同位素稀释气相色谱-质谱联用法监测芥子气染毒家兔尿液中的硫二甘醇

同位素稀释气相色谱-质谱联用法监测芥子气染毒家兔尿液中
的硫二甘醇
聂志勇;张雅姣;吴弼东;闫珑;冯建林;刘勤;谢剑炜
【摘要】A sensitive determination method for sulfur mustard ( HD ) metabolites thiodiglycol ( TDG ) in rabbit urine was established and validated using isotope dilution negative ion chemical ionization ( NICI) gas chromatography-mass spectrometry ( GC-MS ) , in which deuterated thiodiglycol ( TDG-d8 ) was used as internal standard. Two solid-phase extraction ( SPE) steps were established and optimized in order to reduce the interfering backgrounds, one was used to extract thiodiglycol ( TDG ) from urine with self-assemblied Florisil SPE cartridges, another cleaning treatment of the by-products after pentafluorobenzoyl chloride (PFBZ) derivatization. The results showed that the limits of detection quantitation of this method were 0. 1 and 0. 3 μg/L, respectively. The exposure time-response relationship and exposure dose-response relationship of TDG in rabbit urine were studied after rabbit skin exposure to sulfur mustard (HD, 0. 02-0. 15 LD50). The TDG levels in the rabbit urine increased rapidly during the first day after application and then decreased over time for all dosage groups. A secondary release was also noted for the high-dose group, and the duration of high TDG excretion levels was correlated positively with the HD dosage levels. We thus concluded that abnormally high levels of TDG in urine could be used as a clear diagnostic indicator of HD exposure.%以硫二甘醇( TDG)的八氘代同位素( TDG-d8)为内标,采用自制
Florisil固相萃取( SPE)柱提取尿样中的TDG,用五氟苯甲酰氯( PFBZ)衍生化后,再
经SPE净化富集,通过考察优化两步固相萃取( SPE)等前处理步骤,建立了尿液中TDG的高灵敏同位素稀释-负化学电离-气相色谱/质谱( ID-NCI-GC/MS)分析方法。

研究了家兔皮肤芥子气(HD)染毒(0.02~0.15 LD50)后,尿液中TDG随时间变化的
时效关系及其与HD染毒剂量间的量效关系。

结果显示,本方法的检出限为
0.1μg/L,定量限为0.3μg/L；家兔染毒后尿液中TDG含量迅速升高,然后又快速减少,并呈现二次释放的特点；各剂量组在第1日内TDG排出量最多,且随着中毒剂
量增高,尿液中高含量的TDG维持时间延长。

因而,尿液中TDG的异常升高可以作为HD暴露的重要特征指标。

【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2014(000)007
【总页数】5页(P980-984)
【关键词】生物标志物;硫二甘醇;固相萃取;芥子气;气相色谱-质谱联用
【作者】聂志勇;张雅姣;吴弼东;闫珑;冯建林;刘勤;谢剑炜
【作者单位】抗毒药物与毒理学国家重点实验室，军事医学科学院毒物药物研究所毒物分析实验室，北京100850;抗毒药物与毒理学国家重点实验室，军事医学科
学院毒物药物研究所毒物分析实验室，北京100850;抗毒药物与毒理学国家重点
实验室，军事医学科学院毒物药物研究所毒物分析实验室，北京100850;抗毒药
物与毒理学国家重点实验室，军事医学科学院毒物药物研究所毒物分析实验室，北京100850;抗毒药物与毒理学国家重点实验室，军事医学科学院毒物药物研究所
毒物分析实验室，北京100850;抗毒药物与毒理学国家重点实验室，军事医学科
学院毒物药物研究所毒物分析实验室，北京100850;抗毒药物与毒理学国家重点
实验室，军事医学科学院毒物药物研究所毒物分析实验室，北京100850
【正文语种】中文
1 引言
芥子气(HD，2，2'-二氯二乙硫醚)是一种糜烂性化学战剂，素有“毒剂之王”之称，能造成皮肤、眼睛及呼吸系统等的损伤，在第一次世界大战和中东战争中曾被多次使用［1，2］。

日军在二战战败后遗弃在中国大量的化学武器，其中大部分
为芥子气和芥路混合毒剂，这些毒剂至今仍严重影响和威胁着当地环境及居民安全与健康［3～5］。

虽然芥子气作用机制早有研究，但迄今尚未完全阐明;芥子气损
伤与烧伤及其它化学损伤的症状相似，病史不清的患者的临床确诊比较困难，而芥子气染毒后很难治愈，且可能造成遗传毒性，因此对芥子气中毒的诊断确证及作用机制的研究仍具有重要的现实意义。

