改进的CTAB法提取32种中药破壁饮片DNA及物种鉴定

第16卷第22期·总第294期2018年11月·下半月
刊中国中医药现代远程教育CHINESE MEDICINE MODERN DISTANCE EDUCATION OF CHINA
中药破壁饮片[1]是中山市中智药业集团有限公司研发的一种创新型中药饮片，系指将符合法定标准要求
并具有细胞结构的植物类中药饮片，经现代粉碎技术
加工至D90<45μm（300目以上）的粉体，不添加成型剂制成30~100目的具有原饮片全成分的均匀干燥颗粒
状饮片。

中药破壁饮片在保证物质基础没有改变的前
提下，将物质成分利用率提高至90%以上，是传统饮
片煎煮提取的3倍以上，从而大幅度减少使用剂量。

这
对于资源紧缺的中药，尤其是贵重药材的可持续利用
具有重大的意义。

为了保证临床及日常使用的安全有
效，中药破壁饮片的真伪鉴别及其重要前提。

然而破
壁饮片经过破壁粉碎处理后，其粉体粒度非常小，失
去了传统中药饮片应有的性状特征和绝大部分的显微特征。

利用传统饮片法定标准中的性状鉴别和粉末鉴别法来鉴定中药破壁饮片真实性的可行性比较低。

因此，建立一种行之有效、可信可靠的方法来鉴定中药破壁饮片的真实性是非常有必要的。

DNA条形码是近年来发展迅速的可用于动植物物种快速鉴定的技术[2]，是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断技术，是近年来生物分类和鉴定的研究热点。

DNA条形码直接利用物种的遗传信息在分子水平上进行鉴别，为物种鉴定提供了最本质的依据。

DNA条形码作为新的分子鉴定技术，在物种鉴定方面有着其他技术无法比拟的优点：①技术指标相对统一：只需选用一个或少数几个合适的基因片段即可对整个属、科甚至几十个科的绝大部分物种进行准确的鉴定；②快速高效；③重复性和稳定性好；④试验过程标准化、简单化；⑤鉴
改进的CTAB法提取32种中药破壁饮片DNA
及物种鉴定
王艳1，2成金乐2*
（1广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心、岭南中药资源教育部重点实验室（广州中医药大学）、
国家中成药工程技术研究中心南药研发实验室，广东广州510006；
2国家中医药管理局中药破壁饮片技术与应用重点研究室，中山市中智药业集团有限公司，广东中山528437）
摘要:中药破壁饮片是由传统中药饮片经过气流破壁技术加工而成，已失去了原药材原有的外观性状特征，传统的鉴别方法已很难鉴别其真伪。

