免疫实验报告王鹏

高级免疫学课程实验
学生姓名王鹏
学号1009
系别动物科学技术学院
专业基础兽医学
任课教师李焕荣副教授
2011年06月01日
多克隆抗体的制备、蛋白质粗提及鉴定
实验一多克隆抗体的制备
一实验目的
1．加深对抗体基本知识的了解。

⒉了解多克隆抗体的制备方法。

二实验原理
1.抗原注入家兔体内后，由于是外源大分子物质，将充当抗原刺激免疫系统，由B细胞产生多克隆抗体。

在实验中，抗原的纯度越高，越有利于实验。

如果抗原同免疫佐剂一同注入，佐剂将加强抗原的刺激效果，使家兔表达更多的抗体，其血清中的抗体浓度也会明显升高。

佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，本次实验采用弗氏不完全佐剂，由羊毛脂与液体石蜡以1：1混合，再与抗原溶液以1：1混合，研磨后形成“油包水”剂，抗原浓度为1mg/ml，每次注入1ml。

佐剂组与非佐剂组血清抗体效价的差别可以用ELISA检出。

2.双向免疫扩散实验原理
可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶层中从两个孔中向四周扩散，若两者分子比例适当，则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线。

观察该白线出现的最大稀释倍数即是抗体的效价。

3.ELISA原理（免疫酶链反应吸附实验）
该技术属于免疫酶技术。

酶免疫技术是利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

4、抗原和抗体在体内外均可以发生特异性结合，在体外特异性结合后可出现用肉眼或仪器鉴定的现象，并根据结果对样品中的抗原或抗体能进行定性、定量、定位的检测。

在进行抗原抗体反应时，多采用人或动物的血清作为抗体来源。

蛋白质抗原一般要求相对分子质量约在10000以上。

一般而言，相对分子质量越大，结构越复杂，免疫原性越强。

BSA的分子量约为67kDa，本实验以它为载体，与半抗原Hb和Dx偶联，可作为抗原刺激机体产生免疫应答。

为获得高质量的免疫血清通常使用免疫佐剂，它可增强抗原的免疫原型，延长其在体内的存留时间，使初次反应和二次反应融合在一起，使机体的抗体水平持续上升达到理想效果。

三实验材料
1 实验动物
12周龄家兔（2.0kg左右）
2 主要仪器
高速低温离心机
酶标仪
3试剂
弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂
HRP标记羊抗兔二抗
1%明胶
免疫原（Hb-BSA、Dx-BSA）、包被原（Hb-OV A、Dx-OV A）。

4 主要溶液配制
包被液（0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液）：准确称取Na2CO3 1.59 g ,NaHCO3 2.93 g，溶于950 mL的蒸馏水中，调pH值为9.6，定容到1 L。

0.01 mol/L PBS（pH 7.4）:
NaCl 8 g
KH2PO40.2 g
Na2HPO4（无水） 2.13 g
KCl 0.2 g
37℃加热溶解后，定容至1000 mL，121℃高压灭菌。

洗涤液（0.01 mol/L pH 7.4的PBST溶液）：1 L PBS中加入0.5 mL Tween-20。

封闭液（血清稀释液）：于PBST中加入明胶至终浓度为1%。

终止液（2 mol/L H2SO4）：分别取蒸馏水177.8 mL和浓硫酸22.2 mL混和即可。

0.1mol/l pH6.0磷酸盐缓冲液（PB）：称取Na2HPO4·2H2O 1.09g, NaH2PO4·H2O 6.05g,蒸馏水溶解后定容至500ml，4℃贮存备用。

TMB贮液:称取TMB10mg,溶于10ml二甲基亚砜中，4℃避光贮存备用。

TMB应用液（底物）:1ml的0.1mol/l pH6.0磷酸盐缓冲液，100 l的TMB贮液加15.l的30%H2O2，先用现配。

饱和硫酸铵（SAS）：查硫酸铵饱和度表，配置不同饱和度的硫酸铵，热至50～60℃保温数分钟，趁热滤去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1～2天。

