课件14：3.2 月季的花药培养
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直接由器官产生
胚状体 由单个细胞产生 由愈伤组织产生
（三）影响花药培养的因素
1、材料的选择（内因） 花期：初花期 花粉：单核期（细胞核由中央移向细胞一侧） 花蕾：完全未开放
材料的选择： 花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。一般，月季 的花药培养时间选在五月初到五月中旬，即月季的初花期。 选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。一 般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药 培养成功率最高。为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未 开放的花蕾。
月季的花药培养
课题目标
说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生花粉植株的 两种途径，说出影响花药培养的因素，学习花药培养的基 本技术，尝试用月季或其他植物的花药进行培养。
（一）被子植物的花粉发育
雄蕊
花丝 花药：囊状结构，内有很多花粉
花粉是由花粉母细胞（小孢子母细胞）历经减数分裂、有丝分裂 而形成的，花粉是单倍体的生殖细胞。 花粉的发育要经历：小孢子四分体时期、单核期、双核期等阶段。
色体数，而且为纯种。
结果分析与评价
1、你能通过镜检找到处于适宜的发育期的花粉吗？ 选材是否成功是花药培养成功的关键，应通过显微镜观察处于适 宜发育期的花粉。 2、你的花药培养被污染了吗？如有请分析产生原因。 如果出现污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消 毒或接种等有问题。 3、你接种的花药是否长出了花粉愈伤组织或胚状体？ 如长出愈伤组织或胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时 转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。
③两个精子和一个营养核的基因型相同。
④1花粉母细胞
减数分裂
4个小孢子
有丝 分裂
4个花粉管细胞核
4个生殖细胞核
有丝 分裂
8个精子
（二）产生花粉植株的两种途径
①
花药中 的花粉
脱分化
胚状体
分化
丛芽
②
花药中 的花粉
脱分化
再分化
愈伤组织
丛芽
诱导
移栽
生根
体细胞胚（胚状体）： 在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育 成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，被称为 体细胞胚（胚状体）。
母细胞
小孢子
1个小孢子 （单核居中期）
2n
n
营养
细胞
精子
n
n
精子
有丝分裂 生殖 细胞
n
花粉管 细胞核
n
生殖 细胞核
n
n
有丝分裂
注意：
①二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞 核。（精子在花粉管中形成）
②三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次 有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养 核和两个精子。
思考： 为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？
①花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料 的消毒带来困难。 ②保证花粉发育的时期是单核期。
完全未开放的月季花蕾
略微开放的月季花蕾
2、培养基的组成 培养基因植物不同而有所变化。 植物激素的种类及其浓度配比常对诱导细胞分裂，生 长和分化起决定作用。 3、其他条件 亲本植物的生长条件 材料的低温预处理 接种密度
②某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法， 这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
1、醋酸洋红法 （1）醋酸洋红法染色机理：醋酸洋红为碱性染色剂，而花粉细 胞内有染色体，染色体主要成分是DNA和蛋白质,易被碱性染料 着色染成红色 。
（2）醋酸洋红的配置：将体积分数45％的醋酸100ml煮沸，缓 缓加入1g洋红，再加热回流8h，冷却至50℃，过滤即可。
2、消毒液处理
（1）放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2—4分钟（也可质量分数 为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液） （2）无菌水冲洗3—5次 用于培养的花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖 片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。
（三）接种和培养 1、剥取花药: 灭菌后的花蕾，在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药
（小孢子四 分体时期）
小孢子 减数 4个小 母细胞 分裂 孢子
特点：细胞质浓厚
1个小孢子 （单核居中期）
（单核期）
精子 精子
营养 细胞
有丝分裂 生殖 细胞
花粉管 细胞核
生殖 细胞核
有丝 分裂
（双核期）
问：如果小孢子母细胞染色体数为2n， 成熟的花粉粒有几个细胞？ 染色体总数数目是多少？
n
小孢子 减数分裂 4个
实验操作
（一）材料的选取 （二）材料的消毒 （三）接种和培养
（一）材料的选取 选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于 适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法有醋酸 洋红法。但是某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙 花青—铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
