基于dsDNA-CuNCs的荧光ELISA检测牛奶中的E._coli_O157

基金项目：国家自然科学基金地区项目（编号：８２２６０６４４）
；江西省高层次高技能领军人才培养工程项目（２０２１年度）
作者简介：曹文凯，男，南昌大学在读硕士研究生。

通信作者：赖卫华（１９６８—），男，南昌大学教授，博士。

Ｅ ｍａｉｌ：ｔａｌｋｔｏｌａｉｗｈ＠１
６３．ｃｏｍ收稿日期：２０２３ ０６ ３１ 改回日期：２０２３ ０８ １７
犇犗犐：１０．１３６５２／犼．狊狆犼狓．１００３．５７８８．２０２３．８０７３４［文章编号］１００３ ５７８８（２０２３）０９ ００３８ ０６
基于ｄｓＤＮＡ ＣｕＮＣｓ的荧光ＥＬＩＳＡ检测
牛奶中的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７
ＡｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＥＬＩＳＡｂａｓｅｄｏｎｄｓＤＮＡ ＣｕＮＣｓｆｏｒｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７ｉｎｍｉｌｋ
曹文凯１
犆犃犗犠犲狀犽犪犻１　山　珊２
犛犎犃犖犛犺犪狀２　刘道峰３，
４
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　彭　娟１
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狌５　赖卫华１
犔犃犐犠犲犻犺狌犪１（１．南昌大学食品学院，江西南昌　３３００４７；２．江西师范大学生命科学学院，江西南昌　３３００２２；３．江西省疾病预防控制中心，江西南昌　３３００２９；４．　江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室，
江西南昌　３３００２９；５．长沙理工大学食品科学与生物工程学院，湖南长沙　４１０１１４
）（１．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犉狅狅犱犛犮犻犲狀犮犲，犖犪狀犮犺犪狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犖犪狀犮犺犪狀犵，犑犻犪狀犵狓犻３３００４７，犆犺犻狀犪；２．犆狅犾犾犲犵犲狅犳犔犻犳
犲犛犮犻犲狀犮犲，犑犻犪狀犵狓犻犖狅狉犿犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犖犪狀犮犺犪狀犵，犑犻犪狀犵狓犻３３００２２，犆犺犻狀犪；３．犑犻犪狀犵狓犻犘狉狅狏犻狀犮犻犪犾犆犲狀狋犲狉犳狅狉犇犻狊犲犪狊犲犆狅狀狋狉狅犾犪狀犱犘狉犲狏犲狀狋犻狅狀，犖犪狀犮犺犪狀犵，犑犻犪狀犵狓犻３３００２９，犆犺犻狀犪；４．犑犻犪狀犵狓犻犘狉狅狏犻狀犮犻犪犾犓犲狔犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔狅犳犇犻犪犵狀狅狊犻狀犵犪狀犱犜狉犪犮犻狀犵狅犳犉狅狅犱犫狅狉狀犲犇犻狊犲犪狊犲，犖犪狀犮犺犪狀犵，犑犻犪狀犵狓犻３３００２９，犆犺犻狀犪；５．犛犮犺狅狅犾狅犳犉狅狅犱犛犮犻犲狀犮犲犪狀犱犅犻狅犲狀犵犻狀犲犲狉犻狀犵，犆犺犪狀犵狊犺犪犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犛犮犻犲狀犮犲牔犜犲犮犺狀狅犾狅犵狔，犆犺犪狀犵狊犺犪，犎狌狀犪狀４１０１１４，犆犺犻狀犪）摘要：目的：建立了一种灵敏检测牛奶中大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的新型荧光酶联免疫吸附方法。

方法：
以碱性磷酸酶水解焦磷酸盐 Ｃｕ２＋配位复合物，释放出Ｃｕ２＋形成铜纳米簇作为信号报告探针，通过对关键因素Ｃｕ
２＋浓度、焦磷酸盐浓度、ＤＮＡ模板的浓度和长度进行优化。

结果：
在最优条件下，大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的菌数为５×１０４
～１×１０８
ＣＦＵ／ｍＬ时，与荧光信号值有较好的线性关系（犚２＝０．９８０８），最低检出限为２．４×１０４ＣＦＵ／ｍＬ。

