一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910698144.1
(22)申请日 2019.07.31
(71)申请人 益善生物技术股份有限公司
地址 510663 广东省广州市科学城揽月路
80号广州创新基地C区五层
(72)发明人 许嘉森　吴诗扬　彭璨璨　刘志明　
刘芳　
(74)专利代理机构 广州广典知识产权代理事务
所(普通合伙) 44365
代理人 谢伟
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6858(2018.01)
C12Q 1/6806(2018.01)
(54)发明名称
一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试
剂盒
(57)摘要
本发明提供了一种Septin 9基因甲基化检
测试剂盒，其包括以下三组针对Septin 9-v2外
显子甲基化检测的特异性引物和探针中的至少
一组，SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8-
SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.13。

本
发明还提供了一种Septin 9基因甲基化检测方
法以及样品前处理方法，其包括以下步骤：TET酶
氧化；吡啶硼烷反应；多重荧光PCR反应。

本发明
所述试剂盒和检测方法，具有检测灵敏度高、特
异性好，
检测通量高的优点。

权利要求书1页 说明书24页序列表3页 附图2页CN 110305940 A 2019.10.08
C N 110305940
A
1.一种Septin 9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括以下三组针对Septin 9-v2外显子甲基化检测的特异性引物和探针中的至少一组，所述引物和探针为：以SEQ ID 2为靶点的SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.7、以SEQ ID NO.3为靶点的SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10、以SEQ ID NO.4为靶点的SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.13。

2.根据权利要求1所述的Septin 9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括TET酶和TET氧化缓冲液。

3.根据权利要求1所述的Septin 9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括内标基因引物及探针，其碱基序列组成为SEQ ID NO.14—SEQ ID NO.16。

4.根据权利要求1所述的Septin 9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品由牛血清蛋白和Septin 9基因非甲基化的人基因组DNA组成；所述阳性质控品由牛血清蛋白、Septin 9基因非甲基化的人基因组DNA和Septin 9基因甲基化的人基因组DNA组成。

5.根据权利要求1-4任一项所述的Septin 9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括吡啶硼烷。

6.根据权利要求2-4任一项所述的Septin 9基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述TET氧化缓冲液包括以下成分：167±10mM HEPES缓冲液pH＝8.0，333±10mM NaCl，3.3±0.2mM α-酮戊二酸二钠盐二水合物，6.67±0.05mM L -抗坏血酸，4±0.5mMATP，8.33±0.03mM二硫苏糖醇。

7.一种Septin 9基因甲基化检测的样品前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)TET酶氧化：使用TET酶对待测的DNA样本进行氧化，然后经蛋白酶K处理后进行纯化，获得纯化后的DNA样本；
(2)吡啶硼烷反应：步骤(1)获得的DNA样本进行吡啶硼烷反应，再进行纯化处理即获得转化后的DNA样本。

8.根据权利要求7所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)所述的TET酶氧化的反应条件为37±2℃孵育80±5min；和/或TET酶氧化反应体系如下：
待测DNA样本，
TET氧化缓冲液，15±1μl，
1.5mM Fe 2+，3.33±0.03μl，
TET酶，4±0.3μM，加水至总体积为50μl。

9.根据权利要求7所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(1)中所述的蛋白酶K处理为：待待测DNA样本与TET酶的氧化反应完成后直接向氧化反应体系中加入1±0.1μl浓度为0.8U的蛋白酶K并置于50±2℃孵育1±0.1h。

10.根据权利要求7-9任一项所述的样品前处理方法，其特征在于，步骤(2)中吡啶硼烷反应条件为于37±2℃,孵育16±2h；
和/或反应体系包括：氧化后DNA样本，10±1μl的3M乙酸钠溶液，5±0.5μl的10M吡啶硼烷，总体积50μl。

权　利　要　求　书1/1页CN 110305940 A
一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种人类基因甲基化检测的方法及试剂盒。

背景技术
[0002]Septin9基因是Hartwell等发现的Septin基因家族成员之一，具有鸟苷三磷酸酶(GTPase)活性。

Septin9基因位于人类染色体17q25.3，含有17个外显子，长约2.40×105bp，编码Septin 9蛋白。

但由于其转录产物包含多个翻译起点和变异剪接，Septin9可变异产生18种变异剪接体、编码15种多肽。

Septin9各亚型之间具有75％的核苷酸序列相似性和89％～96％的氨基酸一致性。

此外，这些变异剪接体的分布有组织特异性，如Septin9基因的变异剪接体Septin 9-v1分布于除脑部和胸腺外的组织，变异剪接体Septin9-v2、Septin9-v3、Septin9-v4多在胎儿组织中表达，变异剪接体Septin 9-v5在胎儿组织中表达很高。