①最常用的方法有醋酸洋红法
（3）染色操作：花药应该先在卡诺氏固定液中固定20min， 然后取出放在载玻片上，加焙花青—铬钒溶液染色，盖上盖 玻片后在显微镜下检查。
（4）染色结果：将花粉细胞核染成蓝黑色Βιβλιοθήκη 二）材料的消毒1、酒精处理
（1）通常先将花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡约30秒，立即取出。 （2）无菌水清洗 （3)无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分
注意： ①勿损伤花药：以免诱导出非花粉愈伤组织 ②要彻底去除花丝：因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织 或胚状体的形成
2、接种:立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10 个。
3、培养 （1）培养条件： 温度：25℃左右； 光照：不需要光照，小植株形成后光照。
（2）培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长 出愈伤组织或释放出胚状体。 ①如长出愈伤组织：则将愈伤组织及时转移到分化培养基上 ，以便进一步分化出再生植株。 ②如果花药开裂释放出胚状体：则一个花药内就会产生大量 幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移 植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。
观
5、植物组织培养技术与花药培养技术的异同点
项目
相同点
不同点
植物组织培养 技术
花药培养技术
外植体为体细胞，染
色体数无需加倍。
离体的植物组织经脱分
化形成愈伤组织，再分 取材为花药，培养的为
单倍体幼苗，植株弱小，
化成丛芽，诱导出根， 高度不育，必须用秋水
然后进行移栽。
仙素处理，使染色体加
倍，恢复正常植株的染
诱导丛芽或胚状体培养基配方：MS培养基中加GA (0.1mg/L) IBA (0.5mg/L)和ＢＡ(1mg/L); 诱导生根培养基配方：MS培养基各成分用量减半，添加IAA (1.5mg/L)
4、鉴定和筛选： 在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，染色体 的数目常常会出现变化（常出现染色体数目倍性的变化，主要 原因是营养核和生殖核融合造成的）
（3）染色操作：将花药放在载玻片上，加一滴质量分数1％的 醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显微镜下检查。
2、焙花青—铬钒法 （1）将无水酒精与冰醋酸按体积比为3：1的比例混匀 （2）将5g铬明矾[K2SO4Cr2(SO4)3·24H2O]加入90ml蒸馏水中 ，溶解后加入0.1g焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸5分钟后 冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至100ml。
胚状体 由单个细胞产生 由愈伤组织产生
（三）影响花药培养的因素
1、材料的选择（内因） 花期：初花期 花粉：单核期（细胞核由中央移向细胞一侧） 花蕾：完全未开放
材料的选择： 花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。一般，月季 的花药培养时间选在五月初到五月中旬，即月季的初花期。 选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。一 般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药 培养成功率最高。为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未 开放的花蕾。
月季的花药培养
课题目标
说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生花粉植株的 两种途径，说出影响花药培养的因素，学习花药培养的基 本技术，尝试用月季或其他植物的花药进行培养。
（一）被子植物的花粉发育
雄蕊
花丝 花药：囊状结构，内有很多花粉
花粉是由花粉母细胞（小孢子母细胞）历经减数分裂、有丝分裂 而形成的，花粉是单倍体的生殖细胞。 花粉的发育要经历：小孢子四分体时期、单核期、双核期等阶段。
色体数，而且为纯种。
结果分析与评价
1、你能通过镜检找到处于适宜的发育期的花粉吗？ 选材是否成功是花药培养成功的关键，应通过显微镜观察处于适 宜发育期的花粉。 2、你的花药培养被污染了吗？如有请分析产生原因。 如果出现污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消 毒或接种等有问题。 3、你接种的花药是否长出了花粉愈伤组织或胚状体？ 如长出愈伤组织或胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时 转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。
③两个精子和一个营养核的基因型相同。
④1花粉母细胞
减数分裂
4个小孢子
有丝 分裂
4个花粉管细胞核
4个生殖细胞核
有丝 分裂
8个精子
（二）产生花粉植株的两种途径
①
花药中 的花粉
脱分化
胚状体
分化
丛芽
②
花药中 的花粉
脱分化
再分化
愈伤组织
丛芽
诱导
移栽
生根
体细胞胚（胚状体）： 在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育 成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，被称为 体细胞胚（胚状体）。
母细胞
小孢子
1个小孢子 （单核居中期）
2n
n
营养
细胞
精子
n
n
精子
有丝分裂 生殖 细胞
n
花粉管 细胞核
n
生殖 细胞核
n
n
有丝分裂
注意：
①二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞 核。（精子在花粉管中形成）
