第六章 原生质体培养
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为保持释放出的原生质体的活力和膜稳定性，要 求酶液满足以下条件： 1、酶液渗透压必须与处理细胞的渗透压相似 同一种植物，子叶和下胚轴游离原生质体时需要的渗透 压最高，愈伤次之，胚性悬浮细胞要求最低。 可用原生质体培养基做溶剂，其渗透压合适。 2、酶液添加CaCl2·2H2O, KH2PO4和葡聚糖硫酸钾以提 高原生质体膜的稳定性。还可加入AgNO3减少酶解产 生的乙烯，加入过氧化物歧化酶减轻O2‾自由基对细胞 膜损伤，从而提高原生质体植板率。 3、MES（吗啉乙基磺酸）作为pH缓冲调节剂对于保持 酶解物的酸碱环境起缓冲作用，增加原生质体的释放 量和稳定性。 4、酶溶液最适pH范围为5.4~5.8 酶液配好后，过滤灭菌备用。
卵细胞的分离
※可先分离胚囊，从中分离卵细胞 ※也可直接从胚珠中分离卵细胞 ※周嫦和杨弘远首先建立胚囊分离技术－ 酶解振荡法。 ※生活胚囊的分离方法：胚珠放在酶液中， 酶液：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、 蜗牛酶或崩溃酶。 ※后发展为酶解－渗透压冲击法
卵细胞与胚囊其它细胞的分离 1
1、酶解法：延长酶解胚囊时间，使胚囊壁降解，卵细胞和其 它细胞释放出来。 酶解与研磨相结合。 优点：操作简单，适合分离大量胚珠 缺点：分离率偏低，影响材料生活力。 适合于：胚珠小而数量多，珠心薄的材料，如烟草。 2、解剖法 最佳解剖方式：横断胚珠，卵细胞与合子保持原位，易于分 辨与操作。 优点：操作准确度高，分离率高，无酶解伤害，易保持材料 生活力。 缺点：需要熟练的操作技巧，分离速度慢。 适合于：胚珠较大、数量较少、珠心厚的材料，如禾本科植 物。
第四节 原生质体再生植株的遗传性状及变异
一般由茎尖、叶肉、胚性组织细胞分离 的原生质体能较好保持原来的倍性 悬浮培养细胞特别是长期继代培养的细 胞分离的原生质体较易出现染色体倍性 及数目的变化 变异可能是材料本身存在的，也可能是 长期无性繁殖发生的。
第五节 性细胞原生质体培养进展
一个营养细胞和两个游离在营养细胞的细胞质中的 精细胞，为三细胞花粉 养细胞和一个生殖细胞，为二细胞花粉。花粉萌发 后，生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精子。 细胞花粉，需要先进行花粉的离体培养，待精子形 成后，再从花粉管中分离精子。
第二节 原生质体分离
1、材料选择及预处理 双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的 切段通常被用来制备原生质体 禾谷类植物，疏松易碎的愈伤或悬浮培养 的细胞是制备原生质体的理想材料 预处理目的：改变细胞和细胞壁的生理状 态，增加细胞膜的强度，提高酶解效率， 减少原生质体损伤。
预处理方法
1、枝条暗处理 获得的原生质体有活力，并能继续分裂。 2、叶片萎蔫处理 有利于撕除下表皮和原生质体分离 3、叶片预培养 叶片撕掉下表皮，在诱导愈伤的培养基上预培养 一段时间，再酶解脱壁，原生质体分裂频率提高很多。 4、预先质壁分离处理 先在糖溶液中质壁分离，再酶解去壁，可加快原 生质体释放，提高其活力。 5、胚性愈伤和悬浮细胞系的预培养 新鲜培养基中预培养一段时间再分离原生质体， 质量好，分裂频率高。
第六章 原生质体培养
原生质体（protoplast）：植物细胞中，除细 胞壁以外的成分 原生质体研究的意义： 1、研究植物细胞壁的形成 2、实现细胞融合和细胞杂交 3、实现细胞对外源基因、DNA片段、细胞器、 染色体的捕获 原生质体为植物遗传工程研究提供了一个方便 的遗传操作实验系统
第一节 原生质体研究概况
第三节 原生质体培养