芥子气染毒进入体内后，可与体内亲核基团反应后产生一系列的水解、氧化及加合产物［6，7］，其中大部分生物标志物都直接或者代谢后经过尿液排出体外［8］，所以监测尿液中的代谢产物具有重要意义。

美军《化学防护手册》中，已将硫二甘醇(TDG)确定为芥子气中毒的临床诊断指标之一［9］。

TDG在水基质样品中的分析有一定难度［8］，虽可以不经衍生化用GC/MS或LC/MS直接分析，但检测
的灵敏度均较低［10］，目前常用的方法多是将TDG净化提取并衍生化后用
GC/MS或GC-MS/MS分析，但样品衍生化后常常造成较高的背景［8］及较多
的干扰峰，对于提高灵敏度存在很大的障碍。

本研究优化了尿液中TDG的固相萃取(SPE)及TDG衍生化产物净化富集等前处理技术方法，建立了灵敏的同位素稀释-负化学电离-气相色谱质谱(ID-NCI-GC/MS)
分析方法;根据芥子气对家兔与人的半数致死量(LD50)均为100 mg/kg［11，12］，选择并建立了家兔皮肤HD暴露模型，采集染毒后的尿液，监测了其中TDG的变化，探讨了它们在体内的代谢行为。

2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Agilent 6890N GC-5975 MSD(CI，美国 Agilent公司);HP-5MS 毛细管柱(25 m×200 μm×0.33 μm，美国Agilent公司);60 F-254硅胶薄层板(德国Merck公司);固相萃取仪(美国Waters公司);离心蒸发浓缩仪(美国Labconco公司);BF-2000氮气吹干仪(北京八方世纪公司);固相小柱柱管 (3 mL，美国Alletch 公司);高分子筛板(9.0 mm×2.5 mm，孔径20 μm，逗点生物技术有限公司)。

芥子气(＞96%，中国人民解放军防化指挥工程学院提供)，TDG(＞98.5%，Fluka 公司)，氘代TDG的甲醇溶液(TDG-d8，1.2 mg/mL，美国 TIL公司)，无水吡啶(美国 Sigma公司)，Florisil硅土(60～100目，艾杰尔公司)，五氟苯甲酰氯(PFBZ，美国Acros公司)，甲苯、甲醇、乙腈、二氯甲烷(色谱纯，J.T.Baker公司)，乙酸乙酯(农残级，J.T.Baker公司)，其它试剂均为国产分析纯试剂。

2.2 动物模型实验
健康大耳白家兔(雄性、军事医学科学院实验动物中心提供，2.2～2.8 kg)12只，染毒前适应性饲养一周，动物实验符合有关实验动物福利保护规定。

LD50值参照文献［11，12］为100 mg/kg。

将12只家兔随机平均分成4组，即:低剂量组2 mg/kg(0.02 LD50)、中剂量组5 mg/kg(0.05 LD50)、高剂量组15 mg/kg(0.15 LD50)、空白对照组。

将各组家兔背部首先用剪刀去毛、然后用脱毛剂脱毛(避开肾脏部位)，使裸露面积约为6
cm×6 cm，24 h后用25%乌拉坦腹腔注射麻醉，在裸露的背部皮肤中选取6个区域标记后均匀涂抹HD，随即用保鲜膜覆盖防止HD挥发，6 h后去除保鲜膜，
对家兔皮肤洗消。

染毒前采集空白尿样，染毒后至少每8 h观察并采样一次(中间时间若家兔有尿也
及时收集)，持续14 d，然后隔两天采样一次，又持续14 d。

将采集的样品贴好
标签，于-70℃储存，待测。

同时收集空白对照组尿样，于-70℃储存，备用。

2.3 SPE条件的选择优化实验
分别取0.5 g/L的TDG标准样品及空白家兔尿样，在硅胶薄层板上点样，碘熏或
紫外灯显色，考察常见溶剂水、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲醇、二氯甲烷、正庚烷对TDG与尿样基质的分离能力。

根据薄层分离结果及SPE填料的粒径，选取固相萃取填料硅胶、PEP、Florisl硅土及成品HLB小柱［13］，考察和优化尿液中提
取TDG的SPE条件。

取TDG标准品，加入过量的PFBZ，50℃反应30 min;在硅胶薄层板上点样，考
察TDG衍生化产物(TDG-PFBZ)与副产物的分离条件，选择和优化SPE条件。

