《大肠癌干细胞样细胞转移相关基因

《大肠癌干细胞样细胞转移相关基因
的筛选及克隆分析》项目总结报告
浙江大学医学院附属二院朱永良
一、项目研究背景
大肠癌是我国常见的发病率呈明显上升趋势的恶性肿瘤之一。

在我国大肠癌是第4位肿瘤死亡病因。

浸润转移是大肠癌主要的恶性生物学行为和治疗失败的
原因。

阐明大肠癌的浸润转移和复发机制是进行有效治疗的基础，对提高大肠癌患者的生存期限和生活质量有重要意义。

大肠癌的发生起源于大肠干细胞，是大肠干细胞的疾病。

遗传性和散发性大肠癌均来源于正常大肠干细胞的突变，大肠干细胞是突变的标靶。

当大肠干细胞突变累积至一定阶段即转化为大肠癌干细胞，启动癌变过程，并不断出现异常分化。

在大肠癌组织中存在极少量的大肠癌干细胞、大量有限增殖能力的暂时放大和终末分化癌细胞。

暂时放大或终末分化癌细胞群，细胞已出现分化，体内增殖不活跃。

大肠癌干细胞在大肠癌中充当干细胞角色，具有无限的自我更新能力和多种分化潜能。

大肠癌的浸润转移包括癌细胞侵袭和破坏其周围正常组织、降解周围基底膜，侵入淋巴道/血道，经转运在靶组织器官停留，定植生长等过程。

在此过程中并不是每一个肿瘤细胞都能成功的进行转移，只有极少数具有高度转移潜能和增殖活性并在侵袭过程中逃逸各种杀伤因素，适应并协调继发生长的大肠癌“种子”细胞才能在靶组织器官增殖形成转移灶。

那些具有高度转移潜能和增
殖活性的“种子”可能就是肿瘤干细胞。

尽管目前我们对大肠癌干细胞的生物学特性还缺少了解，但近年的研究提示大肠癌恶性生物学行为如浸润、转移和复发与大肠癌干细胞潜能密切相关。

我们在先前以自行建立的具有干细胞特征的条件永
生化大肠干(crypt)细胞为实验靶点，研究大肠癌癌变过程中的分子改变事件。

发
现条件永生化大肠干(crypt)细胞经分别/组合的不同致/促癌剂攻击后出现的转化细胞接种裸鼠2月后，可在裸鼠肝脏均出现广泛转移。

提示转化大肠干(crypt)细胞具有侵袭力。

但对大肠癌干细胞的基因表达特征，其中有哪些基因参与了其浸润转移机制目前尚不明了。

研究大肠癌干细胞生物学行为改变以及与其转移相
关的关键功能靶蛋白是大肠癌靶向治疗的基础，也是治疗的靶向特异性所在。

二、研究目标
用鉴定的大肠癌干细胞分选标志从人大肠癌组织中分离肿瘤干细胞，用先前构建的大肠干(crypt)细胞全基因cDNA/pEYK3重组逆转录病毒文库技术，结合体外细胞侵袭试验，以Akt、MAPK、FAK、Wnt、Notch和Hedgehog信号通路为主要研究对象，筛选和鉴定与大肠癌干细胞转移潜能相关的关键功能靶蛋白及其
调控分子。

三、项目研究技术路线
1）Delta pLXSN逆转录病毒克隆载体构建。

用高保真PCR和定点突变技术改建pLXSN逆转录病毒载体(delta pLXSN)，使之多克隆位点包含polyT，可以进行T/A克隆。

2）大肠癌干细胞样细胞分离。

从新鲜大肠癌组织中用FCM分选出肿瘤干细胞样细胞和普通肿瘤细胞。

3）大肠癌转移相关候选基因筛选。

大肠癌干细胞样细胞和肿瘤转移组织总RNA 经逆转录、合成双链cDNA，克隆至delta pLXSN逆转录病毒载体，建立人大肠癌干细胞样细胞cDNA逆转录病毒文库，感染正常大肠干细胞系、普通大肠癌细胞系和用FCM去边缘细胞的体外培养大肠癌细胞系，分别接种
NOD/ SCID裸鼠盲肠，建立NOD/ SCID鼠肿瘤转移模型。

回收转移肿瘤组织中包含的大肠癌干细胞样细胞相关cDNA，建立大肠癌干细胞样细胞转移相关cDNA逆转录病毒亚文库，再进行上述流程重复。

最后，用PCR技术从经3-4轮重复后的转移肿瘤组织中扩增与大肠癌干细胞样细胞转移相关的、具有生物学活性的候选基因，DNA测序。

4）大肠癌转移相关候选基因验证。

将上述筛选出的肿瘤转移相关候选基因分别用免疫组织化学法和Real-time PCR/Northern原位杂交技术在人正常大肠组织、癌旁组织、癌组织、转移淋巴结、肝组织和大肠癌高、低转移细胞株中
进行验证。