1、供体材料：单双子叶植物有所不同 2、培养基 ① 无机盐：大幅度降低铵离子浓度，可以只用硝态氮，同时附加有 机氮源。钙离子浓度可适当增加，提高原生质体膜稳定性。 ②碳源和渗透压：葡萄糖最适合，应过滤消毒。原生质体培养，必 须提供一个等渗或稍低于细胞内渗透压的外界环境。 ③有机附加物和激素：VB1、VB6、烟酸是必需的。很多时候，只需要 生长素，尤其2,4-D ④条件培养基：液体培养基培养生长迅速的细胞一段时间后，除去 细胞的培养液 ⑤pH：5.6～5.8，以MES、葡聚糖硫酸钾等调节 ⑥常用基本培养基：KM8p和NT KM8p：高国楠建立，用于豆科和禾谷类原生质体培养 NT：双子叶植物原生质体培养 培养基通常过滤消毒 ⑦ 培养的原生质体密度 培养单个原生质体之前，最好在高密度下培养数天。
制备原生质体的酶类
纤维素酶：自绿色木霉提取 果胶酶：自根霉提取，将植物组织解析为单个细胞 崩溃酶：同时具有纤维素酶和果胶酶活性，用于从 根尖细胞和培养细胞分离原生质体 半纤维素酶 蜗牛酶：对孢粉素和木质素均有一定分解能力，可 从花粉母细胞、四分体、小孢子或较老的植物组 织分离原生质体
酶溶液的配制
原生质体的培养方法
培养方式： ① 固体培养：琼脂或平板培养。可定点观察一个原生质 体的再生、生长和分裂，但分裂慢，操作繁琐。 ② 液体浅层培养：简单，对原生质体损伤小，易于添加 新鲜培养基和转移培养物，但原生质体分布不均，易 粘连，难以定点追踪。 ③ 微滴培养（droplet culture):可进行多组合试验， 可进行融合体及单个原生质体培养和观察。但易挥发， 可覆盖矿物油。 ④ 滋养培养（nurse culture):利用能分泌生物活性物 质的细胞或组织培养物作为滋养者，促进原生质体的 分裂和生长。
分离原生质体的方法
1、机械法 叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞 发生质壁分离，原生质体收缩成球形，完全脱 离细胞壁。剪碎组织，可释放原生质体。 缺点：产量低，无法从分生组织分离原生质体。 2、酶法（在第二节详述） 1960，Cocking最先采用
原生质体培养的成果
1971，Nagata和Takebe从培养的烟草叶肉细 胞原生质体获得完整的再生植株 我国学者在50多种植物上首先获得原生质体 再生植株，并得到多种植物的细胞杂种 中科院植物所、遗传所、上海植物生理研究 所做出了重要贡献。
卵细胞与胚囊其它细胞的分离 2
酶解－ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ剖法 优点：分离率较高 缺点：酶解若过度或清洗不彻底，会对后 期合子培养产生不利影响。
二细胞花粉的精细胞分离
1、花粉离体培养法：花粉在液体培养基中人工 萌发，待形成精细胞后，用渗透压冲击或研磨 使花粉管破裂。 缺点：精细胞形成不同步，分离的精细胞中混杂 尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。 2、活体－离体法：先将花粉授在柱头上，花粉 萌发并产生精子后，用渗透压冲击法分离。 优点：分离的精细胞纯度高，接近受精前的发育 状态。 3、改进的活体－离体法
原生质体制备
材料和酶液体积比：1：10 酶解时间因材料而异 酶解温度25～30℃ 黑暗或弱光下酶解 静置或摇床上酶解
原生质体活力检测方法
1、形态：来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色，叶绿体 及细胞内小颗粒在不停运动；来自愈伤或悬浮细胞的 原生质体，可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状 内含物布朗运动快慢来判断。 2、染色：1％酚番红或伊文斯兰染色检测，活的原生质 体不着色，死的立即染色。 3、FDA（Fluorescein diacetate，荧光素双醋酸盐） 活体 染色：FDA能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解 为不能排出的，累积在质膜内的荧光素。在荧光显微 镜下观察时，凡发淡绿荧光的都是活的原生质体。 4、CFW（荧光增白剂）染色法：新细胞壁再生产生绿 色荧光