Septin9基因及其表达产物广泛参与人体各种生理过程，如细胞极化、细胞增殖与凋亡、细胞内外物质运输、细胞骨架调节等。

[0003]研究表明，Septin9基因在结直肠癌发生中起抑癌基因作用，其甲基化会抑制其基因正常表达，使其抑癌功能丧失，并最终导致细胞分裂和癌变。

DNA甲基化的检测手段繁多，根据样本预处理不同可分为3大类，分别为酶消化法、亲和富集法、重亚硫酸盐转化法。

目前针对于结直肠癌样本的Septin9甲基化检测主要为重亚硫酸盐转化法。

该方法采用亚硫酸氢盐处理样本DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而发生甲基化的胞嘧啶(如5mC和/或5hmC)保持不变；经过PCR扩增后，U转变为胸腺嘧啶(T)，甲基化的C转变为C，从而实现在单碱基水平推断每个胞嘧啶的修饰。

文献报道的基于重亚硫酸盐转化的Septin 9甲基化检测方法包括甲基化敏感高分辨率熔解曲线(MS-HRM)、甲基化特异性PCR联合变性高效液相色谱(MSP-DHPLC)、甲基化荧光法(Methllight法)等。

[0004]MS-HRM即在用重亚硫酸盐处理待测DNA片段后进行PCR扩增，甲基化和未甲基化DNA存在序列差异，从而导致熔解温度及峰型的变化，因此，可通过熔解温度及峰型的变化区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。

该方法不需要荧光探针，其直接分析引物侧翼序列的所有甲基化位点，但准确性有待提高。

目前该方法在临床应用中仍缺乏大量的前瞻性研究数据的支持。

[0005]MSP-DHPLC是一种甲基化特异性PCR的衍生方法，即在用重亚硫酸盐处理待测DNA 片段后进行甲基化特异性PCR，扩增产物用DHPLC进行分析，该方法测试程序较易，敏感度和特异度较高。

但目前该方法还处于研究阶段，需要大量的前瞻性研究数据的支持。

[0006]Methllight法即在用重亚硫酸盐处理待测DNA片段后，利用特异性实时定量PCR反应进行扩增以识别完全甲基化的序列，具有敏感度高、特异性强、模板DNA用量少等特点。

改良Methllight法则是在原有基础上改用水解探针并增加封闭寡核苷酸以提高分析敏感度。

Methllight法是目前较为成熟的Septin 9甲基化检测方法，据此方法开发的Septin 9甲基
化检测产品有Epigenomics AG公司的Epi test试剂盒、Abbott Molecular的
Real Time mS9试剂盒等。

其中，Epigenomics AG公司的Epi test试剂盒是首款获得FDA、CE、CFDA三方认证的用于体外定性检测人外周血血浆中Septin 9基因甲基化的产品。

但是，该试剂盒仅针对Septin 9基因一个区域进行甲基化状态检测，且其适用的检测机型普及率较低，导致其在临床上的推广和应用受到限制。

[0007]此外，值得注意的是，重亚硫酸盐转化法虽然被认为是DNA甲基化分析的“黄金标准”，但其存在两个主要缺点：1)重亚硫酸盐转化条件过于剧烈，DNA可能会降解从而降低PCR及后续分析技术的灵敏度；2)重亚硫酸盐转化将未修饰的胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶(未修饰的胞嘧啶占人类基因组中总胞嘧啶的约95％)，将所有胞嘧啶转化为胸腺嘧啶严重降低了序列复杂性，导致检测质量差，定位率低，基因组覆盖不均匀和检测成本增加等一系列问题。

因此，重亚硫酸盐转化法的固有缺陷、甲基化检测的Septin 9基因片段单一问题以及适用机型问题是当前Septin 9基因甲基化检测中必须解决的问题。

发明内容
[0008]本发明的目的之一是提供一种Septin 9基因甲基化检测试剂盒，该试剂盒具有较高的检测通量、较高的检测特异性和敏感性。

[0009]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0010]一种Septin 9基因甲基化检测试剂盒，包括以下三组针对Septin 9-v2外显子甲基化检测的特异性引物及探针中的至少一组，所述引物和探针为：以SEQ ID 2为靶点的SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.7、以SEQ ID NO.3为靶点的SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10、以SEQ ID NO.4为靶点的SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.13。

