; ③将胶槽放在调整好的水平台上。
电泳操作步骤
❖3、凝胶准备 用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1×TAE; ② 微波炉加热大约3-5分钟，熔化琼脂糖; ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到50～60℃时，轻轻混
注意事项
1 实验用具和溶液均有可能受到染料的污染， 操作过程应戴手套!
2 加样时小心操作, 枪头伸入孔中缓慢加入， 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
3 本体系含有正常对照条带，无论有无发生缺 失，每个样本至少应有一条电泳条带，否则， 提示扩增失败，应重新检测
琼脂糖浓度与线性DNA分离范围参数
相同大小的线状 DNA片断在不同浓度的琼 脂糖凝胶中迁移率不同.在一定浓度的琼脂 糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率 也是不同的。
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
分离范围（kb）
5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
• 标准型－2个α基因缺失或丧失功能
临床无症状，血液学检查出现轻微贫血，红细 胞大小不均一，平均红细胞体积(MCV) 及平均 血红蛋白含量(MCH)明显偏低。
•血红蛋白H病－3个α基因缺失或丧失功能
肝脾肿大，中度贫血。小细胞，低色素，HbH含 量较高，易发生溶血，有些病例需不定期输血， 症重者甚至需切除脾脏。
❖核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在 紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
原理
•琼脂糖是从海藻中提取的、 由D-和 L-半乳糖残基通过α 和β糖苷键交替构成的线状 聚合物。琼脂糖链形成螺旋 纤维，然后再聚合成半径为 20-30nm的超螺旋结构。
干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，加热煮沸变为澄清， 室温冷却、凝聚，即成琼脂糖凝胶。
❖2、基因型检测结果虽然是临床诊断的确诊 指标，但其临床意义的解释复杂多样，需 要结合血液学和临床资料进行综合分析
实验报告（思考题）
❖写出标本的基因型 ❖若扩增不成功，请列出可能是什么原
因导致这种结果
❖电泳指示剂和染色剂有何区别，各自的作 用是什么？
电泳条带与基因型判断
基因型 (-- /-- ) (-- / -3.7) (--/ -4.2) (--/--SEA ) (-3.7 / --SEA )
（-3.7/ -4.2） (- 4.2 / --SEA ) （- 3.7/- 3.7） （-4.2/ -4.2） （-- SEA /-- SEA ）。
• 静止型－单一α基因缺失或丧失功能
临床无任何症状，一般血液学检查无异样，仅 平均红细胞体积(MCV) 位于正常值下限。
a地贫的基因型与表现型
αo Thal trait (αα /--SEA) ( - α/ - α)
Hb H disease (- α 3.7/--SEA) (- α 4.2/--SEA)
电泳电压
❖低压条件下，线状DNA在琼脂糖凝胶 上泳动速度和电压成正比。随着电压升 高，高分子量的DNA片段泳动速度和 电压不成正比关系，分辨率下降了，因 此为了得到良好的分离效果，电场电压 不宜超过5V/CM。
指示剂
DNA分子的大小
❖双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与 其碱基数的常用对数成反比。
❖分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力 越大，二是大分子通过凝胶孔径的效 率低于较小的分子。
DNA的构象
DNA的构象
❖不同构象DNA分子在电场中移动的距 离不同。具有相同分子量的线状、开环 状和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动 速度不同。
匀准备铺胶。
4、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶槽 内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右， 凝胶固化。
电泳操作步骤
5、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。将带凝 胶的胶板置于电泳槽中，并使样品孔位于 电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓 冲液，越过凝胶表面即可。
12 3 4 56 7 8
1 （- 3.7/-3.7） 2 （-4.2/ -4.2） 3 （- 3.7 / --SEA ) 4 （-3.7/ -4.2） 5 （- 4.2 / --SEA ) 6 （ - -ห้องสมุดไป่ตู้/ - 4.2) 7 （ - - / -3.7) 8 （ - - /--SEA )
6、原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如 发现有气泡，应设法去除。
电泳操作步骤
二 琼脂糖凝胶电泳
1、加样：
直接从PCR扩增后的反应管中取5μl红色液体加入 电泳孔中，注意不要加到孔外； marker：5ul
2、电泳：盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压120-130V；时间20-30分钟左右