精细胞分离 ※三细胞花粉：禾本科与十字花科植物，花粉中含有
※二细胞花粉：茄科和百合科植物，花粉中有一个营
※三细胞花粉，可以直接从成熟花粉中分离精子；二
三细胞花粉的精细胞分离
1、渗透压冲击法：花粉置于低渗溶液中，吸水破裂，释 放出精细胞。经低速离心，得到精细胞。 优点：花粉壁碎片大，易于过滤清除。 缺点：渗透压突然变化对精子生理状态不利。 2、研磨法：成熟花粉悬浮于适当溶液中，研磨使花粉破 裂，释放精细胞。 优点：不过分依赖花粉成熟度，特别适合于在低渗溶液 中不易破碎的花粉。 缺点：花粉壁碎片小，不易清除。
卵细胞的分离
※可先分离胚囊，从中分离卵细胞 ※也可直接从胚珠中分离卵细胞 ※周嫦和杨弘远首先建立胚囊分离技术－ 酶解振荡法。 ※生活胚囊的分离方法：胚珠放在酶液中， 酶液：纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、 蜗牛酶或崩溃酶。 ※后发展为酶解－渗透压冲击法
卵细胞与胚囊其它细胞的分离 1
1、酶解法：延长酶解胚囊时间，使胚囊壁降解，卵细胞和其 它细胞释放出来。 酶解与研磨相结合。 优点：操作简单，适合分离大量胚珠 缺点：分离率偏低，影响材料生活力。 适合于：胚珠小而数量多，珠心薄的材料，如烟草。 2、解剖法 最佳解剖方式：横断胚珠，卵细胞与合子保持原位，易于分 辨与操作。 优点：操作准确度高，分离率高，无酶解伤害，易保持材料 生活力。 缺点：需要熟练的操作技巧，分离速度慢。 适合于：胚珠较大、数量较少、珠心厚的材料，如禾本科植 物。
第四节 原生质体再生植株的遗传性状及变异
一般由茎尖、叶肉、胚性组织细胞分离 的原生质体能较好保持原来的倍性 悬浮培养细胞特别是长期继代培养的细 胞分离的原生质体较易出现染色体倍性 及数目的变化 变异可能是材料本身存在的，也可能是 长期无性繁殖发生的。
第五节 性细胞原生质体培养进展
一个营养细胞和两个游离在营养细胞的细胞质中的 精细胞，为三细胞花粉 养细胞和一个生殖细胞，为二细胞花粉。花粉萌发 后，生殖细胞在花粉管中分裂形成两个精子。 细胞花粉，需要先进行花粉的离体培养，待精子形 成后，再从花粉管中分离精子。
第二节 原生质体分离
1、材料选择及预处理 双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的 切段通常被用来制备原生质体 禾谷类植物，疏松易碎的愈伤或悬浮培养 的细胞是制备原生质体的理想材料 预处理目的：改变细胞和细胞壁的生理状 态，增加细胞膜的强度，提高酶解效率， 减少原生质体损伤。
预处理方法
1、枝条暗处理 获得的原生质体有活力，并能继续分裂。 2、叶片萎蔫处理 有利于撕除下表皮和原生质体分离 3、叶片预培养 叶片撕掉下表皮，在诱导愈伤的培养基上预培养 一段时间，再酶解脱壁，原生质体分裂频率提高很多。 4、预先质壁分离处理 先在糖溶液中质壁分离，再酶解去壁，可加快原 生质体释放，提高其活力。 5、胚性愈伤和悬浮细胞系的预培养 新鲜培养基中预培养一段时间再分离原生质体， 质量好，分裂频率高。
第六章 原生质体培养
原生质体（protoplast）：植物细胞中，除细 胞壁以外的成分 原生质体研究的意义： 1、研究植物细胞壁的形成 2、实现细胞融合和细胞杂交 3、实现细胞对外源基因、DNA片段、细胞器、 染色体的捕获 原生质体为植物遗传工程研究提供了一个方便 的遗传操作实验系统
第一节 原生质体研究概况
第三节 原生质体培养
1、供体材料：单双子叶植物有所不同 2、培养基 ① 无机盐：大幅度降低铵离子浓度，可以只用硝态氮，同时附加有 机氮源。钙离子浓度可适当增加，提高原生质体膜稳定性。 ②碳源和渗透压：葡萄糖最适合，应过滤消毒。原生质体培养，必 须提供一个等渗或稍低于细胞内渗透压的外界环境。 ③有机附加物和激素：VB1、VB6、烟酸是必需的。很多时候，只需要 生长素，尤其2,4-D ④条件培养基：液体培养基培养生长迅速的细胞一段时间后，除去 细胞的培养液 ⑤pH：5.6～5.8，以MES、葡聚糖硫酸钾等调节 ⑥常用基本培养基：KM8p和NT KM8p：高国楠建立，用于豆科和禾谷类原生质体培养 NT：双子叶植物原生质体培养 培养基通常过滤消毒 ⑦ 培养的原生质体密度 培养单个原生质体之前，最好在高密度下培养数天。
