放线菌药物高效生物合成关键技术及其产业应用

放线菌药物高效生物合成关键技术及其产业应用
发布时间：2021-09-14T02:15:59.176Z 来源：《基层建设》2021年第17期作者：阿•娜清
[导读] 摘要：放线菌具有丰富多样的次级代谢产物，一直是抗生素及其先导化合物的主要来源之一。

伊犁川宁生物技术股份有限公司新疆伊宁市 835000
摘要：放线菌具有丰富多样的次级代谢产物，一直是抗生素及其先导化合物的主要来源之一。

放线菌的基因工程和抗生素生物合成的代谢调控也是近年来微生物次级代谢研究的热点。

结合近期的研究成果，导致基因表达的调控、基因簇拷贝数和基因簇异源表达的增加、抗性和转运基因的过度表达、前体代谢通量和核糖体工程代谢的改善。

关键词：抗生素；生物合成；代谢调控；放线菌
微生物可以产生多种具有生物活性的次级代谢产物。

大多数活性次生代谢物来自放线菌。

这些物质具有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫抑制和免疫刺激作用，应用广泛。

近年来，农业、兽医、食品工业等，随着耐药菌的不断涌现，对放线菌次级代谢调控的深入研究，放线菌抗生素生物合成的改进，以及耐药菌的发现和生产。

耐药菌的抗生素治疗越来越紧迫。

重组DNA技术或其他技术被用来刻意改变生物体现有的代谢和表达调控网络，破坏细胞性能、化学转化、能量转移和大分子。

本文介绍了基因表达的调控，基因簇拷贝数的增加，基因簇的异质表达，抗性和转运基因的过度表达，以及前体的改进。

1利用合成生物学元件开发放线菌产素潜力
1.1基因簇扩增元件
当营养物质耗尽或生长减慢时，放线菌会产生次级代谢产物。

这通常发生在细菌生长进入稳定期时。

初级代谢物通常是次级代谢的前体，如乙酰辅酶 A。

为了得到尽可能多的次生代谢物，如核苷，人们使用多种方法将初级代谢的中间产物冲入次级代谢。

目前，某些基因的过度表达或前体竞争途径的丧失是最直接有效的方法之一。

基因是合成抗生素的重要步骤。

虽然增加拷贝数和表达数不难，但操作几十或几百kb的基因簇却非常困难。

基因簇往往需要细菌人工染色体文库的建立和筛选。

其次，转化为放线菌比大肠杆菌要困难得多。

随着越来越多的工业菌株的基因组变得明显，发现许多工业菌株的基因组具有基因簇.pcbDE的多个拷贝。

35kb基因簇的拷贝数扩大了6到16倍。

最初，卡那霉素高产菌株的重复基因簇数达到36个，重复片段达到145kb。

我们实验室已经培养了许多链霉菌属 abermitiris 菌株。

我参与并获得了含有两个拷贝的阿维菌素生物合成基因簇的高产菌株（无可用数据）。

多拷贝基因簇现象在工业化生产的高产菌株中非常普遍，多拷贝基因簇菌株是通过连续诱变筛选获得的。

吴等人。

阐明了卡那霉素链霉菌基因扩增的机制，发现卡那霉素链霉菌的推定运动元件与穿梭质粒tra-A具有相同的DNA释放酶活性。

原始基因ZouA和卡那霉素基因簇的扩增发生在重组位点RsA和RsB与oriT序列之间。

这说明卡那霉素链霉菌的 DNA 扩增是由 DNA 释放酶引起的。

它由同源重组介导。

接下来，我们将该系统引入天蓝色链霉菌并成功扩增了放线菌素基因簇。

与原菌株相比，放线菌素产量提高了20倍。

利用合成生物元件，通过自然或常规诱变、人工复制、基因簇扩增等方式提高次级代谢产物的产量，是一种规模化生产、资源化利用的方法。

1.2调控元件
随着越来越多的启动子、激活子、抑制子和群体感应元件被发现，外源基因簇的激活和调控将成为现实。

现在已知大多数抗生素合成受转录因子调控。

actII-ORF4 放线菌素基因簇几种转录调控基因，如十一烷基出血和球形链霉菌 D，是由抗生素产生的。

基因簇。

它有一套红色素合成基因。

在基因簇之外有几个转录因子。

例如，糖多孢菌属。

红霉素和红霉素的合成受调节剂 BldD 的影响。

BldD 可以与红霉素生物合成基因簇的五个启动子区域结合。

许多研究表明，调节增加的基因表达可以显着增加抗生素的产生。

除了抗生素合成途径的特定调节剂外，一些全球调节剂也在抗生素合成中发挥重要作用。

卓等人。

逆向生物工程用于识别参与阿维菌素合成的基因，并通过转录组芯片比较模式。

..股票和工业生产股票的转录组是不同的。

在合成过程中，发现了在工业化生产菌株上游启动子区上调的阿维菌素合成基因簇的调控基因aveR和其他阿维菌素相关基因。

包含在具有区域标识符 σhrdB 的存储中。

这表明 σhrdB 参与全局转录调控。

以此为出发点，我们构建了一个σhrdB突变库，最终构建了一个52%的高产菌株。

1.3耐药元件
耐药泵元件是细菌对抗抗生素和其他药物的自我保护机制之一。