②三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次 有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养 核和两个精子。
思考： 为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？
①花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料 的消毒带来困难。 ②保证花粉发育的时期是单核期。
完全未开放的月季花蕾
略微开放的月季花蕾
2、培养基的组成 培养基因植物不同而有所变化。 植物激素的种类及其浓度配比常对诱导细胞分裂，生 长和分化起决定作用。 3、其他条件 亲本植物的生长条件 材料的低温预处理 接种密度
②某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法， 这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
1、醋酸洋红法 （1）醋酸洋红法染色机理：醋酸洋红为碱性染色剂，而花粉细 胞内有染色体，染色体主要成分是DNA和蛋白质,易被碱性染料 着色染成红色 。
（2）醋酸洋红的配置：将体积分数45％的醋酸100ml煮沸，缓 缓加入1g洋红，再加热回流8h，冷却至50℃，过滤即可。
2、消毒液处理
（1）放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2—4分钟（也可质量分数 为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液） （2）无菌水冲洗3—5次 用于培养的花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖 片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。
（三）接种和培养 1、剥取花药: 灭菌后的花蕾，在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药
（小孢子四 分体时期）
小孢子 减数 4个小 母细胞 分裂 孢子
特点：细胞质浓厚
1个小孢子 （单核居中期）
（单核期）
精子 精子
营养 细胞
有丝分裂 生殖 细胞
花粉管 细胞核
生殖 细胞核
有丝 分裂
（双核期）
问：如果小孢子母细胞染色体数为2n， 成熟的花粉粒有几个细胞？ 染色体总数数目是多少？
n
小孢子 减数分裂 4个
实验操作
（一）材料的选取 （二）材料的消毒 （三）接种和培养
（一）材料的选取 选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于 适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法有醋酸 洋红法。但是某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙 花青—铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
①最常用的方法有醋酸洋红法
（3）染色操作：花药应该先在卡诺氏固定液中固定20min， 然后取出放在载玻片上，加焙花青—铬钒溶液染色，盖上盖 玻片后在显微镜下检查。
（4）染色结果：将花粉细胞核染成蓝黑色Βιβλιοθήκη 二）材料的消毒1、酒精处理
（1）通常先将花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡约30秒，立即取出。 （2）无菌水清洗 （3)无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分
注意： ①勿损伤花药：以免诱导出非花粉愈伤组织 ②要彻底去除花丝：因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织 或胚状体的形成
2、接种:立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10 个。
3、培养 （1）培养条件： 温度：25℃左右； 光照：不需要光照，小植株形成后光照。
（2）培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长 出愈伤组织或释放出胚状体。 ①如长出愈伤组织：则将愈伤组织及时转移到分化培养基上 ，以便进一步分化出再生植株。 ②如果花药开裂释放出胚状体：则一个花药内就会产生大量 幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移 植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。
观
5、植物组织培养技术与花药培养技术的异同点
项目
相同点
不同点
植物组织培养 技术
花药培养技术
外植体为体细胞，染
色体数无需加倍。
离体的植物组织经脱分
化形成愈伤组织，再分 取材为花药，培养的为
单倍体幼苗，植株弱小，
化成丛芽，诱导出根， 高度不育，必须用秋水
然后进行移栽。
仙素处理，使染色体加
倍，恢复正常植株的染
诱导丛芽或胚状体培养基配方：MS培养基中加GA (0.1mg/L) IBA (0.5mg/L)和ＢＡ(1mg/L); 诱导生根培养基配方：MS培养基各成分用量减半，添加IAA (1.5mg/L)
4、鉴定和筛选： 在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，染色体 的数目常常会出现变化（常出现染色体数目倍性的变化，主要 原因是营养核和生殖核融合造成的）
（3）染色操作：将花药放在载玻片上，加一滴质量分数1％的 醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显微镜下检查。
2、焙花青—铬钒法 （1）将无水酒精与冰醋酸按体积比为3：1的比例混匀 （2）将5g铬明矾[K2SO4Cr2(SO4)3·24H2O]加入90ml蒸馏水中 ，溶解后加入0.1g焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸5分钟后 冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至100ml。