结论：
该方法成功地应用于低脂牛奶和脱脂牛奶样本中大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的测定，平均回收率为９２．２％～１０８．５％，相对标准偏差为４．９％～１０．４％。

关键词：酶联免疫吸附；铜纳米簇；大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７；检测
犃犫狊狋狉犪犮狋：犗犫犼犲犮狋犻狏犲：Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙａｉｍｅｄｔｏｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｏｖｅｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｍ
ｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７ｉｎｍｉｌｋｓａｍｐ
ｌｅｓ．犕犲狋犺狅犱狊：Ｔｈｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃｕ２＋ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘｗａｓｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｂｙａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐ
ｈａｔａｓｅ，ａｎｄＣｕ２＋ｗａｓｒｅｌｅａｓｅｄｆｒｏｍｃｏｐｐｅｒｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓａｓｓｉｇｎａｌｒｅｐｏｒｔｉｎｇｐｒｏｂｅｓ．Ｋｅｙｆ
ａｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓＣｕ２＋
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｐｙｒｏｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｌｅｎｇｔｈｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．犚犲狊狌犾狋狊：Ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｈｅｏｐ
ｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｅｘｈｉｂｉｔｅｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ（
犚２＝０．９８０８）ｗｉｔｈｔｈｅｔａｒｇｅｔ犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７ｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ５×１０４～１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ．Ｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓ２．４×１０４ＣＦＵ／ｍＬ．犆狅狀犮犾狌狊犻狅狀：Ｔｈｅ
ｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｐｐ
ｌｉｅｄｔｏｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７ｉｎｓａｍｐｌｅｓｏｆｌｏｗ ｆａｔｍｉｌｋａｎｄｓｋｉｍｍｉｌｋ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓ９２．２％～１０８．５％ｗｉｔｈｒｅｌａｔｉｖｅｓｔａｎｄａｒｄｄｅｖｉａｔｉｏｎ４．９％～１
０．４％．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ；ｃｏｐｐｅｒｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ
；犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７是一种常见食源性致病菌，它可以通过被污染的食物来传染人类，如未煮熟的肉制品、生牛
奶等［１］。

感染犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７后可能会出现腹痛和腹
泻等症状，
严重时会导致肾衰竭甚至死亡。

目前，用于检测食源性致病菌的方法（例如，平板培养、菌落计数法、Ｌａｍｐ和ＰＣＲ等），存在既费力又费时的问题。

近年来，研究者已经开发了多种快速、灵敏和可靠的方法来检测犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７。

免疫分析技术如酶联
免疫吸附［９］、化学发光免疫分析［１０］
和免疫层析等具有快
速、
灵敏度高和特异强等优势，在食源性致病菌检测中发挥着重要作用。

其中酶联免疫吸附技术（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ
，ＥＬＩＳＡ）是一种基于抗原和抗体特８
３ＦＯＯＤ＆ＭＡＣＨＩＮＥＲＹ第３９卷第９期总第２６３期｜２０２３年９月｜
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异性反应的分析技术，现已被广泛地应用于犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７的快速检测。

在传统的ＥＬＩＳＡ中，通常采用辣根过氧化物酶催化显色底物３，３′，５，５′ 四甲基联苯胺（ＴＭＢ）作为信号输出，存在灵敏度相对较低的问题，严重妨碍了ＥＬＩＳＡ在实际检测中的应用。

高信号的荧光与ＥＬＩＳＡ结合起来，可以解决ＥＬＩＳＡ灵敏度较低的问题。

铜纳米团簇（Ｃｏｐｐｅｒｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ，ＣｕＮＣｓ）因其独特的超小尺寸和较宽的斯托克斯位移，与传统荧光探针相比，具有更优越的荧光特性，在生物传感和生物示踪等领域具有广阔的应用前景。

其中以腺嘌呤—胸腺嘧啶双链ＤＮＡ（Ａｄｅｎｉｎｅ ｔｈｙｍｉｎｅｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡ，ＡＴｄｓＤＮＡ）为模板合成的ＣｕＮＣｓ，具有合成简单、荧光强度高和尺寸可调等优势。