由于放线菌产生的抗生素本质上是有毒的，一些放线菌抗生素合成基因簇通常含有与给药相关的基因。

ABC家族的多药外排泵由阿维菌素合成基因簇上游的avtAB基因编码，据信能够外排阿维菌素。

使用多拷贝质粒增加其表达使高产阿维菌素菌株的产量提高了50%，并将阿维菌素的胞内外分布比从6：1降低到4.5：1。

上面的例子表明，有效利用合成生物元素可以显着增加放线菌次级代谢产物的产量。

与传统的诱变-筛选-诱变方法相比，合成生物学是一种抗生素。

作者提供了更合理的指导方法和工具。

2合成生物学新技术
2.1基于限制性内切酶的DNA连接技术
生物元件包括启动子、终止子、核糖体结合位点（RBS）、操纵子和蛋白质编码区。

只有将这些生物元素以特定的方式组合起来，才能发挥生物功能。

工程的关键概念之一是标准化。

作为合成生物学的重要物质基础，各种生物成分的标准化组装使合成生物学区别于其他
生命科学。

这是因为标准化允许组装生物元素。

..另外，转换容易执行，大大减少了人工的工作量。

BioBrick 是由麻省理工学院的 Tom Knight 等人提出的生物成分的标准化术语。

BioBrick 基于一组特定的限制酶（EcoRI、XbaI、SpeI 和 PstI，XbaI 和 SpeI 是同源酶）。

连接后消化的片段通常需要重组不同的 BioBricks，因此只有这四个单一限制之一。

此功能允许生物构建块保持分子克隆操作的可重复性。

麻省理工学院建立的标准生物成分库有5000多个可用的生物积木。

随着人们对生命认识的加深，越来越多的生物元素被发现，新的元素也在不
断地被开发出来。

另一种基于TypeIIS限制性内切酶的DNA组装技术也非常有效，尤其是对DNA的重复剪接。

另一种基于TypeIIS限制性内切酶的DNA组装技术也非常有效，尤其是对DNA的重复剪接。

TypeIIS 限制性核酸内切酶切割识别位点外的序列，留下 4bp 粘性末端。

基于这个原理，开发了GoldenGate、MASTER等一系列方法。

2.2基于同源重组的DNA拼接技术
2009年，Gibson等人发明了一系列DNA组装技术，称为Gibson组装。

该技术的灵活性是传统方法难以实现的，在合成生物学领域发挥着重要作用。

该技术不依赖限制性内切酶，而是将具有重叠区域的 DNA 片段连接成一个完整的质粒。

这种方法的一步等温法特别方便。

首先，T5 核酸外切酶切割 DNA 双链体的 5' 端，暴露 DNA 双链体的 3' 端。

碱基互补使一条单链退火，DNA聚合酶以其中一条单链为模板，从5'延伸到3'，最后拉大两条链之间的间隙。

连接到连接酶。

这种方法的一大优点是上述所有反应只需在50°C下进行，可同时连接多个片段，反应后可直接转化产物，大大节省了成本。

此外，该技术还可用于构建合成生物元件、生物合成基因簇，甚至微生物基因组。

DNA不仅可以在体外组装，还可以与大肠杆菌、酵母等微生物无缝拼接。

张在1998年指出，噬菌体编码的蛋白对（RecT和RecE）可以介导线状DNA和环状质粒DNA之间的同源重组，并基于Red/ET的发现，建立了DNA集。

这种技术也避免了它引起的问题。

使用传统的 DNA 重组技术来选择受限位点。

Red/ET重组技术的原理类似于Gibson组装技术。

不同之处在于 DNA 重组发生在大肠杆菌中，因为反应必须在质粒DNA 复制期间进行。

在 Red/ET 重组过程中，RecE 具有 5' 到 3' 外切酶活性。

切割后的单链 DNA 与单链 DNA 结合蛋白 RedT 结合，并与环状 DNA 的同源区域退火以增加。

该技术可用于执行点突变并将其他生物元素添加到构建的载体中。

传统的DNA重组技术，尤其是当需要修饰的载体较大（包括生物合成基因簇）时。

3结语
放线菌是次生代谢物的重要来源。

随着越来越多的次级代谢产物的生物合成基因簇被发现，合成生物学技术对人们来说是全新的，有助于获得结构和新的活性。

今天，抗生素及其改性剂对于提高病原微生物的抵抗力非常重要。

此外，合成生物技术可以引导人们更合理地增加放线菌次级代谢产物的现有水平，显着减少新型抗生素的开发和产业化。

参考文献： [1]NIJing-Shu，WANGYan-Sheng，WUHang，等.放线菌中与抗生素合成相关TetR家族转录因子的研究进展[J].微生物学通报，2019，046（002）：407-414.
[2]刘晗，陆美玲，陈依军.放线菌来源天然产物生物合成途径中P450酶的功能研究进展[J].药物生物技术，2019，v.26（05）：77-82.
[3]黄蓉，段燕文，朱湘成.CRISPR/Cas9在放线菌合成生物学研究中的应用和发展[J].中国生物化学与分子生物学报，2019，v.35（09）：43-50.。