本研究选用ITS2序列作为DNA条形码对32个中药破壁饮片品种进行研究，验证DNA条形码技术应用于中药破壁饮片上的可行性。

通过提取32个品种的DNA、PCR扩增及双向测序获得ITS2序列，在中药材DNA条形码鉴定系统和NCBI数据库中进行比对。

实验结果表明：32个品种通过改良的CTAB法均能成功提取DNA，PCR扩增及测序后均能得到高质量的ITS2序列。

因此，基于ITS2序列的DNA条形码技术可有效地鉴定中药破壁饮片，为中药破壁饮片真伪鉴别提供有效手段。

关键词:中药破壁饮片；CTAB法；DNA条形码；中药鉴定
doi:10.3969/j.issn.1672⁃2779.2018.22.039文章编号：1672⁃2779（2018）⁃22⁃0089⁃
04
WANG Yan1,2,CHENG Jinle2*
(1.Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering,Guangzhou University of Chinese Medicine;Key Laboratory of
Chinese Medicinal Resource from Lingnan(Guangzhou University of Chinese Medicine),Ministry of Education;Joint Laboratory of National Engineering Research Center for the Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicines,Guangdong Province,Guangzhou,510006,China;
2.Key Laboratory of Technologies and Applications of Ultrafine Granular Powder of Chinese Materia Medica,State Administration of
Traditional Chinese Medicine,ZEUS Pharmaceutical Group,Guangdong Province,Zhongshan528437,China) Abstract:Ultrafine granular powder of Chinese medicine is processed by the traditional Chinese medicine decoction pieces through airflow breaking technology.It has lost the original appearance characteristics of the original medicinal materials,and traditional identification methods have been unable to identify its authenticity.We choose32varieties in this study,ITS2sequences were selected as DNA barcodes to study all varieties of ultrafine granular powder of Chinese medicine,to verify the feasibility of applying DNA barcode technology to ultrafine granular powder of Chinese medicine.ITS2sequence was obtained by extraction of32strains of DNA,PCR amplification and bidirectional sequencing.BLAST was performed in the barcode identification system and Pubmed database of Chinese herbal medicines.The result shows that DNA of32samples can be successfully extracted by modified CTAB method,and high quality ITS2sequences can be obtained after PCR amplification and sequencing.Therefore,based on the ITS2 sequence of DNA barcode technology can effectively identify the ultrafine granular powder of Chinese medicine,to provide a useful method for the identification of ultrafine granular powder of Chinese Medicine.
Keywords:ultrafine granular powder of Chinese medicine;CTAB method;DNA barcode;Chinese medicine identification
*通讯作者：gdcjl9@
89
第16卷第22期·总第294期2018年11月·下半月
刊
中国中医药现代远程教育
CHINESE MEDICINE MODERN DISTANCE EDUCATION OF CHINA
定信息的可管理性：试验所得的物种序列信息可通过互联网和信息平台等在全球范围内实现统一管理和资源共享，有利于构建系统、完整的DNA 条形码数据库。

与传统鉴定方法相比，DNA 条形码技术可快速有效地达到物种鉴定的目的，并且不受个体形态、大小、发育生长阶段和完整性的影响。

DNA 条形码是近年来发展迅速的可用于动植物物种快速鉴定的技术，因此也被广泛用于药用植物的物种鉴定工作中。

陈士林等[2]应用ITS2、psbA ⁃trnH 和COI 序列完成了《
中华人民共和国药典
》2010版208味中药材原动植物及1000余种混淆品种的DNA 条形码鉴定。

同时该课题组对6000余份药用植物样本进行DNA 条形码序列筛选，提出以ITS2(Internal Transcribed Spacer 2)作为药用植物标准DNA 条形码[3]，以psbA ⁃trnH 作为辅助的药用植物鉴定技术的思路[4]。

马新业等[5]研究发现psbA ⁃trnH 在药用蕨类中具有较高的PCR 扩增率和物种鉴定率，并建议psbA ⁃trnH 作为蕨类中药的DNA 条形码序列。

朱英杰等[6]对重楼属11个物种17份样品的psbA ⁃trnH 、rpoB 、rpoC1、rbcL 、
matK 和核ITS2序列进行分析，发现ITS2序列在重楼属中的鉴定成功率达到100%。

中药破壁饮片是一类创新型中药饮片，经过破壁处理后已完全失去外观形状，无法进行传统的性状鉴别。

同时，由于破壁粉末粒径极小，显微特征也大多缺失。

因此，传统鉴定方法已不能适用于破壁饮片的鉴别，而DNA 条形码正好提供了一个强大的鉴别手段。

《中华人民共和国药典》（2010年版第三增补版）收录了DNA 条形码技术，作为中药材质量控制的新方法[7]。

近几年来，相关课题组成员已针对中药破壁饮片的DNA 条形码鉴别展开了一系列的科研实验，并且已经利用psbA ⁃trnH 片段鉴定罗汉果和山药破壁草本[8]。

向丽等[9]选用ITS2序列作为DNA 条形码对全草类、根及根茎类、叶类、花类、果实类和种子类的31种代表性中药(28个物种)的原药材、超微饮片及破壁饮片共93份样品进行研究，验证DNA 条形码技术对中药超微饮片和中药破壁饮片基原物种追溯的可靠性。

DNA 条形码技术近年来在中药的鉴定应用方面的推广，为破壁饮片等粉末或颗粒状中药制品的物种鉴定提供了很好的技术参考。

DNA 条形码在破壁饮片的物种鉴定的成功应用，也对后者的质量控制发挥了重要的作用。

而对于DNA 提取的方法，通过实验研究也有很多种，如氯化铯法、SDS 法和一管法等[10]，并把它运用在动、植物和微生物的DNA 研究中。

由于这些DNA 提取方法有的成本高和使用会造成环境污染，且提取效果不够理想。

随着这一技术逐步改进，如Saghai ⁃Maroof 等[11]研发出十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法用于提取植物DNA 等，使得DNA 的提取相对较为快捷，提取的DNA 质量较高。