2.4 尿样中TDG检测的方法学考察
取61.8 mg TDG标准品溶于10 mL甲醇中，定容，取0.82 mL于10 mL容量瓶中用甲醇定容得到0.5 g/L的母液备用;取空白对照组家兔尿液，用水稀释5倍后
做溶剂［13］，逐级稀释得到TDG标准溶液。

自制Florisil硅土(500 mg/3 mL)固相萃取柱，用4 mL乙酸乙酯平衡柱子，然后
取TDG标准溶液各100μL(0.3 ～ 100μg/L)，加入 50μL TDG-d8(120μg/L)为内标，上样后用 3.5 mL 乙酸乙酯洗脱;50 ℃旋干，加入80μL 吡啶，50μL 乙酸乙酯，20μL PFBZ，50 ℃ 反应 10 min，加入甲苯 150μL，涡旋、超声共5 min，加入
醋酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH 5)洗涤(0.5 mL×2)，然后将此反应产物进一步用SPE净化处理。

具体步骤为:自制Florisil(500 mg/3 mL)，4 mL乙酸乙酯(抽干)、4 mL CH2Cl2平衡柱子，将刚刚得到的样品上样，2 mL CH2Cl2、0.4 mL乙酸
乙酯淋洗，1.5 mL乙酸乙酯洗脱。

然后于50℃旋干，50μL甲苯复溶，进行NCI-
GC/MS分析，分别得出TDG衍生化产物(TDGPFB)与TDG-d8衍生化产物(TDGPFB-d8)的峰面积，并计算其比值，绘制TDG浓度与此比值的工作曲线。

取尿样100μL，加入50μL TDG-d8;之后处理同上，GC/MS分析得出峰面积，测得游离TDG含量。

2.5 色谱-质谱条件
GC条件:色谱柱起始温度为100℃，保持1 min，以25℃/min升温速率升至290℃，保持5 min;载气为氦气(0.8 mL/min)，0.5 min不分流进样，进样体积为1μL，进样口温度为280℃，传输线温度280℃。

MS参数:离子源和四极杆温度均为150℃，NCI模式，反应气为甲烷，扫描方式为SIM，溶剂延迟5 min，监测
离子m/z 510(M－·，目标离子)和518(M－·，氘代内标)。

3 结果与讨论
3.1 SPE条件的选择优化
各溶剂对TDG与尿样基质在硅胶薄层板上的分离能力如图1所示。

在薄层板上乙酸乙酯的分离能力较强，重点考察了乙酸乙酯对TDG和基质在硅胶和Florisl硅土SPE柱上的分离能力;同时，因为PEP和HLB填料性质相近［13］，根据文献［12］的条件，考察了TDG和基质在PEP和HLB上的分离效果，结果表明，Florisl硅土和HLB有较好的分离效果;但相对于Florisl硅土，HLB洗脱液浓缩至
干后仍有少量杂质(肉眼可见淡黄色斑点);考虑到HLB价格昂贵，最终确定了自装
的Florisl小柱(500 mg/3 mL)作为尿液中提取TDG的SPE小柱，实验确定的SPE条件见2.4节。

实验也表明，增加Florisl填料量，可提高尿液样品的上样量，如1.2 g/3 mL的柱子可上样0.5 mL尿样。

采用同样方法得到TDG衍生化产物的SPE净化条件(2.4节)，经SPE后，检测灵
敏度大幅提高;同时，由于去除了衍生化副产物的干扰，色谱图基线更加干净(图2)，色谱柱的使用寿命也得到延长。

3.2 TDG检测的方法学考察
3.2.1 工作曲线以TDG浓度为横坐标，TDG衍生化产物(TDGPFB)与内标TDG-
d8衍生化产物(TDGPFB-d8)的峰面积比值为纵坐标，绘制工作曲线(图3)，其中
线性相关系数R2＞0.999，线性良好，符合要求。

图1 各种溶剂对TDG与尿样基质的分离能力Fig.1 Separation capacities of different solvents for thiodiglyco(TDG)and urine matrix1.水，2.乙酸乙酯，3.乙腈，4.丙酮，5.甲醇，6.二氯甲烷，7.正庚烷。

1.Water;2. Ethyl acetate;3. Acetonitrile;4. Acetone;5.Methanol;6.Dichloromethane;7.Heptane.
图2 尿液中TDG(20μg/L)检测的GC/MS色谱图Fig.2 GC/MS chromatogram
of TDG in urine sample(20μg/L)a:目标离子m/z 510，b:内标离子m/z 518。

a:Target ion m/z 510;b:Internal standard m/z 518.
图3 ID-NCI-GC/MS检测尿样TDG的工作曲线Fig.3 Calibration curve for monitoring urine TDG based on isotope dilution negative ion chemical ionization(IDNCI)-GC/MS method
3.2.2 精密度和回收率以TDG-d8为内标，因其与TDG在结构、化学性质、复杂基质中的提取效率上基本保持一致，从而可保证定量检测方法的稳定性、重现性及准确性。