四试验步骤
1针对Hb-BSA和Dx-OV A的多克隆抗体的制备
5周龄大耳白兔，Hb-BSA和Hb-BSA分别用无菌生理盐水配成2mg/ml溶液。

取上述溶液和等量的福氏完全佐剂混合并充分乳化后作为免疫抗原，试验组每只每次注射1ml乳化好的抗原，首次颈背部多点皮内免疫。

第二次以BSA溶液和等量福氏不完全佐剂混合并充分乳化作为免疫抗原皮下免疫一次。

第2次免疫7d后耳缘颈脉采血，间接ELISA方法检测效价，若没达到要求则重复一次第2次免疫操作；若达到要求，则以0.1mg/ml 的1ml Hb-BSA或Dx-BSA溶液（不加佐剂）皮下加强免疫，分三次注射，每次间隔15min。

一周后心脏采血，分离血清，4℃保存备用。

2 间接ELISA方法检测多抗效价
将抗血清从1：100倍比稀释至1：6400检测其效价。

ELISA操作步骤：1）将Hb-OV A和Dx-OV A用pH7.4 0.01mol/L PBS缓冲液稀释分别为最佳包被浓度，包被酶标条，4℃湿盒24h。

2）0.05%Tween-20pH7.4 0.01mol/L PBS清洗3次，每次3min，加入10mg/ml明胶封闭液，37℃湿盒2h。

3)洗涤同上，加入抗体的不同稀释液同时设空白对照，阴性对照；37℃湿盒1h。

4）洗涤同上，加入HRP标记SPA工作液；37℃湿盒1h。

5）洗涤同上，加入四甲基联苯胺（TMB）底物显色30min后50μl 2mol/L H2SO4终止反应。

6）用酶标仪于450nm比色。

7）稀释液为空白对照，以A450值大于或等于空白对照值2倍为阳性判定标准。

3 琼脂扩散测效价
将1mg/mlHb-OV A做100倍稀释，Dx-OV A做200倍稀释，相应抗血清从1:2倍比稀释至1:32检测其效价，步骤如下：
1）平皿中缓慢加入热融化的琼脂胶，厚度3mm。

2）待凝胶冷却后在其上打孔，孔径3-5mm，孔距4-7mm，中间一孔，周围6孔，打完孔后用针头挑出孔内琼脂，用酒精灯火焰封底。

3）加样，与中心孔加入稀释抗原，周围1-5孔加入稀释抗原，6孔加入阳性血清。

4）加样后将平皿置于搪瓷盒中，保持一定湿度，置室温48h判定结果。

五试验结果
1琼脂扩散试验效价
没有可看见白色的沉淀带。

2 ELISA抗血清效价
ELISA抗血清效价测定结果详见表1，结果显示制备的抗Hb-BSA(Dx-BSA)多克隆抗体效价。

表1 第一次间接ELISA测定BSA-HB多克隆抗体的效价
稀释度1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 空白
0.813 0.655 0.448 0.292 0.212 0.178 0.142 0.128
OD
值
表2 第二次间接ELISA测定BSA-HB多克隆抗体的效价稀释度1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 空白
1.913 1.936 1.655 1.477 0.894 0.642 0.423 0.089
OD
值
六讨论
1.将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结
和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。

通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。

首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。

但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。

免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。

三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。

通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。

2在第三次免疫后二周，用间接ELISA方法检测多克隆抗体效价，琼脂扩散试验测多克隆抗体效价，间接ELISA方法检测结果显示出经过三次免疫接种后，这只兔子血清抗体已经转阳，且效价较高，但未能达到制备高兔血清的要求，需要做第四次免疫。

而琼脂扩散试验呈阴性，可能是中心孔到四周孔之间的距离过远，抗原抗体未能特异性结合，没有产生肉眼可见的白色沉淀线。

3在第四次免疫接种后三周，用间接ELISA方法检测多克隆抗体效价，结果显示血清抗体效价很高，达到制备多克隆抗体的目的，再用水剂加强免疫一次后，心脏采血，制备血清准备做下一步提取鉴定实验用。