在抗坏血酸的作用下Ｃｕ２＋会在ＡＴｄｓＤＮＡ模板上被还原成Ｃｕ０＋形成ＣｕＮＣｓ，在特定的激发波长下，能够产生稳定的荧光信号［１６］。

而焦磷酸盐（Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＰｉ）对Ｃｕ２＋的强配位作用将抑制Ｃｕ２＋的还原，从而抑制荧光信号的产生。

ＰＰｉ是公认的碱性磷酸酶的天然底物，当其被碱性磷酸酶水解成磷酸盐（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，Ｐｉ）后，Ｃｕ２＋会从ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ配位复合物中释放出来，被抗坏血酸在模板ＤＮＡ上还原成Ｃｕ０＋［１９］，形成ＣｕＮＣｓ。

研究拟通过碱性磷酸酶水解ＰＰｉ释放Ｃｕ２＋，在抗坏血酸的作用下Ｃｕ２＋在ＡＴｄｓＤＮＡ模板上被还原成Ｃｕ０＋，形成ＣｕＮＣｓ。

以具有较强荧光信号的ＣｕＮＣｓ作为荧光信号探针，建立一种新型的荧光ＥＬＩＳＡ，用于检测低脂牛奶和脱脂牛奶样本中的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７。

１　材料与方法
１．１　试剂与仪器
低脂牛奶、脱脂牛奶：市售；
含２０，３０，４０，５０，６０，７０个碱基的ＡＴｄｓＤＮＡ（ＡＴ
２０
、ＡＴ３０、ＡＴ４０、ＡＴ５０、ＡＴ６０和ＡＴ７０）：生工生物工程股份有限公司；
焦磷酸盐（Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＰｉ）、ＣｕＳＯ
４·５Ｈ
２Ｏ
和抗
坏血酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）：分析纯，阿拉丁生物试剂股份有限公司；
牛血清白蛋白（ＢＳＡ）：纯度≥９８％，美国Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ公司；
３ 吗啉丙磺酸（ＭＯＰＳ）、ＰＢＳ、（３，３′，５，５′ 四甲基联苯胺）ＴＭＢ显色液和碱性磷酸酶：阿拉丁生物试剂股份有限公司；
其他试剂：分析纯，市售；
犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７鼠源单抗（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ｍＡｂ）、犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７兔源多抗（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ｐＡｂ）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠ＩｇＧ抗体（ＨＲＰ ＩｇＧ）和碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠ＩｇＧ抗体（ＡＬＰ ＩｇＧ）：迈迪胺生物科技有限公司；
黑色９６孔酶标板：康宁有限公司；
菌种：大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ４３８８８）、鼠伤寒沙
门氏菌（ＡＴＣＣ１８Ｓ５１）、猪霍乱沙门氏菌（ＡＴＣＣ１０７０８）、
鸭沙门氏菌（ＡＴＣＣ９２７０）、肠炎沙门氏菌（ＡＴＣＣ
１３０７６）、单核增生李斯特菌（ＡＴＣＣ１３９３２）、蜡样芽孢杆
菌（ＣＩＣＣ２１４９３）、福氏志贺氏菌（ＣＭＣＣ２４５７）、大肠杆菌
Ｏ１５７：Ｈ７（ＳＲ０９８１Ｄ）、大肠杆菌（ＡＴＣＣ２５９２２）：江西省
疾病预防控制中心。

１．２　主要仪器
酶标仪：ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｉ３ｘ型，美谷分子仪器（上海）有
限公司；
透射电镜：ＪＥＭ２１００Ｆ型，捷欧路（北京）科贸有限公司；
恒温培养箱：ＧＺＸ ９２４６ＭＢＥ型，上海福玛实验设备
有限公司；
分析天平：ＦＡ１０２４型，梅特勒托利多科技（中国）有
限公司。

１．３　方法
１．３．１　ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ复合物制备　将５０ｎｍｏｌ的Ｃｕ２＋和
９０ｎｍｏｌ的ＰＰｉ加入到１３０μＬ含有８０ｎｍｏｌ的ＡＴ５０的
ＭＯＰＳ缓冲溶液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＭＯＰＳ，ｐＨ７．６）中混合均
匀，室温下避光孵育３０ｍｉｎ，得到ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ复合物。

