SPF环境中实验动物微生物质量控制New

SPF环境中实验动物微生物质量控制
SPF环境中实验动物微生物质量控制
1 SPF环境运行前的卫生及消毒
改建的SPF环境工程经验收合格后，即可进行全面的清扫、洗刷和消毒。

清除所有的杂物，将需要的笼具及其它用具（主要为卫生洁具）妥善放置，用适宜浓度的中性洗涤剂和清水彻底洗刷地面、墙壁、天花板、笼具及洁具，然后用适宜浓度的消毒液（如0.25%的过氧乙酸）彻底擦洗SPF环境内的上述每一部份,妥善安装饲养室高效过滤器及排风口滤膜,通风运行24h以上后,封闭所有送排风口和人员进出口,摆放好各种需进行灭菌的用具和笼架,根据SPF环境的体积,按
15ml/m福尔马林加高锰酸钾计算出药量,对SPF环境进行多点福尔马林熏蒸消毒48h,然后通风运行72h以上。

消毒后的SPF环境经江苏省实验动物质量检测二站（负责环境设施检测）按国标GB 14925-2001实验检测合格后，该SPF环境即开始正式运行。

并从中国科学院上海实验动物中心（国家啮齿类实验动物种子中心）引进所需品种（系）的大小鼠进行生产繁殖。

2 SPF环境运行期间的维持性消毒和灭菌
SPF环境消毒灭菌后空气及环境中是无菌的，但正常运行并饲育动物后，设施内微生物数量及种类就逐渐增加，而控制设施内微生物数量和种类的方法就是进行维持性消毒和灭菌。

灭菌是杀灭所有活的微生物，而消毒仅指杀灭有害微生物，有些物品必需灭菌，有些操作仅为消毒。

2．1消毒剂的选择
过氧乙酸及戊二醛对细菌繁殖体及芽胞均有良好的杀灭作用，但戊二醛杀灭细菌芽胞的时间稍长。

过氧乙酸浓度以0.25%为宜，而戊二醛则以2%较适合。

因此常规消毒我们选用过氧乙酸和戊二醛。

而传递渡槽的消毒使用0.25%的新洁尔灭或0.2%的碘伏进行，每周更换一次。

2．2 消毒与灭菌方法的选择
2．2．1 空气消毒：由于压缩喷雾消毒其雾滴细小，均匀，接触面大，消毒效果较好，因此在SPF环境内空气消毒时采用压缩喷雾消毒的方法。

压缩机为华冠移动式空气压缩机（）工作压力为1.25MPa,将适宜浓度的消毒液装入喷枪内,喷枪距消毒目标50cm左右,按照由里向外,由上至下的原则,按50ml/m的用量对空气均匀喷雾,消毒频率与工作人员进入SPF环境相同,一般以每周2-3次为宣。

2．2．2 地面、墙壁及动物笼架的消毒：我们采用表面喷雾消毒及用消毒液擦拭消毒相结合的方法：即天花板、墙壁较高部分用喷雾消毒的方法，墙壁较低部分和笼架首先清扫灰尘，然后用适宜浓度的消毒液擦拭消毒，地面首先必须清除粪便、垫料及灰尘，用适宜浓度的消毒液拖地消毒，消毒频率以每周2-3次为宜。

2．2．3 传递窗物品的消毒：对传递窗的物品采用喷雾、擦拭消毒与紫外线消毒相结合的方法：即首先将待消毒物品表面用适宜浓度的消毒液行喷雾、擦拭消毒后，再放入传递窗，打开紫外灯消毒15miu，再按标准化操作程序（SOP）传入SPF环境。

2．2．4饲料灭菌：清洁级以上级别实验动物理想的饲料，应是双层小包装并经Co灭菌的全价颗粒料。

经传递窗进入SPF环境，这样使用方法便且污染机会少、保存时间长、营养损失少，但价格相对较昂贵。

因此，我们采用的对于特殊品系的大小鼠，如近交系统Lewis 大鼠、近交系NJS小鼠、突变系db/-小鼠、转基因小鼠GT-ROSA 及nEGFP待使用Co灭菌的全价颗粒料，其他常规品种（系）的大小鼠生产繁殖和实验（SD大鼠、WiStar大鼠、ICR 小鼠及各种实验后观察的大小鼠）使用普通饲料，经适当包装后进行预真空高压灭菌，灭菌后由双扉消毒锅后门进入SPF环境，灭菌条件为121°C 15min，灭菌后的饲料中某些营养素有所下降，主要是维生素和蛋白质的含量。