本实验应用改良的CTAB 法提取32个中药破壁饮片品种的DNA ，以ITS2为鉴定序列，其方法简单可行，能高效达到提取样品中的DNA 并测序成功及物种鉴定。

1基本原理
利用CTAB 在高离子强度的缓冲溶液中与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不沉淀核酸的特性，用离心获得含DNA 的上清液；用氯仿和异戊醇混合液使蛋白质变性、分层，同时除去脂类的方法，从而达到提取和纯化DNA 的目的。

2材料及仪器
2.1实验材料白芍（批号：20141205）、大枣（批号：20141208）、槐花（批号：20140722）、荷叶（批号：20140901）、鸡骨草（批号：20141216）、木棉花（批号：20141231）、人参（批号：20141221）、熟三七（批号：20141202）、山银花（批号：20141214）、太子参（批号：20141207）、盐补骨脂（批号：20141203）、薏苡仁（批号：20140729）、枳实（批号：20140326）、木瓜（批号：20141205）、百合（批号：20140805）、葛花（批号：20140715）、莲子、（批号：20140729）、白术（批号：201709P001）、白芷（批号：20170502）、川芎（批号：20171201）、桔梗（批号：20170701）、女贞子（批号：20170602）、肉苁蓉（批号：20170801）、玄参（批号：20170701）、白茅根（批号：170801）、炒麦芽（批号）、佛手（批号：170901）、柯
子（批号：C ⁃170157）、南沙参（批号：B705101⁃01）、桑葚（批号：171001）、冬凌草（批号：A170601）、五指毛桃（批号：170102）
2.2试剂主要有NaCl 、EDTA 、Tris 、HCl 、CTAB 、β⁃巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、PVP ⁃40等。

2.3实验仪器生物样品均质仪（爱施德，Bioprep ⁃24）、低温冰箱（Eppendorf ，5430R ）；多功能PCR 仪（Biometra ，Flex Cycler 2）；水平电泳仪（Bio ⁃Rad ）；凝胶成像仪（Biometra ，BDA digital ）。

3实验方法
3.1CTAB 溶液的配制CTAB 缓冲液配制如表1。

3.2DNA 提取取已研磨好的样品50mg ，向各样品管中加入800μL 核分离液（100mmol/L Tris ⁃HCl ，20mmol/L EDTA ，0.7mol/L NaCl ，20g PVP ⁃40，2mL β⁃巯基乙醇）剧烈振荡，旋转混匀5min ，12000r/min 离心3min ，
弃去上清液，重复上述步骤1~2次；向各样品管中加入表13%CTAB （1000mL ）缓冲液配制成分表
最终浓度试剂名加入量3%
1.4mol/l 20mmol/l
100mmol/l
CTAB
NaCl
0.5mol/LEDTA pH 8.0
1mol/LTris-HClpH 8.0
PVP-40β-巯基乙醇
H 2O 30g
280mL 40mL 100mL 20g 2mL 定容至刻度
90
第16卷第22期·总第294期2018年11月·下半月
刊中国中医药现代远程教育CHINESE MEDICINE MODERN DISTANCE EDUCATION OF CHINA
800μL3%CTAB缓冲液，充分振荡混匀，65℃金属浴中孵育3h，期间每隔10min左右颠倒混匀数下。

加入600μL氯仿-异戊醇（24∶1，V∶V），充分振荡混匀，12000r/min离心10min，小心吸取上清于新的1.5mL离心管中。

加入等体积-20℃预冷的异丙醇，分次转移至吸附柱中12000r/min离心1min，弃去下液。

加入700μL -4℃预冷的75%乙醇，12000r/min离心1min，弃尽下液，继续加入500μL-4℃预冷的75%乙醇，上下颠倒混匀数次，12000r/min离心1min，弃尽下液，将空管离心1min，取出加入50μL65℃预热的dd H2O，12000r/min离心1min，置于-20℃保存，备用。

3.3PCR扩增及测序PCR反应体系：2×Power Taq PCR Master Mix（百泰克，PR1701）12.5μL，正反向引物：ITS2⁃2F，ATGCGATACTTGGTGTGAAT；ITS2⁃3R，GACGCTTCT⁃CCAGACTACAAT各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH2O补足体积至25.0μL；阴性对照（Negative control，NC）采用ddH2O作为模板。