１．３．２　荧光ＥＬＩＳＡ的操作步骤　用碳酸盐缓冲液（０．２ｍｇ／ｍＬ，ｐＨ９．６）稀释的ｐＡｂ（１０μｇ／ｍＬ，１００μＬ）作
为捕获抗体包被酶标板，在４℃条件下过夜包被，用
ＰＢＳＴ（按０．０５ｍＬ／１００ｍＬ将吐温２０加入到０．０２ｍｇ／ｍＬ
的１×ＰＢＳ中）洗板４次后拍干，然后加入２３０μＬ的封闭
剂（３ｍｇ／１００ｍＬＢＳＡ），在恒温培养箱中３７℃条件下封
闭２ｈ，用ＰＢＳＴ洗板后备用。

检测时将１００μＬ的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７菌液加入酶标
板，并设置阴性对照（１×ＰＢＳ，１００μＬ），在３７℃条件下孵
育１ｈ后用ＰＢＳＴ洗板；然后将ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ，１００μＬ）
作为检测抗体加入酶标板，在３７℃条件下孵育３０ｍｉｎ后
用ＰＢＳＴ洗板；将酶标二抗ＡＬＰ ＩｇＧ（３万倍稀释，
１００μＬ）加入酶标板，在３７℃条件下孵育３０ｍｉｎ后用
ＰＢＳＴ洗板；再加入１９０μＬ的ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ复合物，
３７℃条件下孵育６０ｍｉｎ，最后加入１０μＬ，１０ｍｍｏｌ／Ｌ的
抗坏血酸用酶标仪读取在３６５ｎｍ激发下６１０ｎｍ处的荧
光值。

１．３．３　关键参数优化　试验参数：Ｃｕ２＋浓度、ＰＰｉ浓度、
ＤＮＡ模板浓度、ＤＮＡ模板长度和抗坏血酸浓度，采用单
一变量的原则，对各个参数进行优化。

除１．３．３（１）外均在
１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７、１μｇ的ｍＡｂ、１μｇ
的ｐＡｂ和３万稀释的ＡＬＰ ＩｇＧ情况下进行。

（１）Ｃｕ２＋浓度优化：由于Ｃｕ２＋是影响ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ
复合物以及产生ＣｕＮＣｓ的关键因素，因此在缓冲溶液
（１×ＰＢＳ，ｐＨ７．６）中对其浓度进行优化。

在２０μＬ的
９
３
｜Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９曹文凯等：基于ｄｓＤＮＡ ＣｕＮＣｓ的荧光ＥＬＩＳＡ检测牛奶中的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７
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ＡＴ４０（１ｍｍｏｌ／Ｌ）、２０μＬ不同浓度的Ｃｕ２＋（１．５，２．０，２．５，３．０，３．５，４．０ｍｍｏｌ／Ｌ）、２０μＬ的ＰＰｉ（５ｍｍｏｌ／Ｌ）和１０μＬ的抗坏血酸（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）以及１３０μＬ的ＭＯＰＳ体系下，３７℃反应３０ｍｉｎ，考察不同浓度Ｃｕ２＋所形成的ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ复合物对荧光强度的影响。

（２）ＰＰｉ浓度的优化：在２０μＬ的ＡＴ
４０
（１ｍｍｏｌ／Ｌ），２０μＬ的Ｃｕ２＋（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２０μＬ不同浓度的ＰＰｉ（３．５，４．０，４．５，５．０，５．５ｍｍｏｌ／Ｌ）和１０μＬ的抗坏血酸（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）以及１３０μＬ的ＭＯＰＳ体系下，３７℃反应３０ｍｉｎ，通过信噪比犉／犉０（犉：阳性荧光信号值，犉０：阴性荧光信号值）来考察不同浓度ＰＰｉ所形成的ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ复合物对荧光强度的影响。