四、项目研究内容
在本研究中我们首先采用在引物5’端加入polyA的方法，分别对野生型pLXSN、pLPCX、pLNCX逆转录病毒载体进行了改建。

以pLXSN、pLPCX、pLNCX 质粒为模板，用高保真、长序列PCR进行了扩增，经电泳纯化和复性后获得了多克隆位点包含polyA的ΔpLXSN逆转录病毒载体，使之可以进行T/A克隆。

其次，我们建立了大肠癌干细胞样细胞的分选流程。

由于CD133已被明确是大肠(癌)干细胞的特征性标志，考虑到从原代组织中分离大肠癌干细胞方法的实用性。

因而我们建立了用免疫磁珠技术从原代组织中分离大肠癌干细胞的方法，方
法原理见图1。

我们先将原代组织漂洗除菌，然后用胶原酶/透明质酸酶将原代组织消化成单个细胞，加入鼠抗人CD133抗体，反应后离心洗涤2次，加入羊抗鼠IgG磁珠，反应后放入磁场，分离出大肠癌干细胞和普通大肠癌细胞。

进一步探讨了原代大肠癌干细胞的体外培养条件。

发现无血清培养液和鼠成纤维细胞
MEF可支持大肠癌干细胞生长（图2）。

为分析大肠癌干细胞样细胞参与大肠癌转移相关候选基因筛选。

我们对大肠
癌干细胞样细胞和肿瘤转移组织总经逆转录、合成双链cDNA，克隆至ΔpLXSN逆转录病毒载体，建立人大肠癌干细胞样细胞cDNA逆转录病毒文库，感染正常大肠干细胞系、普通大肠癌细胞系和去边缘细胞的体外培养大肠癌细胞系，分别接种裸鼠的方法筛选转移相关候选基
图1. 免疫磁珠技术从原代组织中分离大肠癌干细胞图示
图2. 原代大肠癌干细胞体外培养条件优化
因。

最后，用PCR、DNA测序和U133plus2.0 (Affymetrix)基因表达差异谱芯片的方法我们从大肠癌干细胞样细胞中筛选到了包括NADE3 (即hBex1, 筛选编号：Rex3)、pcdh10、HDGF、pcdh23、Reelin、JKK等约30个功能基因在大肠癌干细胞样细胞中出现了改变(图3)。

尽管这些基因在正常大肠组织、癌旁组织、癌组织、
a b c
图3. 大肠癌干细胞样细胞(a)和普通大肠癌细胞(b) 基因表达差异谱扫描和聚类分析(c)
转移淋巴结、肝组织和大肠癌高、低转移细胞株中出现了相应的改变，但是重新表达这些基因又对细胞产生何种影响呢？因而我们在这儿选择了最具显著下调
的NADE3进行了研究，发现在大肠癌干细胞样细胞中NADE3表达下调近千倍，抑制其启动子甲基化尚不能恢复其表达，Western blot检测也显示了相应的改变(图4)。

从SW1116大肠癌细胞系中克隆了其全长cDNA序列并克隆到了pEGFP-c1真核细胞表达载体，建立了稳定表达NADE3的发现SW1116大肠癌细胞系，发现NADE3蛋白表达以胞浆为主，少量出现在胞核中，提示NADE3蛋白可在胞浆和胞核出现穿梭，但其穿梭分子机制有待于进一步研究。

图4. NADE3在大肠癌干细胞样细胞中表达下调和分析重新表达NADE3的细胞定位
重新表达NADE3对细胞功能产生何种影响呢？我们用蛋白芯片检测比较了
表达NADE3 细胞和对照空载体细胞在细胞信息通路中的改变状况(图5)。

结果发现重新表达NADE3激活了Mek1/2和JKK。

提示NADE3可能通过CDC42/Rac 激活Rho A通路(图6)。

然而，NADE3并不能被CDC42/Rac抗体免疫共沉淀，提示在NADE3和CDC42/Rac之间存在其他的功能分子，进一步我们再次用
U133plus2.0 (Affymetrix)基因表达差异谱芯片比较检测了NADE3沉默和重新表达细胞间出现的基因表达改变，发现先前筛选到的pcdh10，而不是pcdh23在NADE3重新表达细胞出现了一致的改变。

提示NADE3 (Rex3)和PCDH10之间存在下班、相互作用。

另外发现重新表达NADE3可促进细胞在无血清下的增殖，可能可影响p27kip蛋白在胞浆、核的定位和提高对化疗药物顺铂的凋亡敏感性(图7)。

PCDH10是属于Ca2+依赖性钙粘蛋白超家族的一员，具有6个重复串联的胞外区和1个独特的胞内区。

在对原代肿瘤干细胞基因表达谱时用病毒文库技
术筛选时发现pcdh10-/-细胞易游出和穿过“Transwell”的半透膜，而pcdh10+/+的细胞迁移性较弱。

通过生物信息学分析，进一步克隆了pcdh10的全长cDNA序列并构建了表达pcdh10的真核细胞表达载体，通过脂质体瞬时转染K562细胞、SW480大肠癌细胞发现异位表达PCDH10抑制了这些细胞在体外的增殖，并增加了细胞的凋亡。