制备原生质体的酶类
纤维素酶：自绿色木霉提取 果胶酶：自根霉提取，将植物组织解析为单个细胞 崩溃酶：同时具有纤维素酶和果胶酶活性，用于从 根尖细胞和培养细胞分离原生质体 半纤维素酶 蜗牛酶：对孢粉素和木质素均有一定分解能力，可 从花粉母细胞、四分体、小孢子或较老的植物组 织分离原生质体
酶溶液的配制
原生质体的培养方法
培养方式： ① 固体培养：琼脂或平板培养。可定点观察一个原生质 体的再生、生长和分裂，但分裂慢，操作繁琐。 ② 液体浅层培养：简单，对原生质体损伤小，易于添加 新鲜培养基和转移培养物，但原生质体分布不均，易 粘连，难以定点追踪。 ③ 微滴培养（droplet culture):可进行多组合试验， 可进行融合体及单个原生质体培养和观察。但易挥发， 可覆盖矿物油。 ④ 滋养培养（nurse culture):利用能分泌生物活性物 质的细胞或组织培养物作为滋养者，促进原生质体的 分裂和生长。
分离原生质体的方法
1、机械法 叶肉或其它细胞放在高渗的蔗糖溶液中，使细胞 发生质壁分离，原生质体收缩成球形，完全脱 离细胞壁。剪碎组织，可释放原生质体。 缺点：产量低，无法从分生组织分离原生质体。 2、酶法（在第二节详述） 1960，Cocking最先采用
原生质体培养的成果
1971，Nagata和Takebe从培养的烟草叶肉细 胞原生质体获得完整的再生植株 我国学者在50多种植物上首先获得原生质体 再生植株，并得到多种植物的细胞杂种 中科院植物所、遗传所、上海植物生理研究 所做出了重要贡献。
卵细胞与胚囊其它细胞的分离 2
酶解－ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ剖法 优点：分离率较高 缺点：酶解若过度或清洗不彻底，会对后 期合子培养产生不利影响。
二细胞花粉的精细胞分离
1、花粉离体培养法：花粉在液体培养基中人工 萌发，待形成精细胞后，用渗透压冲击或研磨 使花粉管破裂。 缺点：精细胞形成不同步，分离的精细胞中混杂 尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。 2、活体－离体法：先将花粉授在柱头上，花粉 萌发并产生精子后，用渗透压冲击法分离。 优点：分离的精细胞纯度高，接近受精前的发育 状态。 3、改进的活体－离体法
原生质体制备
材料和酶液体积比：1：10 酶解时间因材料而异 酶解温度25～30℃ 黑暗或弱光下酶解 静置或摇床上酶解
原生质体活力检测方法
1、形态：来自叶肉细胞的活原生质体应该绿色，叶绿体 及细胞内小颗粒在不停运动；来自愈伤或悬浮细胞的 原生质体，可根据细胞质内原生质环流速度或颗粒状 内含物布朗运动快慢来判断。 2、染色：1％酚番红或伊文斯兰染色检测，活的原生质 体不着色，死的立即染色。 3、FDA（Fluorescein diacetate，荧光素双醋酸盐） 活体 染色：FDA能透过原生质体膜，在内酯酶作用下水解 为不能排出的，累积在质膜内的荧光素。在荧光显微 镜下观察时，凡发淡绿荧光的都是活的原生质体。 4、CFW（荧光增白剂）染色法：新细胞壁再生产生绿 色荧光
精细胞分离 ※三细胞花粉：禾本科与十字花科植物，花粉中含有
※二细胞花粉：茄科和百合科植物，花粉中有一个营
※三细胞花粉，可以直接从成熟花粉中分离精子；二
三细胞花粉的精细胞分离
1、渗透压冲击法：花粉置于低渗溶液中，吸水破裂，释 放出精细胞。经低速离心，得到精细胞。 优点：花粉壁碎片大，易于过滤清除。 缺点：渗透压突然变化对精子生理状态不利。 2、研磨法：成熟花粉悬浮于适当溶液中，研磨使花粉破 裂，释放精细胞。 优点：不过分依赖花粉成熟度，特别适合于在低渗溶液 中不易破碎的花粉。 缺点：花粉壁碎片小，不易清除。