（３）ＤＮＡ模板长度的优化：在２０μＬ４ｍｍｏｌ／Ｌ不同
长度的ＤＮＡ模板（ＡＴ
２０、ＡＴ
３０
、ＡＴ
４０
、ＡＴ
５０
、ＡＴ
６０
）、
２０μＬ的Ｃｕ２＋（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２０μＬ的ＰＰｉ（４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）和１０μＬ的抗坏血酸（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）以及１３０μＬ的ＭＯＰＳ
体系下，３７℃反应３０ｍｉｎ，通过信噪比犉／犉
０
考察ＤＮＡ模板长度对荧光强度的影响。

（４）ＤＮＡ模板浓度的优化：在２０μＬ不同浓度的ＡＴ５０（０．５，１．０，２．０，４．０，８．０ｍｍｏｌ／Ｌ）、２０μＬ的Ｃｕ２＋（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２０μＬ的ＰＰｉ（４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）和１０μＬ的抗坏血酸（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）以及１３０μＬ的ＭＯＰＳ体系下，３７℃
反应３０ｍｉｎ，通过信噪比犉／犉
０
考察ＤＮＡ模板浓度对荧光强度的影响。

（５）抗坏血酸浓度的优化：在２０μＬ的ＡＴ
５０（４ｍｍｏｌ／Ｌ）、２０μＬ的Ｃｕ２＋（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２０μＬ的ＰＰｉ（４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）和１０μＬ不同浓度的抗坏血酸（６，８，１０，１２，１４ｍｍｏｌ／Ｌ）以及１３０μＬ的ＭＯＰＳ体系下，３７℃反应３０ｍｉｎ，通过信噪比犉／犉０考察抗坏血酸浓度对荧光强度的影响。

１．３．４　荧光ＥＬＩＳＡ检测犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７　在１．２．３的最优条件下，将１００μＬ不同稀释倍数下的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７（菌数为１×１０２，５×１０２，１×１０３，５×１０３，１×１０４，５×１０４，１×１０５，５×１０５，１×１０６，５×１０６，１×１０７，５×１０７，１×１０８，５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ），使用酶标仪测量荧光，激发波长３６５ｎｍ，发射波长６１０ｎｍ。

１．３．５　传统显色ＥＬＩＳＡ检测犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７　ＥＬＩＳＡ步骤同１．３．２。

加入ｍＡｂ孵育并洗板后，将３０００倍稀释的ＨＲＰ ＩｇＧ，加入酶标孔孵育３０ｍｉｎ并洗板后，加入１００μＬ的ＴＭＢ显色液，反应１５ｍｉｎ后加入２００ｎｍｏｌ的Ｈ２ＳＯ４终止液，用酶标仪读取４５０ｎｍ处的ＯＤ值。

１．３．６　荧光ＥＬＩＳＡ的特性鉴定
（１）灵敏度：以最低检测限（Ｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＬＯＤ）作为评价方法灵敏度的标准。

用超纯水稀释犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７，利用ＥＬＩＳＡ，通过ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ复合物水解恢复ＣｕＮＣｓ荧光作为信号输出方式。

以犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７菌数的对数值为横坐标，以荧光信号值为纵坐标，绘制荧光ＥＬＩＳＡ的标准曲线。

然后将空白样品进行２０次重复测定，根据标准曲线回归方程得到对应菌数，计算重复测定结果的平均值（珚Ｘ）和标准差（ＳＤ），以珚Ｘ＋３ＳＤ作为检测限［２０］。

（２）特异性：通过交叉反应试验鉴定检测方法的特异性。

利用荧光ＥＬＩＳＡ法分别检测犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７与相同浓度的其他菌种：大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＳＲ０９８１Ｄ）、大肠杆菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、鼠伤寒沙门氏菌（ＡＴＣＣ１８Ｓ５１）、猪霍乱沙门氏菌（ＡＴＣＣ１０７０８）、鸭沙门氏菌（ＡＴＣＣ９２７０）、肠炎沙门氏菌（ＡＴＣＣ１３０７６）、单核增生李斯特菌（ＡＴＣＣ１３９３２）、蜡样芽孢杆菌（ＣＩＣＣ２１４９３）和福氏志贺氏菌（ＣＭＣＣ２４５７）的荧光值对比来评估检测犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７的特异性。

