第六章 原生质体培养

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为保持释放出的原生质体的活力和膜稳定性,要 求酶液满足以下条件: 1、酶液渗透压必须与处理细胞的渗透压相似 同一种植物,子叶和下胚轴游离原生质体时需要的渗透 压最高,愈伤次之,胚性悬浮细胞要求最低。 可用原生质体培养基做溶剂,其渗透压合适。 2、酶液添加CaCl2·2H2O, KH2PO4和葡聚糖硫酸钾以提 高原生质体膜的稳定性。还可加入AgNO3减少酶解产 生的乙烯,加入过氧化物歧化酶减轻O2‾自由基对细胞 膜损伤,从而提高原生质体植板率。 3、MES(吗啉乙基磺酸)作为pH缓冲调节剂对于保持 酶解物的酸碱环境起缓冲作用,增加原生质体的释放 量和稳定性。 4、酶溶液最适pH范围为5.4~5.8 酶液配好后,过滤灭菌备用。
卵细胞的分离
※可先分离胚囊,从中分离卵细胞 ※也可直接从胚珠中分离卵细胞 ※周嫦和杨弘远首先建立胚囊分离技术- 酶解振荡法。 ※生活胚囊的分离方法:胚珠放在酶液中, 酶液:纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、 蜗牛酶或崩溃酶。 ※后发展为酶解-渗透压冲击法
卵细胞与胚囊其它细胞的分离 1
1、酶解法:延长酶解胚囊时间,使胚囊壁降解,卵细胞和其 它细胞释放出来。 酶解与研磨相结合。 优点:操作简单,适合分离大量胚珠 缺点:分离率偏低,影响材料生活力。 适合于:胚珠小而数量多,珠心薄的材料,如烟草。 2、解剖法 最佳解剖方式:横断胚珠,卵细胞与合子保持原位,易于分 辨与操作。 优点:操作准确度高,分离率高,无酶解伤害,易保持材料 生活力。 缺点:需要熟练的操作技巧,分离速度慢。 适合于:胚珠较大、数量较少、珠心厚的材料,如禾本科植 物。
第四节 原生质体再生植株的遗传性状及变异
一般由茎尖、叶肉、胚性组织细胞分离 的原生质体能较好保持原来的倍性 悬浮培养细胞特别是长期继代培养的细 胞分离的原生质体较易出现染色体倍性 及数目的变化 变异可能是材料本身存在的,也可能是 长期无性繁殖发生的。
第五节 性细胞原生质体培养进展
一个营养细胞和两个游离在营养细胞的细胞质中的 精细胞,为三细胞花粉 养细胞和一个生殖细胞,为二细胞花粉。花粉萌发 后,生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精子。 细胞花粉,需要先进行花粉的离体培养,待精子形 成后,再从花粉管中分离精子。
第二节 原生质体分离
1、材料选择及预处理 双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的 切段通常被用来制备原生质体 禾谷类植物,疏松易碎的愈伤或悬浮培养 的细胞是制备原生质体的理想材料 预处理目的:改变细胞和细胞壁的生理状 态,增加细胞膜的强度,提高酶解效率, 减少原生质体损伤。
预处理方法
1、枝条暗处理 获得的原生质体有活力,并能继续分裂。 2、叶片萎蔫处理 有利于撕除下表皮和原生质体分离 3、叶片预培养 叶片撕掉下表皮,在诱导愈伤的培养基上预培养 一段时间,再酶解脱壁,原生质体分裂频率提高很多。 4、预先质壁分离处理 先在糖溶液中质壁分离,再酶解去壁,可加快原 生质体释放,提高其活力。 5、胚性愈伤和悬浮细胞系的预培养 新鲜培养基中预培养一段时间再分离原生质体, 质量好,分裂频率高。
第六章 原生质体培养
原生质体(protoplast):植物细胞中,除细 胞壁以外的成分 原生质体研究的意义: 1、研究植物细胞壁的形成 2、实现细胞融合和细胞杂交 3、实现细胞对外源基因、DNA片段、细胞器、 染色体的捕获 原生质体为植物遗传工程研究提供了一个方便 的遗传操作实验系统
第一节 原生质体研究概况
第三节 原生质体培养
1、供体材料:单双子叶植物有所不同 2、培养基 ① 无机盐:大幅度降低铵离子浓度,可以只用硝态氮,同时附加有 机氮源。钙离子浓度可适当增加,提高原生质体膜稳定性。 ②碳源和渗透压:葡萄糖最适合,应过滤消毒。原生质体培养,必 须提供一个等渗或稍低于细胞内渗透压的外界环境。 ③有机附加物和激素:VB1、VB6、烟酸是必需的。很多时候,只需要 生长素,尤其2,4-D ④条件培养基:液体培养基培养生长迅速的细胞一段时间后,除去 细胞的培养液 ⑤pH:5.6~5.8,以MES、葡聚糖硫酸钾等调节 ⑥常用基本培养基:KM8p和NT KM8p:高国楠建立,用于豆科和禾谷类原生质体培养 NT:双子叶植物原生质体培养 培养基通常过滤消毒 ⑦ 培养的原生质体密度 培养单个原生质体之前,最好在高密度下培养数天。