因此，在饲料加工时，应与饲料生产厂家协调，在生产时补加适量的营养成份，也可在饲养管理过程中自行补饲适量鸡蛋、麦芽、葵花籽等物质，补充
由于灭菌所导致的营养损耗。

另外对灭菌后的饲料定期检测灭菌效果，通过采样接种血琼脂平板，37°C培养72h时，观察结果必须为阴性。

2．2．5垫料灭菌：垫料和笼器具一样，是大小鼠生产、繁育和使用不可缺少的并且是十分重要的载体材料。

关于大小鼠垫料国内研究相对较少，开发的品种也不多，尽管国家标准对实验动物垫料有一定的要求，但可操作性较差。

大部分单位使用的垫料是锯木屑或刨花，由于木材种类不一，气味各异，相互混杂，不易分离，加之木屑和刨花作为加工厂的废品，一般无良好的贮存场所，保存时间长短不一，霉
变、虫蛀、野鼠做窝等时有发生，是非常重要的微生物污染源。

因此，在选用垫料时，对有特殊气味、霉变、昆虫滋生、有明显野鼠生活痕迹的垫料不能使用。

应与木材加工厂联系协调好，将不同材质的木屑和刨花分开存放，及时运回、晒干、包装，并妥善贮藏，垫料在使用前需经预真空高压灭菌，灭菌条件可选择121°C 30min，杀灭垫料中微生物。

由于采用预真空高压灭菌处理，垫料干燥、蓬松、吸水性更好，动物成窝性良好，但要定期检测消毒效果。

高压灭菌后的垫料由双扉消毒锅后门进入SPF环境。

目前出现了实验动物垫料专业生产厂家，供应各种规格的大小鼠垫料，经过筛选后的垫料木屑均匀，颗粒适中，杂质较少。

可以购回自行灭菌，也可以购买经真空压缩包装并经Co灭菌的垫料，但价格相对较高。

2．2．6笼器具的灭菌：SPF环境中饲育实验动物的笼器具是普通笼器具，但均为耐高温高压的产品，因为SPF环境中的笼器具灭菌方式为预真空高压灭菌。

新购回的笼器具用中性洗涤剂浸泡、洗刷并冲洗干净后即可进行预真空高压灭菌，灭菌后的笼器具由双扉消毒锅后门进入SPF环境；对于使用过的笼器具，必需彻底将脏料清除干净后，经温水浸泡、洗刷干净后，再进行预真空高压灭菌，条件为121°C15min，灭亡、菌后笼器具应干爽、无异味。

另外，在使用IVC笼具时，由于该笼具本身对密封性要求较高，消毒方法以化学液体消毒为宜。

如选用高温高压消毒，消毒温度的设置不宜过高，以免IVC 笼具变形而影响笼具的密封性。

2．2．7饮水灭菌：普通饮水中含有许多种类的微生物，因此SPF
环境中饲育实验动物的饮水必须经过灭菌处理。

我们对大小鼠饮水灭菌比较谨慎，先在洗净后的饮水瓶中灌满水后，加入适量盐酸，使其PH值在2.5-3.0,然后再经预真空高压灭菌,定期更换。

酸化水一方面可使水质软化，另一方面可杀灭水中大部分微生物，再经预真空高温高压灭菌121°C 15min杀灭饮水瓶表面及水中残存的微生物。

另外，在SPF环境内用于配制化学消毒液及使用水，均为于SPF环境外经蒸汽煮沸冷却水，并由与专用水管引入SPF环境。

对于目前比较流行使用的反渗透净化水要注意定期检测净化除菌效果。

工作服灭菌：SPF环境中工作人员的工作服是海门净化设备厂生产的抗静电的专用隔离衣，清洗毒方便，穿着舒适、轻便、密封性能好，穿着后从体表脱落于SPF环境中的毛发、皮屑较少。