１．３．７　精密度和准确度　在两种不同的牛奶样本中添加，低中高３种倍数稀释的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７，每个水平的添加样品利用荧光ＥＬＩＳＡ法重复检测３次，通过计算添加犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７的平均回收率和变异系数（ＣＶ）来鉴定方法的精密度和准确度。

２　结果与分析
２．１　荧光ＥＬＩＳＡ检测犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７的原理
试验方法的检测原理如图１所示。

当不存在目标菌犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７时，在ＥＬＩＳＡ孔中不会形成双抗夹
心
图１　基于ｄｓＤＮＡ ＣｕＮＣｓ的荧光ＥＬＩ７：Ｈ７原理
Ｆｉｇｕｒｅ１　ＳｃｈｅｍａｔｉｃｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＥＬＩＳＡｂａｓｅｄｏｎｄｓＤＮＡ ＣｕＮＣｓ
ｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７
０
４
安全与检测ＳＡＦＥＴＹ＆ＩＮＳＰＥＣＴＩＯＮ总第２６３期｜２０２３年９月｜
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结构，ＩｇＧ ＡＬＰ不会结合在ＥＬＩＳＡ孔中，因此ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ复合物不会被水解，并阻止抗坏血酸将Ｃｕ２＋在ｄｓＤＮＡ链上还原成Ｃｕ０＋形成ＣｕＮＣｓ。

当存在目标菌犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７时，ＩｇＧ ＡＬＰ会通过双抗夹心结构结合到ＥＬＩＳＡ孔中来水解ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ复合物，释放出的Ｃｕ２＋
会被抗坏血酸在ｄｓＤＮＡ上还原成Ｃｕ０＋形成ＣｕＮＣｓ，产生荧光信号。

试验通过测定荧光强度的变化来判断ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ是否会水解并产生荧光信号，设计了一种荧光ＥＬＩＳＡ来检测犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７。

２．２　用ＡＬＰ水解ＰＰｉ恢复ＣｕＮＣｓ用于检测的可行性分析 为了检验该ＥＬＩＳＡ用于检测犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７的可行性，即ＡＬＰ能否催化水解ＰＰｉ并恢复ＣｕＮＣｓ荧光，测定了ＡＬＰ存在与不存在时的荧光值。

如图２（ａ）所示，当在ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ复合体系中存在ＡＬＰ（２μＬ，１０Ｕ）时，会产生较强的荧光信号，如图２（ｂ）所示，形成的ＣｕＮＣｓ的粒径为５ｎｍ。

当不存在ＡＬＰ时，几乎没有荧光信号，以上结果表明，ＰＰｉ的存在会阻碍ＣｕＮＣｓ荧光的形成，并且通过ＡＬＰ来水解ＰＰｉ恢复ＣｕＮＣｓ荧光用于检测犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７是可行的。

２．３　试验条件优化
２．３．１　Ｃｕ２＋浓度优化　根据检测原理，Ｃｕ２＋是桥接ＥＬＩＳＡ以及ＣｕＮＣｓ荧光信号形成的关键因素。

因此，在缓冲溶液中，考察了Ｃｕ２＋对ＣｕＮＣｓ荧光信号的影响。

如图３所示，不存在ＰＰｉ时，荧光信号会随着Ｃｕ２＋浓度的增
图２　存在ＡＬＰ和不存在ＡＬＰ时的荧光强度和
投射电镜图
Ｆｉｇｕｒｅ２　ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｎｓｉｔｙｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅａｎｄａｂｓｅｎｃｅｏｆＡＬＰａｎｄｔｈｅｉｍａｇｅｏｆＴＥ
Ｍ
图３　Ｃｕ２＋浓度的优化
Ｆｉｇｕｒｅ３　ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣｕ２＋
加而升高，当Ｃｕ２＋浓度达到３．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，荧光信号达
到最高，当Ｃｕ２＋浓度达到４ｍｍｏｌ／Ｌ时，荧光强度降低，
可能是由于高浓度的Ｃｕ２＋在抗坏血酸的作用下，会生成
氧自由基来降解ｄｓＤＮＡ模板，导致荧光强度降低。