温度程序（ITS2）：94℃，4min；94℃，30s；52℃，30s；72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

反应完成后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测各PCR产物，在目的区域出现清晰条带的样品则送检做Sanger测序[12]。

3.4数据处理将测序所得的原始峰图导入Codon-CodeAligner（Version5.1.5.0）进行序列处理，去除5.8SrRNA和28SrRNA区以获得ITS2序列。

将各样品的ITS2序列作为Quary分别在NCBI、中药材DNA条形码鉴定系统（/china/index.php?op-tionid=174）上做比对，取同源性最高的比对结果。

4实验结果
利用ITS2片段可以成功鉴定出本研究中的32个中药破壁饮片品种，各样品的ITS2序列比对结果与公共数据库中已有序列的同源性达到95%以上。

结果见表2。

5讨论
中药破壁饮片通过气流破壁技术导致(下转第130页)
表2ITS2比对结果
白芍大枣槐花荷叶鸡骨草木棉花人参熟三七山银花太子参盐补骨脂薏苡仁枳实木瓜百合葛花莲子白术白芷川芎桔梗女贞子肉苁蓉玄参白茅根炒麦芽佛手柯子南沙参桑葚冬凌草五指毛桃227
221
221
239
214
237
237
230
228
228
233
224
231
221
237
241
243
229
227
227
261
223
233
222
220
221
231
215
273
236
212
234
Paeonia lactiflora
Ziziphus jujuba
Sophora japonica
Nelumbo nucifera
Abrus pulchellus subsp.cantoniensis
Gossampinus malabarica
Panax ginseng
Panax notoginseng
Lonicera macranthoides
Pseudostellaria heterophylla
Psoralea corylifolia
Coix lacrymajobi var.mayuen
Citrus sinensis
Chaenomeles speciosa
Lilium brownii var.viridulum
Pueraria montana var.lobata
Nelumbo nucifera
Atractylodes macrocephala
Angelica dahurica var.formosana
Ligusticum chuanxiong
Platycodon grandiflorus
Ligustrum lucidum
Cistanche tubulosa
Scrophularia ningpoensis
Imperata cylindrica var.major
Hordeum vulgare subsp.vulgare
Citrus medica var.sarcodactylis
Terminalia chebula
Adenophora tetraphylla
Morus rubra
Rabdosia rubescens
Ficus hirta
ZL-02
S0104
RC-HL048
X430
JF421457
TB06
U41682
Y1301030
YC0163MT26
S41
RC-BGZ10
S0726
TC11-2
cn01
HQ692122
JN407471
X430
YZSB13-3
NN007303
TH6
YC001MT61
YC0028MT15
JF915386
S1575
S265
HQ600510
JN681157
HEZ02
SLY012
FJ605516
YZY00803-387
JQ773899
100
100
99
97
100
100
100
100
100
100
100
100
99
95
99
98
97
100
100
98
100
100
100
99
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
99.5
100
100
100
100
100
100
100
99.6
96.2
99.6
97.5
98.7
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
99.6
Paeonia lactiflora
Ziziphus jujuba
Sophora japonica
Nelumbo nucifera
Abrus pulchellus subsp.
Bombax malabaricum
Panax ginseng
Panax notoginseng
Lonicera macranthoides
Pseudostellaria heterophylla
Cullen corylifolium
Coix lacrymajobi var.mayuen
Citrus aurantium
Chaenomeles speciosa
Lilium brownii var.viridulum
Pueraria montana var.lobata
Nelumbo nucifera
Atractylodes macrocephala
Angelica dahurica
Ligusticum chuanxiong
Platycodon grandiflorus
Ligustrum lucidum
Cistanche tubulosa
Scrophularia ningpoensi
Imperata cylindrica var.major
Hordeum vulgare subsp.vulgare
Citrus medica var.sarcodactylis
Terminalia chebula
Adenophora triphylla
Morus alba
Rabdosia rubescens
Ficus hirta
KX675027.1
KT898240.1
KT285086.1
DQ901015.1
KT285148.1
KJ419303.1
KX271137.1
KT380921.1
KU904446.1
KX158334.1
KT285151.1
KX675135.1
KX675070.1
JQ392417.1
HM045448.1
JN407471.1
KX675053.1
KX675099.1
KX674999.1
AY548231.1
MF349068.1
JF976847.1
GQ434562.1
KX073930.1
MF096425.1
KP008150.1
KT285091.1
MF096796.1
KY829521.1
MF370370.1
KT285127.1
KX055718.1
品种
长度
（bp）
TCM条形码鉴定系统比对结果NCBI比对结果
91
第16卷第22期·总第294期2018年11月·下半月
刊
中国中医药现代远程教育
CHINESE MEDICINE MODERN DISTANCE EDUCATION OF CHINA
(上接第91页)其形态及外观特征发生改变，难以对物种进行准确的鉴定。