使用过的工作服经洗涤凉干后包装，直接经121°C 15min的预真空高温高压灭菌。

普通隔离衣、帽和口罩也能替代使用，但密封性较差，灭菌方法也可采用预真空高温高压灭菌。

3 加强对微生物检测
SPF环境运行后，为了确保SPF环境及所生产繁育的大小鼠的微生物质量，我们对SPF环境、所饲育大小鼠微生物携带情况每季度定期检测一次。

SPF环境主要检测细菌的种类和数量，而大小鼠则根据清洁级或SPF级的要求进行检测必需排除的微生物，详细记录检测结果，并根据检测结果中微生物的数量和种类，及时采用取控制措施，确保SPF环境及所饲育大小鼠的微生物质量符合国家标准。

4 制定并严格执行SPF环境内工作制度和标准化操作规各项
程
在SPF环境的运行中，我们结合自身的特点制订了详细的工作制度和SPF，主要包括工作人员的进出流程、SPF环境内工作流程、大小鼠饲养管理制度及操作SPF：卫生、防疫、消毒制度及操作SPF；动物包装、发放、运输和处理操作SPF；垫料，废物的运输和处理操作SPF；物品的洗刷消毒和准备操作SOP及发生意外情况的应急措施等。

在日常工作中，我们结合专业及素质教育，严格监督执行SPF。

5 加强SPF环境运行设备的维修与保养
为了保证SPF环境的稳定运行，设有不同行政区域的二路供电，并将SPF环境的供电并入医院电源供电应急系统管理，确保SPF环境电源的正常供应。

空调机组不为二台多压缩机头中央空调，交替使用，定期由专业维保公司检修保养。

送排风系统设计有二套机组，互为备用，定期检修与保养。

通风口过滤膜定期清洗更换，其中粗效过滤膜每季度清洗更换一次，高郊过滤器每年更换一次。

对消毒锅除定期保养外，还定期用硫点温度计和灭菌化学指示卡，分别检查消毒锅内达到的温度是否与设定值相符及其灭菌效果。

其它设备也要科学而合理地使用并定期保养。

6 加强SPF环境内工作人员的教育和管理
进出的工作人员是最主要的也是最有可能携带微生物进入SPF环境的载体，因此要特别注意加强对进出SPF环境人员的管理，尽量减少进出SPF环境频率，非工作人员禁止进入。

对饲养管理人员和
进入设施的实验人员，首先要进行体检和素质与技能的培训，使其深刻的认识对微生物与实验动物质量的关系，教育培养工作人员爱岗敬业、乐于奉献和关爱实验动物，维护实验动物福利的品德：对工作人员进行技能培训，使其充分认识实验动物科学对生命科学研究及人类健康的重要性；培养他们熟练掌握并严格执行SPF环境中实验动物饲养管理的操作流程，使其养成自觉按照SPF进行操作的习惯。

工作人员培训后，并考核合格才能进入SPF环境工作。

要依领先依靠严格的规章制度管理工作人员，对违反操作规程和工作制度的人员要进行严肃处理。

总之，SPF环境中实验动物微生物质量控制和维持是一项复杂而细致的系统工程，既牵涉到人员管理、设备维护，又与人员素质及技术因素有关，必需对SPF环境的运行流程进行科学安排，综合管理，方能确保SPF环境及所饲育大小鼠的微生物质量符合国际要求。

就技术面而言，生产型SPF环境内微生物控制的主要方法是环境内部日常维持性消毒，但长期频繁使用消毒剂对实验动物的健康、生长、发育、生殖将产生不可预计的影响，而且为了避免微生物产生耐药性，建议轮流使用二种以上消毒液。

另外要考虑到常规消毒并不能完全杀灭微生物，因而加强人员管理，合。

理控制SPF环境内所饲育大小鼠的密度及工作人员进出频率；定期轮换使用SPF环境内不同功能的饲育室，对轮空的饲育室用较高浓度的消毒液彻底消毒等。

上述方法有效地维持SPF环境及保障所饲育实验大小鼠微生物质量符合国际其有十分重要的意义。