存在
ＰＰｉ时，随着Ｃｕ２＋浓度的增加，荧光信号随之升高的原因
是尽管一部分的Ｃｕ２＋会与ＰＰｉ配位形成ＰＰｉ Ｃｕ２＋ ＰＰｉ
复合物，但是过剩的Ｃｕ２＋仍会被抗坏血酸还原，形成
ＣｕＮＣｓ。

结果表明，Ｃｕ２＋的最佳浓度为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ。

２．３．２　ＰＰｉ浓度的优化　如图４所示，随着ＰＰｉ浓度的增
加，犉／犉
０
逐渐增加，当ＰＰｉ浓度达到４．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，
犉／犉０达到最大值，当ＰＰｉ浓度＞４．５ｍｍｏｌ／Ｌ时，犉／犉０开
始降低，可能是由于高浓度的ＰＰｉ不能完全被ＡＬＰ所水
解，过剩的ＰＰｉ通过强配位作用结合Ｃｕ２＋，抑制ＣｕＮＣｓ荧
光的产生。

因此，ＰＰｉ的最佳浓度为４．５ｍｍｏｌ／Ｌ。

２．３．３　ＤＮＡ模板长度优化　如图５（ａ）所示，随着
ｄｓＤＮＡ长度的增加，犉／犉０逐渐增加，当ｄｓＤＮＡ长度达到
５０ｂｐ时，犉／犉０达到最大值，之后犉／犉０不再发生明显变
化。

因此，ｄｓＤＮＡ的最佳长度为ＡＴ
５０。

２．３．４　ＤＮＡ模板浓度优化　如图５（ｂ）所示，随着ＡＴ５０
浓度的增加，犉／犉
０
逐渐增加，当ｄｓＤＮＡ浓度达到
４ｍｍｏｌ／Ｌ时，犉／犉０达到最大值，之后犉／犉０不再发生明
显变化。

因此，ＡＴ
５０
的最佳浓度为４ｍｍｏｌ／Ｌ。

２．３．５　抗坏血酸浓度优化　如图６所示，随着抗坏血
酸浓度的增加，犉／犉
０
逐渐增加，当抗坏血酸浓度达到
图４　ＰＰｉ浓度优化
Ｆｉｇｕｒｅ４　ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＰＰｉ
１
４
｜Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９曹文凯等：基于ｄｓＤＮＡ ＣｕＮＣｓ的荧光ＥＬＩＳＡ检测牛奶中的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７
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图５　ｄｓＤＮＡ长度和浓度的优化
Ｆｉｇｕｒｅ５　ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｄｓＤＮＡａｎｄｔｈｅｌｅｎｇ
ｔｈｏｆｄｓＤＮ
Ａ图６　抗坏血酸浓度优化
Ｆｉｇｕｒｅ６　Ｏｐ
ｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＡｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ
１０ｍｍｏｌ／Ｌ时，犉／犉０达到最大值，之后犉／犉０开始降低，可能是高浓度的还原剂会抑制ＣｕＮＣｓ荧光。

因此，抗坏血酸的最佳浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ。

２．４　检测方法的性能
２．４．１　灵敏度鉴定　稀释菌数为１×１０２，５×１０２
，１×１０
３，５×１０３，１×１０４，５×１０４，１×１０５，５×１０５，１×１０６
，５×１０６，１×１０７，５×１０７，１×１０８，５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ的犈．犮狅犾犻
Ｏ１５７：Ｈ７，经荧光ＥＬＩＳＡ检测后，以犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７菌数为横坐标，检测所得的荧光强度值为纵坐标，绘制的标
准校准曲线如图７所示，曲线的线性范围为５×１０４
～１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ，线性回归方程为狔＝２．１×１０７
ｌｇ（狓）－９×１０７，犚２＝０．９８０８，最低检出限为２．４×１０４
ＣＦＵ／ｍＬ。

如
图８所示，普通的ＨＲＰ催化ＴＭＢ显色ＥＬＩＳＡ的线性范
围为５×１０５～５×１
０７ＣＦＵ／ｍＬ，线性回归方程为狔＝０．４１ｌｇ
（狓）－１．１６，犚２＝０．９８３４，ＬＯＤ为３．３６×１０５
ＣＦＵ／ｍＬ。