❖常用的电泳上样缓冲液 含溴酚蓝，有的还含有 二甲苯青，这些指示剂 可以指示电泳的速度， 也可以利用其迁移率大 致估计DNA的分子量， 而与琼脂糖浓度无关。
❖ （本试剂已包含指示剂，电泳 时无需另加）
染色
❖ 溴化乙淀（EB）是核酸 的染色剂，能插入DNA 分子中形成荧光结合物， EB在紫外线照射下的发 射荧光。荧光的强度与 DNA的含量成正比，从 而可以确定DNA片段在 凝胶中的位置及估计出 待测样品的浓度
α-地贫实验原理
❖考虑到四对引物要在同一管扩增并通 过电泳来判断结果，设计引物位置时 各PCR产物的条带大小要有区别，最 终-α3.7、αα、-α4.2和—SEA的扩增 条带分别约为：2.0kbp、1.7kbp、 1.4kbp和1.2kbp
电泳条带与基因型的对应关系
❖条带大小 基因型 ❖2.0 kb -α3.7 ❖1.7 kb αα
基因型 条带大小 1.4 kb -α4.2 1.2 kb --SEA
❖ 出现电泳条带 ❖ 1.7Kb ❖1.7Kb 2.0Kb ❖1.7Kb 1.4Kb ❖1.7Kb 1.2Kb ❖2.0Kb 1.2Kb ❖2.0Kb 1.4Kb ❖1.4Kb 1.2Kb ❖ 2.0Kb ❖1.4 kb ❖ 1.2Kb
a地贫的基因型与表现型
Hb Bart's Hydrops (--SEA/--SEA)
• Hb Bart’s 水肿胎儿综合症
4个α基因缺失或丧失功能
患胎于妊娠晚期或产后数小时内死亡，全身水 肿，肝脾肿大。
评价
❖1、本实验的局限性为本方法仅检测3种中 国人常见缺失，但不排除其它少见缺失及 突变的发生。
地中海贫血的血液学表型特征
• RBC 参数 MCV ↓ MCH ↓ 细胞形态变化
• Hb电泳分析 Hb A2 ↓ (α) 或 ↑ (β) Hb Bart’s Hb H (α) Hb E (β)
a地贫的基因型与表现型
Normal (αα/αα)
• 正常
α+ thal trait (αα/-α3.7) (αα/-α4.2)
2基因型检测结果虽然是临床诊断的确诊指标但其临床意义的解释复杂多样需要结合血液学和临床资料进行综合分析实验报告思考题写出标本的基因型若扩增不成功请列出可能是什么原因导致这种结果电泳指示剂和染色剂有何区别各自的作用是什么
LOGO
地中海贫血基因检测
α-地贫琼脂糖凝胶电泳
及结果分析
实验目的：
❖1 学习与掌握琼脂糖凝胶电泳原理和 方法。
琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控 制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼 脂糖形成较小的孔径。
影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的因素
• 凝胶浓度 • DNA分子大小 • DNA分子的构象 • 缓冲液 • 电泳电压
试剂准备
1. TAE电泳缓冲液： 50X TAE 1X TAE ：取50×TAE缓冲液20ml，加
水至1000ml 2 . DNA Marker标准分子量
电泳操作步骤
一、琼脂糖凝胶的制备（示教视频）
1 、电泳缓冲液准备 取50×TAE缓冲液20ml，加水至1000ml，
❖2 利用琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成 像系统判断α地贫的基因类型。
原理
❖在pH值为8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎 不解离，磷酸基团全部解离，核酸分子带 负电，在电泳时向正极移动。
❖采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物， 在分子筛的作用下，使分子大小和构象不 同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从 而能达到分离核酸片段检测其大小的目的。
分组实验
❖1-4号第一个槽， 5-8号第二个槽 ❖ 样品 加样孔
阳性
1 2 marker 3 4 阴性 对照
阳性
5 6 marker 7 8 阴性 对照
电泳操作步骤
3、电泳结束后，切断电源，取出凝胶
4、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电泳条带 ②凝胶成像系统拍照 ③观察电泳带及其位置，并与核酸分 子量标准Marker比较被扩增产物的大小， 判断基因型。
❖ EB是强致癌剂. ❖ 今天采用的是厂家提供的替
代染料
染色剂即可以在电泳前 加入样液，又可以电泳 后再对凝胶染色
材料和设备
❖材料：PCR扩增产物 ❖设备：微量移液器，电泳仪，琼脂糖
平板电泳装置，微波炉，凝胶成像系 统等。
DNA 。
缓冲液
❖DNA的泳动受缓冲液的组成和离子强 度的影响。
缺乏离子，电导率严重降低，电泳迁移率很 慢；离子强度过高，电导率升高，极易产生大量 的热能，最严重的结果是凝胶熔化，DNA变性
❖最常用的缓冲液是1×TAE(Tris-醋酸EDTA)和TBE(Tris-硼酸-EDTA)。
配制成1×TAE稀释缓冲，待用。
2、胶槽准备
①取出胶板和梳子，将胶板放入胶槽中; ②将梳子垂直插入到胶槽的小凹槽内，梳齿底 端和板面有1mm的间隙; ③将胶槽放在调整好的水平台上。
电泳操作步骤
❖3、凝胶准备 用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1×TAE; ② 微波炉加热大约3-5分钟，熔化琼脂糖; ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到50～60℃时，轻轻混
注意事项
1 实验用具和溶液均有可能受到染料的污染， 操作过程应戴手套!