制备原生质体的酶类
纤维素酶:自绿色木霉提取 果胶酶:自根霉提取,将植物组织解析为单个细胞 崩溃酶:同时具有纤维素酶和果胶酶活性,用于从 根尖细胞和培养细胞分离原生质体 半纤维素酶 蜗牛酶:对孢粉素和木质素均有一定分解能力,可 从花粉母细胞、四分体、小孢子或较老的植物组 织分离原生质体
酶溶液的配制
原生质体的培养方法
培养方式: ① 固体培养:琼脂或平板培养。可定点观察一个原生质 体的再生、生长和分裂,但分裂慢,操作繁琐。 ② 液体浅层培养:简单,对原生质体损伤小,易于添加 新鲜培养基和转移培养物,但原生质体分布不均,易 粘连,难以定点追踪。 ③ 微滴培养(droplet culture):可进行多组合试验, 可进行融合体及单个原生质体培养和观察。但易挥发, 可覆盖矿物油。 ④ 滋养培养(nurse culture):利用能分泌生物活性物 质的细胞或组织培养物作为滋养者,促进原生质体的 分裂和生长。
分离原生质体的方法
1、机械法 叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中,使细胞 发生质壁分离,原生质体收缩成球形,完全脱 离细胞壁。剪碎组织,可释放原生质体。 缺点:产量低,无法从分生组织分离原生质体。 2、酶法(在第二节详述) 1960,Cocking最先采用
原生质体培养的成果
1971,Nagata和Takebe从培养的烟草叶肉细 胞原生质体获得完整的再生植株 我国学者在50多种植物上首先获得原生质体 再生植株,并得到多种植物的细胞杂种 中科院植物所、遗传所、上海植物生理研究 所做出了重要贡献。
卵细胞与胚囊其它细胞的分离 2
酶解-ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ剖法 优点:分离率较高 缺点:酶解若过度或清洗不彻底,会对后 期合子培养产生不利影响。
二细胞花粉的精细胞分离
1、花粉离体培养法:花粉在液体培养基中人工 萌发,待形成精细胞后,用渗透压冲击或研磨 使花粉管破裂。 缺点:精细胞形成不同步,分离的精细胞中混杂 尚未分裂的生殖细胞,使精细胞纯度降低。 2、活体-离体法:先将花粉授在柱头上,花粉 萌发并产生精子后,用渗透压冲击法分离。 优点:分离的精细胞纯度高,接近受精前的发育 状态。 3、改进的活体-离体法
原生质体制备
材料和酶液体积比:1:10 酶解时间因材料而异 酶解温度25~30℃ 黑暗或弱光下酶解 静置或摇床上酶解
原生质体活力检测方法
1、形态:来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色,叶绿体 及细胞内小颗粒在不停运动;来自愈伤或悬浮细胞的 原生质体,可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状 内含物布朗运动快慢来判断。 2、染色:1%酚番红或伊文斯兰染色检测,活的原生质 体不着色,死的立即染色。 3、FDA(Fluorescein diacetate,荧光素双醋酸盐) 活体 染色:FDA能透过原生质体膜,在内酯酶作用下水解 为不能排出的,累积在质膜内的荧光素。在荧光显微 镜下观察时,凡发淡绿荧光的都是活的原生质体。 4、CFW(荧光增白剂)染色法:新细胞壁再生产生绿 色荧光
精细胞分离 ※三细胞花粉:禾本科与十字花科植物,花粉中含有
※二细胞花粉:茄科和百合科植物,花粉中有一个营
※三细胞花粉,可以直接从成熟花粉中分离精子;二
三细胞花粉的精细胞分离
1、渗透压冲击法:花粉置于低渗溶液中,吸水破裂,释 放出精细胞。经低速离心,得到精细胞。 优点:花粉壁碎片大,易于过滤清除。 缺点:渗透压突然变化对精子生理状态不利。 2、研磨法:成熟花粉悬浮于适当溶液中,研磨使花粉破 裂,释放精细胞。 优点:不过分依赖花粉成熟度,特别适合于在低渗溶液 中不易破碎的花粉。 缺点:花粉壁碎片小,不易清除。
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