相比而言，研究开发的荧光ＥＬＩＳＡ比传
统ＥＬＩＳＡ灵敏１４倍，
且检测线性范围更宽。

２．４．２　特异性鉴定　利用荧光ＥＬＩＳＡ法检测菌数为５×
１０６
ＣＦＵ／ｍＬ的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７和其他菌株。

以所测
定的荧光值作为评判该方法特异性的标准。

如图９所示，只有犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７存在时，才会恢复ＣｕＮＣｓ荧光，产生较高的荧光信号值。

由于方法建立所使用的
捕
图７　犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７定量分析荧光ＥＬＩＳＡ
标准校准曲线
Ｆｉｇ
ｕｒｅ７　ＳｔａｎｄａｒｄｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＥＬＩＳＡｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙ
ｓｉｓｏｆ犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ
７
图８　基于ＨＲＰ的传统犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７定量
分析ＥＬＩＳＡ标准曲线Ｆｉｇ
ｕｒｅ８　ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｔｈｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＥＬＩＳＡｂａｓｅｄｏｎＨＲＰｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙ
ｓｉｓｏｆ犈．犮狅犾犻获抗体的特异性较好，因此能够对单一菌株识别捕获，使检测方法显示出良好的特异性。

２．４．３　实际样本分析　为探讨该方法检测食品中犈．犮狅犾犻
２
４安全与检测ＳＡＦＥＴＹ＆ＩＮＳＰＥＣＴＩＯＮ总第２６３期｜２０２３年９月｜
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Ｆｉｇｕｒｅ９　ＴｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＥＬＩＳＡ
Ｏ１５７：Ｈ７的可行性，在两种牛奶样品中加入犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７进行分析，采用外标法评价了该方法的可行性。

结果见表１。

牛奶样品中，３个加标水平的平均回收率在９２．２％～１０８．５％，相对标准偏差４．９％～１０．４％，表明该检测方法准确性较好，可用于实际样品检测。

表１　实际样本中犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７的加标回收率
Ｔａｂｌｅ１　Ｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆ犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７ｉｎｒｅａｌｓａｍｐｌｅｓ
样本
加标浓度／
（ＣＦＵ·ｍＬ－１）
测定平均值／
（ＣＦＵ·ｍＬ－１）
回收率／
％
变异系
数／％
低脂牛奶１×１０５９２９６３９２．２７．３
５×１０５５１３２９３１０８．５４．９
１×１０６８７７１４６８６．０１０．４
脱脂牛奶１×１０５９５９１８９５．９８．７
５×１０５５１７４２８１０３．５１０．０
１×１０６９３９１９５９３．９７．６
３　结论
试验利用Ｃｕ２＋与焦磷酸盐的强配位原理，设计了一种基于碱性磷酸酶水解焦磷酸盐释放Ｃｕ２＋形成铜纳米团簇的荧光酶联免疫吸附技术，用于低脂和脱脂牛奶样本中犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７的检测。

在最佳条件下，犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７的菌数与荧光信号值在５×１０４～１×１０８ＣＦＵ／ｍＬ范围内呈良好的线性关系，最低检测限为２．４×１０４ＣＦＵ／ｍＬ比传统显色酶联免疫吸附技术灵敏１４倍，且检测线性范围更宽。

该方法特异性好、灵敏度高，在低脂和脱脂牛奶样本中回收率理想（９２．２％～１０８．５％），适用于犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７或其他病原微生物的灵敏检测。

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T??;U69>H<D7AB$MW"Z$)"（X）*)( XM%
（下转第９４页）
３
４
｜Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９曹文凯等：基于ｄｓＤＮＡ ＣｕＮＣｓ的荧光ＥＬＩＳＡ检测牛奶中的犈．犮狅犾犻Ｏ１５７：Ｈ７
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（上接第４３页）
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４９食品装备与智能制造ＦＯＯＤＥＱＵＩＰＭＥＮＴ＆ＩＮＴＥＬＬＩＧＥＮＴＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＩＮＧ总第２６３期｜２０２３年９月｜
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