实验二硫酸铵沉淀法粗提抗体蛋白
一实验目的
1．熟悉多克隆抗体蛋白粗提的方法流程。

⒉理解硫酸铵沉淀法粗提蛋白的原理。

二实验原理
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

这种方法称之为盐析。

盐浓度通常用饱和度来表示。

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。

但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。

通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。

因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。

γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。

三实验材料
1 主要仪器
高速低温离心机
磁力搅拌器
2 实验材料
动物血清
透析袋（或玻璃纸）
3试剂及配制方法
0.01 mol/L PBS（pH 7.4）:
NaCl 8 g
KH2PO40.2 g
Na2HPO4（无水） 2.13 g
KCl 0.2 g
37℃加热溶解后，定容至1000 mL，121℃高压灭菌。

硫酸铵饱和溶液
硫酸铵800g~850g
H2O 1 000ml
加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NaOH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

四试验步骤
1、取1ml血清，加生理盐水1ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液2ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，4℃静置3h以上。

2、4000r/min离心20min，弃上清。

3、于沉淀中加1.5ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液1ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，4℃静置3h以上。

4、4000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。

重复步骤5，2~3次。

5、用5ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

6、透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。

7、收集透析后的蛋白液，-20℃保存。

五实验结果
利用硫酸铵沉淀法粗提蛋白，达到了初步纯化蛋白的目的，可以做一步的蛋白质SDS-PAGE电泳鉴定。

六讨论
（一）实验前要用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。

1.边搅拌边慢慢加（NH4）2SO4到样品溶液中，使浓度为0.5:1 (v/v) ；
2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6 小时或过夜（4℃）；3000 r/s离心30 min （4℃），保留上清液；上清液再加（NH4）2SO4到0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。

将沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；
3.上清液再加（NH4）2SO4 到0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。

将沉淀溶于PBS ，同前透析，除去（NH4）2SO4；
4.杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效
在该实验中，我们通过硫酸铵沉淀法粗提血清中的免疫球蛋白IgG，达到了预期的实验目标，为下一步进行SDS-PAGE蛋白质电泳做好准备。

实验三SDS-PAGE蛋白质电泳
一实验目的
1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；
2.掌握垂直板电泳的操作方法。

二实验原理
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’-亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS-PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS-PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

SDS-PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

三实验材料
1 主要仪器
电泳仪，电泳槽，摇床。

2 实验材料
动物血清
透析袋（或玻璃纸）
3试剂及配制方法
5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。

可在4℃保存数周，
或在－20℃保存数月。

凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，N,N’-二甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。

过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4℃保存。

pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4℃保存。

TEMED（四乙基乙二胺）原液
10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。

置4℃保存，临用前稀释10倍。

考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过
滤。

四试验步骤
1. 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2. 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，装好玻璃板；
3. 按如下体积配制12％分离胶5.0 ml，混匀；
ddH2O
1.675 ml
1.5 mol/LTris-HCl （pH=8.8） 1.25 ml
30%
Acr-Bis
2.0 ml
10%
SDS 5 0 ul
10%AP
50 ul
TEMED
2 ul
4. 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；
5. 按如下体积配制5％浓缩胶2.0 ml，混匀；
ddH2O
1.44 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=6.8252 ul
30%
Acr-Bis
248 ul
10%
SDS
20 ul
10%AP
20
ulTEMED
2 ul
6. 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
7．将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。

放入100℃加热5－10min，离心，取上清点样；
8. 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl；
9. 稳压90V，待溴酚蓝跑进分离胶时，增大电压至110V,待溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1h；
10. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm 脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净，成像即可。

五实验结果
M 1 2 3 4 5
图1：M 为蛋白质分子质量标准；1-2为Dx-BSA10倍稀释；3-4为Dx-OV A 原液；5 为阴
性对照。

六 讨论
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫酸钠）， SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与蛋白质分子量的大小有关。

在本实验中，我们通过对Dx-BSA10倍稀释和Dx-OVA 原液进行SDS-PAGE 电泳发现Dx-BSA 的分子量大小大约为70KDa ，Dx-OVA 的分子量大小大约为30KDa ，达到了初步掌握SDS-PAGE 蛋白质电泳的目的。

至于蛋白质的迁移率计算，以及后续的转印电泳和Western-Bloting 实验技能还有待于以后实验中进一步掌握。

20kDa
120kDa 25kDa
35kDa 50kDa 85kDa。