2 加样时小心操作, 枪头伸入孔中缓慢加入， 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
3 本体系含有正常对照条带，无论有无发生缺 失，每个样本至少应有一条电泳条带，否则， 提示扩增失败，应重新检测
琼脂糖浓度与线性DNA分离范围参数
相同大小的线状 DNA片断在不同浓度的琼 脂糖凝胶中迁移率不同.在一定浓度的琼脂 糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率 也是不同的。
琼脂糖浓度(%)
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
分离范围（kb）
5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3
• 标准型－2个α基因缺失或丧失功能
临床无症状，血液学检查出现轻微贫血，红细 胞大小不均一，平均红细胞体积(MCV) 及平均 血红蛋白含量(MCH)明显偏低。
•血红蛋白H病－3个α基因缺失或丧失功能
肝脾肿大，中度贫血。小细胞，低色素，HbH含 量较高，易发生溶血，有些病例需不定期输血， 症重者甚至需切除脾脏。
❖核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在 紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
原理
•琼脂糖是从海藻中提取的、 由D-和 L-半乳糖残基通过α 和β糖苷键交替构成的线状 聚合物。琼脂糖链形成螺旋 纤维，然后再聚合成半径为 20-30nm的超螺旋结构。
干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，加热煮沸变为澄清， 室温冷却、凝聚，即成琼脂糖凝胶。
❖2、基因型检测结果虽然是临床诊断的确诊 指标，但其临床意义的解释复杂多样，需 要结合血液学和临床资料进行综合分析
实验报告（思考题）
❖写出标本的基因型 ❖若扩增不成功，请列出可能是什么原
因导致这种结果
❖电泳指示剂和染色剂有何区别，各自的作 用是什么？
电泳条带与基因型判断
基因型 (-- /-- ) (-- / -3.7) (--/ -4.2) (--/--SEA ) (-3.7 / --SEA )
（-3.7/ -4.2） (- 4.2 / --SEA ) （- 3.7/- 3.7） （-4.2/ -4.2） （-- SEA /-- SEA ）。
• 静止型－单一α基因缺失或丧失功能
临床无任何症状，一般血液学检查无异样，仅 平均红细胞体积(MCV) 位于正常值下限。
a地贫的基因型与表现型
αo Thal trait (αα /--SEA) ( - α/ - α)
Hb H disease (- α 3.7/--SEA) (- α 4.2/--SEA)
电泳电压
❖低压条件下，线状DNA在琼脂糖凝胶 上泳动速度和电压成正比。随着电压升 高，高分子量的DNA片段泳动速度和 电压不成正比关系，分辨率下降了，因 此为了得到良好的分离效果，电场电压 不宜超过5V/CM。
指示剂
DNA分子的大小
❖双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与 其碱基数的常用对数成反比。
❖分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力 越大，二是大分子通过凝胶孔径的效 率低于较小的分子。
DNA的构象
DNA的构象
❖不同构象DNA分子在电场中移动的距 离不同。具有相同分子量的线状、开环 状和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动 速度不同。
匀准备铺胶。
4、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶槽 内，凝胶厚度3～5mm,室温下静置半小时左右， 凝胶固化。
电泳操作步骤
5、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。将带凝 胶的胶板置于电泳槽中，并使样品孔位于 电场负极，向电泳槽中加入1×TAE电泳缓 冲液，越过凝胶表面即可。
12 3 4 56 7 8
1 （- 3.7/-3.7） 2 （-4.2/ -4.2） 3 （- 3.7 / --SEA ) 4 （-3.7/ -4.2） 5 （- 4.2 / --SEA ) 6 （ - -ห้องสมุดไป่ตู้/ - 4.2) 7 （ - - / -3.7) 8 （ - - /--SEA )
6、原梳齿处(样品孔)即被缓冲液充满，如 发现有气泡，应设法去除。
电泳操作步骤
二 琼脂糖凝胶电泳
1、加样：
直接从PCR扩增后的反应管中取5μl红色液体加入 电泳孔中，注意不要加到孔外； marker：5ul