本文运用DNA 条形码技术对32个中药破壁饮片品种进行物种鉴定。

实验结果表明改良的CTAB 法对于一些炮制过的样品也能成功地提取出DNA ，同时也说明破壁技术未对药材的遗传物质产生破坏。

在实验研究初期，也尝试使用试剂盒法提取DNA ，结果都不理想，而采用改良的CTAB 法能达到提取及鉴定的效果。

用3%CTAB 进行提取，比常规的CTAB 法提取出来的DNA 更纯，由于植物组织，如叶片
中含有较高的多酚、蛋白质、脂类、多酯的角质等不利于DNA 提取过程中干扰物质的去除，利用常规的CTAB 方法等难以获得高质量DNA 。

主要原因是提取所得的DNA 样品中含有较高含量的蛋白质，甚至具有多酚氧化的褐色物等，从而影响利用DNA 进行进一步的特性分析（如酶切，PCR 反应等）。

运用DNA 条形码技术对中药破壁饮片进行鉴定可以不受药材外部形态不完整或已被加工成粉末、饮片的影响，能直接在分子水平上对中药材进行快速准确鉴定，为中药破壁饮片的真伪鉴别提供有效手段。

参考文献
[1]成金乐，赖智填，彭丽华.中药破壁饮片研究[J].世界科学技术⁃中医药现
代化，2014，40(13):254⁃262.
[2]陈士林.《中国药典》
中药材DNA 条形码标准序列[M].北京:科学出版社，2015:3.[3]陈士林，姚辉，韩建萍，等.中药材DNA 条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药杂志，2013，38(2):141⁃148.[4]辛天怡，李西文，姚辉，等.中药材二维DNA 条形码流通监管体系研究[J].中国科学:生命科学，2015，45(7):695⁃702.
[5]马新业.药用蕨类植物DNA 条形码筛选和评价[D].北京：
中国医学科学院，北京协和医学院药用植物研究院，2010.[6]朱英杰，陈士林，姚辉，等.重楼属药用植物DNA 条形码鉴定研究[J].药学学报，2010，45(3):376⁃382.
[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:中国医药科技出版社，2010:92⁃94.[8]郑夏生，赖智填，成金乐.利用psbA ⁃trnH 片段鉴定罗汉果和山药破壁草本[J].安徽农业科学，2016(6):163⁃166.
[9]向丽，汤欢，成金乐，等.超微破壁饮片DNA 条形码基原物种追溯[J].药学学报，2015(12):1660⁃1667.[10]HersheyA D ，ChaseM.Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage[J].Journal of General Physiology ，1952，36（1）:39⁃56.[11]Saghai ⁃Maroof M A ，SolimanK M ，GorgensenR A ，et al.Riboso ⁃mal DNA spacer ⁃length polymorphism in barley:Mendelian inherit ⁃ance ，chromosomal location and population dynamics[J].Proceed ⁃ings of the National Academy of Sciences of the USA ，1984，81（24）：8014⁃8018.[12]郑夏生，赖智填，成金乐.DNA 条形码在中药破壁饮片物种鉴定的应用[J].中国现代中药，2016，18(7):846⁃850.
（本文编辑：李海燕本文校对：史军杰收稿日期：2018⁃07⁃06）
交感神经受到激惹时椎动脉痉挛，椎⁃基底动脉血流量下降。

