一种基于电致化学发光检测双酚A的方法[发明专利]

(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.12.10
C N 104198548
A (21)申请号 201410430465.0
(22)申请日 2014.08.28
G01N 27/26(2006.01)
G01N 27/30(2006.01)
(71)申请人福建出入境检验检疫局检验检疫技
术中心
地址350001 福建省福州市湖东路312号国
检广场
(72)发明人李小晶 吕水源 陈旻实 唐熙
邹哲祥 卢丽君
(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限
公司 35100
代理人蔡学俊
(54)发明名称
一种基于电致化学发光检测双酚A 的方法
(57)摘要
本发明公开了一种以电致化学发光谱（ECL ）
检测环境激素中BPA 的方法，属于分析化学领域。

是采用Ru(bpy)32+/DBAE 共反应体系，对BPA 进行
电致化学发光法检测，即将发光物质Ru(bpy)32+
修饰在BPA 适配体互补链上作为发光探针，基于
BPA 适配体探针与BPA 适配体互补链探针特异性
结合的原理测定BPA 含量的方法。

该方法在BPA
浓度为1.0×10-11-1.0×10-9mol/L 范围内呈良好
的线性，最低检测限可达7.0×10-12mol/L ，其检测
限大大低于国家卫生标准中对碳酸酯树脂和成型
品中酚溶出量的要求，且操作简单、检测快速、灵
敏度高、特异性好，适用于水壶、水杯、奶瓶、食品
容器等橡塑制品中BPA 含量的准确测定。

(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书4页序列表1页 附图2页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书4页序列表1页 附图2页(10)申请公布号CN 104198548 A
1.一种基于电致化学发光检测BPA 的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）采用反相微乳法，先将Triton X-100、环己烷、正己醇和含Ru(bpy)32+的水溶液混合，室温下搅拌反应30-40 min ，形成均匀的油包水体系；
2）在步骤1）的油包水体系中加入原硅酸四乙酯和氨水，室温下继续反应22-24 h ，再加入丙酮，使Ru(bpy)32+-SiO 2 NPs 纳米颗粒从油包水体系中沉淀出来，将沉淀离心后用乙醇和水分别多次洗涤；
3）将步骤2）制得的纳米颗粒超声分散到PBS 缓冲溶液中；
4）在步骤3）分散好的Ru(bpy)32+-SiO 2 NPs 中，加入新鲜配制的含有乙酸的EDTA 溶液进行表面功能化修饰，室温下搅拌30-40 min ，将沉淀离心后用去离子水冲洗除去多余的DETA ；再将沉淀分散到PBS 缓冲溶液中用于标记DNA 探针；
5）将BPA 适配体互补链探针D2滴加到干燥洁净的电极表面，37 ℃下自组装2-2.5 h ，再将电极浸入水中2 h 以除去多余的D2；
6）将步骤4）制备好的Ru(bpy)32+-SiO 2 NPs 滴加到步骤5）处理好的电极表面上，37 ℃下反应2-2.5 h ，用水冲洗电极表面，直至冲洗液无ECL 信号值；将Ru(bpy)32+-SiO 2-ssDNA 探针置于含有DBAE 的PBS 缓冲溶液中测其ECL 信号值I(ssDNA)；
7）将BPA 适配体探针D1滴加到步骤6）处理好的电极表面，37 ℃下杂交反应2 h ，再将电极浸入水中2 h ，以除去多余的D1；于含有DBAE 的PBS 缓冲溶液中测其ECL 信号值I(dsDNA)；
8）将步骤7）处理好的电极浸泡在待测溶液中，37 ℃下反应10 h ，再浸入水中2 h 除去脱落的D1及多余的待测溶液，于含有DBAE 的PBS 缓冲溶液中测其ECL 信号值I ；
9）根据BPA 浓度对数值与ECL 信号变化值的线性方程计算出BPA 的浓度，进而得出待测溶液中BPA 的含量。

2.根据权利要求1所述基于电致化学发光检测BPA 的方法，其特征在于：步骤1）混合后的溶液中Ru(bpy)32+的浓度为1-1.5 mmol/L ；反应过程中保持水与Triton X-100的摩尔比为10：1。

3.根据权利要求1所述基于电致化学发光检测BPA 的方法，其特征在于：步骤4）所述含有乙酸的EDTA 溶液中，乙酸浓度为1-1.2 mmol/L ，EDTA 溶液的质量百分数为1%-1.5%。

4.根据权利要求1所述基于电致化学发光检测BPA 的方法，其特征在于：步骤5）所述BPA 适配体互补链探针D2的序列为：5’-NH 2-AAATCCAGAA ACGCGAACGA CCAACGACCA-SH-3’。