进一步发现对这些细胞进行无血清饥饿和添加化疗药物等处理
后PCDH10表达水平随时间和浓度的增加而增加，提示PCDH10参与了细胞凋亡，可能是一个肿瘤抑制基因。

然对其参与细胞凋亡的分子机制尚不明了。

为探讨PCDH10在大肠癌组织中的表达改变，我们用1种针对PCDH10胞外区的单抗和多抗时发现PCDH10在大肠癌组织中并无明显的改变。

而用针对C末端的引物进行PCR扩增时发现在大肠癌干细胞样细胞中出现了显著的转录下调，表
明PCDH10在大肠癌细胞中出现了剪拼改变，PCDH10 C端蛋白分子片段可能链接了1个独特的细胞信息转导通路，因次我们制备了一种针对PCDH10 C端蛋白分子片段的特异性抗体，为进一步研究该蛋白功能打下了基础。

hBex1(NADE3) Control
图5. 蛋白芯片检测比较重新表达NADE3对细胞信息通路影响
图6. 重新表达hBex1/NADE3激活了Mek1/2和JKK
a
b
c
图7. 表达NADE3促进细胞在无血清下的增殖(a)，和影响p27kip蛋白在胞浆、核的定位(b)及提高对化疗药物顺铂的凋亡敏感性(c)
五、项目研究成果
本项目研究大肠癌干细胞样细胞中出现NADE3、pcdh10、HDGF、pcdh23、Reelin、JKK等约30个功能基因改变，首次发现了PCDH10 C端蛋白分子片段可能链接了1个独特的细胞信息转导通路；获得了1个一种针对PCDH10 C端蛋白片段
分子的特异性抗体。

目前已申请国家发明专利1项，采用该项目相关技术平台已
发表SCI论文4篇，当年总影响因子17.369。

1. Zhu YL, Wang CH, Huang J, et al. The Helicobacter pylori virulence factor CagA promotes
Erk1/2-mediated Bad phosphorylation in lymphocytes: a mechanism of CagA-inhibited lymphocyte apoptosis. Cellular Miocrobiology, 2007, 9: 952–961 (通讯作者) (SCI收录)
2. Luo C, Zhu Y, Jiang T, Lu X, Zhang W, Jing Q, Li J, Pang L, Chen K, Qiu F, Yu X, Yang J,
Huang J. Matrine induced gastric cancer MKN45 cells apoptosis via increasing pro-apoptotic molecules of Bcl-2 family. Toxicology. 2007, 229:245-252. (SCI收录)
3. Mao J, Xu Z, Fang Y, Wang H, Xu J, Ye J, Zheng S and Zhu Y. Hepatoma-derived growth
factor involved in the carcinogenesis of gastric epithelial cells through promoted the cell proliferation by Erk1/2 activation. Cancer Science.2008,99:2120-2127.(通讯作者) (SCI收录) 4.Ding KF, Su YY, Pang LR, Lu QH, Wang ZH, Zhang SZ, Zheng S, Mao JS, and Zhu Y.
Inhibition of apoptosis by down-regulation of hBex1, a novel mechanism, contributes to the chemoresistance of Bcr/Abl+ leukemic cells. Carcinogenesis.(2008.11.1接受发表，通讯作者) (SCI收录)
5.申请专利名称：制备一种针对PCDH10 C端蛋白片段分子的特异性抗体方法(受理号：200810060201.5)
六、项目主要创新点
1. 构建了逆转录病毒文库；
2. 建立了原代大肠癌干细胞样细胞分离流程；
3. 获得了大肠癌细胞转移相关功能基因；
4. 并对部分大肠癌细胞转移相关基因的生物学功能进行了研究
5.申请专利“制备一种针对PCDH10 C端蛋白片段分子的特异性抗体方法”具有自
主知识产权。

七、经费资助及使用情况说明
均按照合同规定使用。

到位总经费6万元。

经费开支内容支出
经费
其中省
自然基金
配套经费使用说明
1．设备费0.0000 0.0000
2．能源材料费 4.9012 4.9012 试剂及材料费3．试验外协费0.0000 0.0000
4．资料印刷费0.0000 0.0000
5．会议及调研费0.0600 0.0600 调研费
6．租赁费0.0000 0.0000
7．鉴定验收费0.0000 0.0000
8．人员经费0.6000 0.6000 按规定10％9．管理费0.3000 0.3000 按规定5％。

10．其他费用0.0000 0.0000 结余经费0.1388 0.1388。