于腾波等[12]通过观察发现在刺激颈上神经节、颈中神经节、颈下神经节时，基底动脉血流量与基线血流比较都呈负向变化。

张清等[13]应用不同强度的电压，刺激猫的颈交感神经时，发现，随着刺激强度的逐渐增加，椎动脉的血流量的下降趋势越明显。

由此证明了病理因素对椎动脉的刺激比对椎动脉的压迫更能够引起椎动脉痉挛、椎基底动脉系统血流障碍。

深灰交通支和椎神经丛可因Luschka 关节上的骨赘而受到刺激和激惹。

发于颈中节的交感神经在钩状突水平的椎动脉周围形成一个神经环。

发于颈神经的分支向椎动脉前侧表面扩展，该分支与颈神经根一起围绕椎动脉形成神经襻。

当椎动脉被钩状突的骨赘改变位置时，椎动脉表面的神经环和神经襻可因牵拉受到刺激，使椎动脉痉挛，从而产生椎动脉型颈椎病的一系列症状和体征[10]。

此外，还有许多临床证据表明，机械压迫可能不是造成椎⁃基底动脉血流障碍的根本原因[15]，而交感神经受到激惹才是主要病因，这主要表现在如下：许多椎⁃基底动脉血流障碍患者的症状与颈椎骨赘的大小不呈平衡性；对于椎动脉走行异常、存在血管扭曲的病人，经椎动脉周围交感神经剥离或颈椎稳定性植骨后，血管扭曲和骨赘虽无改变，但术后症状减轻或消失；对椎⁃基底动脉血流障碍患者行星状神经节埋线治疗取得了较满意的效果。

在临床工作中，常见颈椎病的患者中，大多数，是由于颈部的疼痛不适继发，而引起一些头晕头痛以及视觉障碍等，为主要表现的症状。

临床上应用星状神经节
为主埋线治疗颈椎病，可以改善颈椎周围内部与外部环境，同时可刺激到相应组织中的神经和血管，使得患者症状减轻或者消失的效果[7]。

本次临床研究也证明了星状神经节埋线对颈椎病有一定的疗效，值得临床推广。

参考文献
[1]高丙南，胡浩然.推拿治疗颈椎病的体会[J]，中国中医药现代远程教育，
2011，9（5）：51⁃52.
[2]程平平.颈痛颗粒配合牵引疗法治疗神经根型颈椎病的临床疗效观察[D].河南中医学院，2015.
[3]陈孝平，
汪建平.外科学[M].8版.本科临床/十二五普通高等教育本科国家级规划教材.北京：人民卫生出版社，2017⁃05.[4]国家中医药管理局.《中医病症诊断疗效标准》.1995.
[5]朱明祖，黄再庆，
付秀丽.五步推拿法治疗神经根型颈椎病的疗效观察[J].中国中医骨伤科杂志，2010，18（12）：20⁃21.
[6]杨才德，雒成林.穴位埋线疗法[M].北京：中国中医药出版社，2015（9）.
[7]杨才德.埋线针刀百问百答[M].北京：中医古籍出版社，2016（9）.[8]陈静.推拿治疗颈椎病336例[J].中医外治杂志，2009，18（1）：45.
[7]石学敏，杨才德.星状神经节埋线治百病[M].2017（11）.
[8]邵福元主编.颈肩腰腿痛应用解剖学[M].郑州河南科学技术出版社，2000（10）：62⁃272.
[9]朱明双，郑重，
黄勇.注射硬化剂制作家兔椎动脉型颈椎病模型[J].中医正骨，2000，12(12)：11.[10]张军，齐越峰，孙树椿.椎动脉与颈交感神经的解剖关系在椎动脉型颈椎病发病学中意义[J].中国骨伤，2001，14（12）：737⁃738.
[11]冯世庆.椎动脉外膜剥离术的基础和临床研究[J].中国脊柱脊髓杂志，1998，8(1)：6⁃9.
[12]于腾波，
等.交感神经因素对椎基底动脉血流影响的实验研究[J].中国脊柱脊髓杂志，2000，10(3)：157⁃159.
[13]张清，佟大伟，
孙树椿.刺激椎神经对椎动脉血流量影响的实验研究[J].中国骨伤，2001，14(10)：599⁃600.
[14]谢琪.针刀联合手法治疗颈型眩晕的临床疗效和生活质量评价[D].南方医科大学，2017：95.
[15]张军，齐越峰，
孙树椿.椎动脉与颈交感神经的解剖关系在椎动脉型颈椎病发病学中意义[J].中国骨伤，2001（12）：33⁃34.
（本文编辑：李海燕本文校对：李强强收稿日期：2018⁃09⁃27）
(未完待续)
130。