5.根据权利要求1所述基于电致化学发光检测BPA 的方法，其特征在于：步骤6）、步骤
7）和步骤8）中所述PBS 缓冲液的浓度为50 mmol/L 、pH 值为7.4，其中含DBAE 的浓度为5.0×10-3 mol/L 。

6.根据权利要求1所述基于电致化学发光检测BPA 的方法，其特征在于：检测ECL 信号的仪器参数为：循环电压0.6-1.4V ，扫速50 mV·s −1，样品间隔25 s 。

7.根据权利要求1所述的基于电致化学发光检测双酚A 的方法，其特征在于：步骤7）中所述BPA 适配体探针D1的序列为：5’-tggtcgttgg tcgttcgcgt ttctggattt tttatttctg gggttcagtt cttttttgt-3’。

一种基于电致化学发光检测双酚A的方法
技术领域
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于电致化学发光检测BPA的方法。

背景技术
[0002] 电致化学发光（E l e c t r o g e n e r a t e C h e m i l u m n e s c e n c e o r Electrochemiluminescence，简称ECL）是将电化学手段与化学发光方法相结合的一种技术，它是指通过电极对含有化学发光物质的体系施加一定的电压或通过一定的电流，使化学发光物质发生电子转移形成激发态分子，激发态分子之间或与体系中其它外加共存物质之间发生化学反应而产生化学发光，或者激发态分子直接在电极上发生氧化还原反应而产生的一种光辐射的现象。

1927年，Dufford等（Dufford RT, Nightingale D, Gaddum LW. Journal of the American Chemical Society, 1927, 49(8): 1858-1864）在电解Grignard化合物的无水乙醚溶液时发现了光的发射；随后Havery（Harvey N. Journal of Physical Chemistry, 1929, 33: 1456-1459）在碱性溶液中电解鲁米诺时，发现了在阴阳极上有发光现象；之后直到1960年中叶才出现了第一篇对电化学发光的详细研究，从此电化学发光应用范围遍布于基础研究直至大范围的应用研究。

现有的电致化学发光体系主要有聚芳香族碳水化合物、金属无机物及无机配合物。

聚芳香族碳水化合物（polyaromatic hydrocarbons，PAHs）有鲁米诺、光泽精、色氨酸、吖啶酯等，已见报道的无机金属配合物或原子簇有Ru、Re、Os等与联吡啶（bpy），菲罗啉（pHy）等形成的配合物。

[0003] 双酚A（Bisphenol A，简称BPA）全名2,2-二（4-羟基苯基）丙烷，用于合成聚碳酸酯和环氧树脂等材料，也可用作酚醛树脂、可塑性聚酯、抗氧剂及聚氯乙烯的稳定剂，被广泛用于制造婴儿奶瓶、厨房用具及医疗设备。

已有研究表明，BPA有模拟雌激素的效果，是一种环境激素，可通过包装材料进入食品和饮料中，导致人体内分泌失调，威胁胎儿和儿童健康，还可能与癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖有关。

因此，建立一种操作简便、灵敏度
2+/高的BPA检测方法是十分必要的。

本发明采用三联吡啶钌/二丁基氨基乙醇（Ru(bpy)
3
2+修饰在BPA DBAE）共反应体系，对BPA进行电致化学发光法检测，即将发光物质Ru(bpy)
3
适配体互补链上作为发光探针，基于BPA适配体探针与BPA适配体互补链探针特异性结合来间接测定BPA。

发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种基于电致化学发光检测BPA的方法，该方法对BPA的检测灵敏度高、特异性好，在1.0×10-11 mol/L-1.0×10-9 mol/L的浓度范围内对BPA的检测呈现良好的线性，最低检测限为7.0×10-12 mol/L，可实现BPA的快速、准确测定。