取6，20和60μg/L的标准溶液各100μL，处理同2.4节，日内重复3次，计算TDG测定的日内精密度;5日内重复操作，测定日间精密度;同时代入工作曲线得出回收率。

经检测，6，20和60μg/L TDG标准溶液日内重复测定的RSD
为1% ～6%，回收率为96% ～99%;日间重复测定的RSD为1% ～2%，回收率
为97% ～109%;因此，本研究建立尿液中TDG检测方法的精密度和回收率均符
合方法学要求。

3.2.3 检出限和定量限有研究表明，人尿液中通常含有痕量的内源性TDG［14］。

研究表明，空白家兔尿样中有时也含有痕量TDG。

为了排除本底TDG的影响，并
保证基质的一致性，在考察检出限与定量限时，首先选择无TDG或TDG含量低出的空白尿样，并经5倍稀释后作为溶剂，以此配制TDG标准溶液。

结果表明，本方法对 TDG 的检出限为0.1μg/L(S/N＞3)，定量限为 0.3μg/L(S/N＞10)。

3.3 家兔皮肤HD染毒后尿样中TDG的监测
3.3.1 TDG单日排出量随时间的变化取家兔皮肤HD染毒后的尿样，检测TDG浓度。

根据采集到的尿液体积，得出家兔皮肤HD染毒后尿样中TDG单日排出量随时间变化趋势。

由图4可见，家兔皮肤HD染毒后在第1日排出最多，随后逐渐减少。

2 mg/kg染毒组第1日排出TDG量为0.35μg;5 mg/kg染毒组排出
0.58μg;15 mg/kg染毒组排出量达到2.04μg。

中毒剂量越高，尿液中具有高含量TDG的排泄时间也越长，即HD损伤后TDG排出量有一定的时效和量效关系;因此，TDG含量的异常升高可作为HD损伤的重要诊断指标。

从图4还可见，TDG 含量随时间的变化呈现二次释放行为(如15 mg/kg组)，文献［16］在一名中毒患者尿液中发现类似现象，这可能是由于脂肪、组织中的HD再分配，或者是HD 与大分子共价结合后缓慢解离代谢出TDG。

另外，由于HD对家兔和人具有相近的LD50值，所以，相比于大鼠等其它小动物，家兔皮肤染毒模型可能更能反映人HD中毒的剂量与时间依赖关系。

图4 家兔皮肤HD染毒后TDG日排出量随时间的变化(自左向右依次为2，5，15 mg/kg染毒组)Fig.4 Changes in daily TDG excretion levels over time after rabbit skin exposure to sulfur mustard(HD)(from left to right:low-，medium-，and high-dose groups)
3.3.2 排出累加量随时间的变化图5为家兔皮肤HD染毒后尿样中TDG日排出累加量随时间的变化。

由图5可见，各染毒组于染毒后第1日内排出量最多，低剂量染毒组第2～3日，高剂量染毒组第2～5日仍有一个较多的累加过程，排出量呈缓慢增加趋势。

文献［17］报道，大鼠同位素标记HD(35SHD)染毒后，第1日
内排出的相关代谢产物(含35S)最多，而3～4天内大部分35S经尿液排出体外。

研究结果表明，TDG与HD总相关代谢产物的变化趋势基本一致。

图5 皮肤HD染毒后TDG排出累加量随时间的变化Fig.5 Changes in cumulative TDG excretion levels over time after rabbit skin exposure to HD 4 结论
以Florisil硅土为固相萃取填料，在优化SPE条件下，可检测到尿样中0.1μg/L TDG;而且，用同位素稀释法进行定量分析，保证了结果的准确性。

家兔HD皮肤染毒后，尿液中TDG含量迅速升高，在第1天内排出最多，然后快速减少，其排出量与染毒后时间和染毒剂量分别存在一定时效和量效关系，TDG 含量的异常升高可以作为HD损伤的重要诊断指标。

此外，相对于血样和组织样品，尿样中TDG的检测具有非损伤性取样，简单方便等优势，本方法可为销毁和处理化学武器(例如日本遗弃在华化学武器)工作人员的健康监测提供技术支持。

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