2、电泳：盖上电泳槽，接通电源，开始电泳 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。 电泳条件：电压120-130V；时间20-30分钟左右
❖常用的电泳上样缓冲液 含溴酚蓝，有的还含有 二甲苯青，这些指示剂 可以指示电泳的速度， 也可以利用其迁移率大 致估计DNA的分子量， 而与琼脂糖浓度无关。
❖ （本试剂已包含指示剂，电泳 时无需另加）
染色
❖ 溴化乙淀（EB）是核酸 的染色剂，能插入DNA 分子中形成荧光结合物， EB在紫外线照射下的发 射荧光。荧光的强度与 DNA的含量成正比，从 而可以确定DNA片段在 凝胶中的位置及估计出 待测样品的浓度
α-地贫实验原理
❖考虑到四对引物要在同一管扩增并通 过电泳来判断结果，设计引物位置时 各PCR产物的条带大小要有区别，最 终-α3.7、αα、-α4.2和—SEA的扩增 条带分别约为：2.0kbp、1.7kbp、 1.4kbp和1.2kbp
电泳条带与基因型的对应关系
❖条带大小 基因型 ❖2.0 kb -α3.7 ❖1.7 kb αα
基因型 条带大小 1.4 kb -α4.2 1.2 kb --SEA
❖ 出现电泳条带 ❖ 1.7Kb ❖1.7Kb 2.0Kb ❖1.7Kb 1.4Kb ❖1.7Kb 1.2Kb ❖2.0Kb 1.2Kb ❖2.0Kb 1.4Kb ❖1.4Kb 1.2Kb ❖ 2.0Kb ❖1.4 kb ❖ 1.2Kb
a地贫的基因型与表现型
Hb Bart's Hydrops (--SEA/--SEA)
• Hb Bart’s 水肿胎儿综合症
4个α基因缺失或丧失功能
患胎于妊娠晚期或产后数小时内死亡，全身水 肿，肝脾肿大。
评价
❖1、本实验的局限性为本方法仅检测3种中 国人常见缺失，但不排除其它少见缺失及 突变的发生。
地中海贫血的血液学表型特征
• RBC 参数 MCV ↓ MCH ↓ 细胞形态变化
• Hb电泳分析 Hb A2 ↓ (α) 或 ↑ (β) Hb Bart’s Hb H (α) Hb E (β)
a地贫的基因型与表现型
Normal (αα/αα)
• 正常
α+ thal trait (αα/-α3.7) (αα/-α4.2)
2基因型检测结果虽然是临床诊断的确诊指标但其临床意义的解释复杂多样需要结合血液学和临床资料进行综合分析实验报告思考题写出标本的基因型若扩增不成功请列出可能是什么原因导致这种结果电泳指示剂和染色剂有何区别各自的作用是什么
LOGO
地中海贫血基因检测
α-地贫琼脂糖凝胶电泳
及结果分析
实验目的：
❖1 学习与掌握琼脂糖凝胶电泳原理和 方法。
琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控 制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼 脂糖形成较小的孔径。
影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移率的因素
• 凝胶浓度 • DNA分子大小 • DNA分子的构象 • 缓冲液 • 电泳电压
试剂准备
1. TAE电泳缓冲液： 50X TAE 1X TAE ：取50×TAE缓冲液20ml，加
水至1000ml 2 . DNA Marker标准分子量
电泳操作步骤
一、琼脂糖凝胶的制备（示教视频）
1 、电泳缓冲液准备 取50×TAE缓冲液20ml，加水至1000ml，
❖2 利用琼脂糖凝胶电泳检测和凝胶成 像系统判断α地贫的基因类型。
原理
❖在pH值为8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎 不解离，磷酸基团全部解离，核酸分子带 负电，在电泳时向正极移动。
❖采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物， 在分子筛的作用下，使分子大小和构象不 同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从 而能达到分离核酸片段检测其大小的目的。
分组实验
❖1-4号第一个槽， 5-8号第二个槽 ❖ 样品 加样孔
阳性
1 2 marker 3 4 阴性 对照
阳性
5 6 marker 7 8 阴性 对照
电泳操作步骤
3、电泳结束后，切断电源，取出凝胶
4、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电泳条带 ②凝胶成像系统拍照 ③观察电泳带及其位置，并与核酸分 子量标准Marker比较被扩增产物的大小， 判断基因型。
❖ EB是强致癌剂. ❖ 今天采用的是厂家提供的替
代染料
染色剂即可以在电泳前 加入样液，又可以电泳 后再对凝胶染色
材料和设备
❖材料：PCR扩增产物 ❖设备：微量移液器，电泳仪，琼脂糖
平板电泳装置，微波炉，凝胶成像系 统等。