[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于电致化学发光检测BPA的方法，包括以下步骤：
2+的水溶液混合，1）采用反相微乳法，先将Triton X-100、环己烷、正己醇和含Ru(bpy)
3
室温下搅拌反应30-40 min，形成均匀的油包水体系；
2）在步骤1）的油包水体系中加入原硅酸四乙酯和氨水，室温下继续反应22-24 h ，再加入丙酮，使Ru(bpy)32+-SiO 2 NPs 纳米颗粒从油包水体系中沉淀出来，将沉淀离心后用乙醇和水分别多次洗涤，除去多余的Triton X-100及物理吸附在纳米颗粒上的Ru(bpy)32+；
3）将步骤2）制得的纳米颗粒超声分散到PBS 缓冲溶液中；
4）在步骤3）分散好的Ru(bpy)32+-SiO 2 NPs 中，加入新鲜配制的含有乙酸的EDTA 溶液进行表面功能化修饰，室温下搅拌30-40 min ，将沉淀离心后用去离子水冲洗除去多余的DETA ；再将沉淀分散到PBS 缓冲溶液中用于标记DNA 探针；
5）将BPA 适配体互补链探针D2滴加到干燥洁净的电极表面，37 ℃下自组装2-2.5 h ，再将电极浸入水中2 h 以除去多余的D2；
6）将步骤4）制备好的Ru(bpy)32+-SiO 2 NPs 滴加到步骤5）处理好的电极表面上，37 ℃下反应2-2.5 h ，用水冲洗电极表面，直至冲洗液无ECL 信号值；将Ru(bpy)32+-SiO 2-ssDNA 探针置于含有DBAE 的PBS 缓冲溶液中测其ECL 信号值I(ssDNA)；
7）将BPA 适配体探针D1滴加到步骤6）处理好的电极表面，37 ℃下杂交反应2 h ，再将电极浸入水中2 h ，以除去多余的D1；于含有DBAE 的PBS 缓冲溶液中测其ECL 信号值I(dsDNA)；
8）将步骤7）处理好的电极浸泡在待测溶液中，37 ℃下反应10 h ，再浸入水中2 h 除去脱落的D1及多余的待测溶液，于含有DBAE 的PBS 缓冲溶液中测其ECL 信号值I ；
9）根据BPA 浓度对数值与ECL 信号变化值的线性方程计算出BPA 的浓度，进而得出待测溶液中BPA 的含量。

[0006] 步骤1）混合后的溶液中Ru(bpy)32+的浓度为1-1.5 mmol/L ；反应过程中保持水与Triton X-100的摩尔比为10：1。

[0007]
步骤4）所述含有乙酸的EDTA 溶液中，乙酸浓度为1-1.2 mmol/L ，EDTA 溶液的质
量百分数为1%-1.5%。

[0008] 步骤5）所述BPA 适配体互补链探针D2的序列为：5’-NH 2-AAATCCAGAA ACGCGAACGA CCAACGACCA-SH-3’。

[0009] 步骤6）、步骤7）和步骤8）中所述PBS 缓冲液的浓度为50 mmol/L 、pH 值为7.4，其中含DBAE 的浓度为5.0×10-3 mol/L 。

[0010] 检测ECL 信号的仪器参数为：循环电压0.6-1.4V ，扫速50 mV·s −1，样品间隔25 s 。

[0011] 步骤7）中所述BPA 适配体探针D1的序列为：5’-tggtcgttgg tcgttcgcgt ttctggattt tttatttctg gggttcagtt cttttttgt-3’。

[0012] 本发明的显著优点为：
（1）本发明的操作步骤简单、特异性强、灵敏度高、成本低，实用性强，对BPA 的最低检测限为7.0×10-12 mol/L ，远低于国家卫生标准中对碳酸酯树脂和成型品中酚溶出量的要求，可准确测定样品中BPA 的含量。

[0013] （2）本发明所建立的基于电致化学发光检测BPA 的方法，操作简便、检测限低，能够实现水壶、水杯、奶瓶、食品容器等橡塑制品中BPA 的在线检测，且对检测物质不造成破坏。

附图说明
[0014]
图1为本发明基于电致化学发光方法检测BPA 的原理图。

[0015] 图2为本发明实施例标准溶液的电致化学发光谱图。

[0016] 图3为本发明实施例标准溶液的工作曲线图。

具体实施方式
[0017] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

[0018] 本实施例所需仪器及试剂溶液如下：BPCL 超微弱发光分析仪（北京中国科学院生物物理研究所），CHI1210 电化学工作站（上海辰华仪器公司），精密酸度计（上海大普仪器有限公司），三孔电热恒温水槽（上海一恒科学仪器有限公司）。

Ru(bpy)3Cl 2、BPA 、DNA （上海生工生物工程技术服务有限公司）。

[0019] BPA 适配体互补链探针D2的序列：5’-NH 2-AAATCCAGAA ACGCGAACGA CCAACGACCA-SH-3’；
BPA 适配体探针D1的序列：5’-tggtcgttgg tcgttcgcgt ttctggattt tttatttctg gggttcagtt cttttttgt-3’。

[0020] 一种基于电致化学发光检测BPA 的方法，包括以下步骤：
1）采用反相微乳法，先将2 mL Triton X-100、8 mL 环己烷、2 mL 正己醇和10 mL 含Ru(bpy)32+的水溶液混合，室温下搅拌反应30 min ，形成均匀的油包水体系；
2）在步骤1）的油包水体系中加入10 mL 原硅酸四乙酯和10 mL 氨水，室温下继续反应24 h ，再加入10 mL 丙酮，使Ru(bpy)32+-SiO 2 NPs 纳米颗粒从油包水体系中沉淀出来，将沉淀离心后用乙醇和水分别多次洗涤，除去多余的Triton X-100及物理吸附在纳米颗粒上的Ru(bpy)32+；
3）将步骤2）制得的纳米颗粒超声分散到2 mL PBS 缓冲溶液中；
4）在1 mL 步骤3）分散好的Ru(bpy)32+-SiO 2 NPs 中，加入10 mL 新鲜配制的含有乙酸的EDTA 溶液进行表面功能化修饰，室温下搅拌30 min ，将沉淀离心后用去离子水冲洗除去多余的DETA ；再将沉淀分散到10 mL PBS 缓冲溶液中用于标记DNA 探针；
5）将10 μL BPA 适配体互补链探针D2滴加到干燥洁净的电极表面，37 ℃下自组装2 h ，再将电极浸入1 mL 二次水中2 h 以除去多余的D2；
6）将10 μL 步骤4）制备好的Ru(bpy)32+-SiO 2 NPs 滴加到步骤5）处理好的电极表面上，37 ℃下反应2 h ，用二次水冲洗电极表面，直至冲洗液无ECL 信号值；将Ru(bpy)32+-SiO 2-ssDNA 探针置于300 μL 含有DBAE 的PBS 缓冲溶液中测其ECL 信号值I(ssDNA)；
7）将10μL BPA 适配体探针D1滴加到步骤6）处理好的电极表面，37 ℃下杂交反应2 h ，再将电极浸入二次水中2 h ，以除去多余的D1；于300 μL 含有DBAE 的PBS 缓冲溶液中测其ECL 信号值I(dsDNA)；
8）用无水乙醇配制浓度为1.0×10-5 mol/L 的BPA 母液，再用二次水稀释母液得到浓度依次为1.0×10-11、5.0×10-11、1.0×10-10、5.0×10-10、1.0×10-9 mol/L 的BPA 标准溶液；
9） 将步骤7）处理好的电极分别浸泡在1 mL 步骤8）配制的BPA 浓度为1.0×10-11、
5.0×10-11、1.0×10-10、5.0×10-10、1.0×10-9 mol/L 的标准溶液中，37 ℃下反应10 h ，再浸入二次水中2 h 除去脱落的D1及多余的标准溶液，于含有DBAE 的PBS 缓冲溶液中测其ECL 信号值I ；
10）根据BPA 浓度对数值与ECL 信号变化值绘制标准溶液工作曲线，得出线性方程；
11）将待测样品洗净、晾干，按2ml/cm 2的比例加入蒸馏水，100℃浸泡30min 后冷却至室温，补水至原浸泡体积后，所得溶液作为待测溶液；测定待测溶液的ECL 信号值后，根据步骤10）得出的BPA 浓度对数值与ECL 信号变化值的线性方程计算出待测溶液中BPA 的浓度，进而得出待测样品中BPA 的含量。

[0021] 步骤1）混合后的溶液中Ru(bpy)32+的浓度为1 mmol/L ；反应过程中保持水与Triton X-100的摩尔比为10：1。

[0022] 步骤4）所述含有乙酸的EDTA 溶液中，乙酸浓度为1 mmol/L ，EDTA 溶液的质量百分数为1%。

[0023] 步骤6）、步骤7）和步骤9）中所述PBS 缓冲液的浓度为50 mmol/L 、pH 值为7.4，其中含DBAE 的浓度为5.0×10-3 mol/L 。

[0024] 检测ECL 信号的仪器参数为：循环电压1.0 V ，扫速50 mV·s −1，样品间隔25 s 。

[0025] 从图3可以看出，BPA 浓度对数值和ECL 信号变化值的线性方程为：
I/I 0=3.817+0.3307X ，R=0.9963，其中I 0=I(dsDNA)－I(ssDNA)：I(ssDNA)为裸金电极修饰D2后的阻抗值，I(dsDNA)为D2与D1杂交后的ECL 信号值；I=I －I(ssDNA)：I 为加入BPA 反应10 h 后的ECL 信号值；X 为BPA 浓度的对数值，浓度单位为mol/L 。

[0026] 利用本实施例的检测方法对奶瓶和PC 塑料瓶中BPA 的含量进行测定，结果见表1。

[0027] 表1 不同样品中BPA 含量的测定结果
从表1可见，本发明检测方法可准确、便捷的测定样品中BPA 的含量，且其操作简便、不破坏检测样品，适用于样品中BPA 含量的快速检测。

[0028]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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SEQUENCE LISTING
<110> 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种基于电致化学发光检测双酚A 的方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Arti ficial
<400> 1
aaatccagaa acgcgaacga ccaacgacca 30<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> Arti ficial
<400> 2tggtcgttgg tcgttcgcgt ttctggattt tttatttctg gggttcagtt cttttttgt 59序 列 表CN 104198548 A
图1
图2
图3。