[0011]在其中一些实施例中，还包括TET酶和TET氧化缓冲液。

[0012]在其中一些实施例中，还包括内标基因引物及探针，其碱基序列组成为SEQ ID NO.14—SEQ ID NO.16。

[0013]在其中一些实施例中，还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品由牛血清蛋白和Septin 9基因非甲基化的人基因组DNA组成；所述阳性质控品由牛血清蛋白、Septin 9基因非甲基化的人基因组DNA和Septin 9基因甲基化的人基因组DNA组成。

[0014]在其中一些实施例中，还包括吡啶硼烷。

[0015]在其中一些实施例中，所述TET氧化缓冲液配方如下：167±10mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液pH＝8.0，333±10mM NaCl，3.3±0.2mMα-酮戊二酸二钠盐二水合物，6.67±0.05mM L-抗坏血酸，4±0.5mMATP，8.33±0.03mM二硫苏糖醇。

[0016]在其中一些实施例中，所述荧光PCR预反应液包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、引物及探针、无核酸酶的水。

[0017]在其中一些实施例中，所述特异性探针和内标基因探针的5’端修饰有荧光报告基团FAM、HEX、ROX或CY5，3’端连接有MGB修饰基团。

[0018]本发明提供一种Septin 9基因甲基化检测试剂盒，该试剂盒设计了三组引物和探针，其来源于SEQ ID NO.1Septin 9-v2外显子1(包括启动子区和转录起始位点)范围内的三个区域为靶点而设计得到，具有较高的特异性。

以此设计的引物和探针，再配合利用TET 酶将5mC和5hmC完全氧化为5-羧基胞嘧啶(5caC)，随后吡啶硼烷将5caC完全还原为二氢尿嘧啶(DHU)；两者相互相成，从而实现Septin 9基因甲基化的高灵敏度和高特异性的检测。

[0019]本发明的另一个方面，是提供了一种Septin 9基因甲基化检测的前处理方法，该前处理方法，适合上述Septin 9基因甲基化检测的检测试剂盒的使用，能有效降低待测DNA 片段的降解率，保证待测DNA片段的质量；同时，可将待测DNA样本中修饰的胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶，这就保证了序列的复杂性，结合根据此方法设计的上述引物和探针，从而提高整个检测的特异性。

[0020]实现上述目的的技术方案如下。

[0021]一种Septin 9基因甲基化检测的样品前处理方法，包括以下步骤：
[0022](1)TET酶氧化：使用TET酶对待测的DNA样本进行氧化；然后经蛋白酶K处理后进行纯化，获得纯化后的DNA样本；
[0023](2)吡啶硼烷反应：步骤(1)获得的DNA样本进行吡啶硼烷反应，再进行纯化处理即获得转化后的DNA样本。

[0024]在其中一些实施例中，上述方法中，步骤(1)所述的TET酶氧化的反应条件为37±2℃孵育80±5min；及/或氧化反应体系如下：
[0025]待测DNA样本，
[0026]TET氧化缓冲液，15μl，
[0027] 1.5mM Fe2+，3.33μl，
[0028]TET酶，4μM，加水至总体积为50μl。

[0029]在其中一些实施例中，步骤(1)中所述的蛋白酶K处理具体如下：待待测DNA样本与TET酶的氧化反应完成后直接向氧化反应体系中加入1±0.1μl浓度为0.8U的蛋白酶K并置于50±2℃孵育1±0.1h。

[0030]在其中一些实施例中，反应体系包括：氧化后DNA样本，10±1μl的3M乙酸钠溶液，5±0.5μl的10M吡啶硼烷，总体积50μl。

[0031]在其中一些实施例中，步骤(2)中吡啶硼烷反应条件为于37±2℃，孵育16±2h。

[0032]以上各种优化得到的技术方案，可以最终很好地将待测DNA中甲基化的胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶，而未甲基化的胞嘧啶保持不变，从而得到高质量的转化后DNA样本。

[0033]本发明的另一个方面是提供一种Septin 9基因甲基化检测方法。

[0034]一种Septin 9基因甲基化检测方法，包括以下步骤
[0035]按照上述方法，对待检测样品进行前处理，得到转化后的DNA样本；
[0036]根据上述Septin 9基因甲基化检测试剂盒的引物和探针，对所述转化后DNA样本进行多重荧光PCR反应。

[0037]在其中一个实施例中，所述多重荧光PCR反应条件如下：
[0038]阶段1：94℃，20min；1个循环；
[0039]阶段2：62℃，5s；55.5℃，35s；93℃，30s；以上45个循环；
[0040]阶段3：40℃，5s；1个循环。

[0041]以上前处理方法中，通过步骤(1)所述的TET酶氧化，待测DNA样本中的5mC和5hmC 完全氧化为5caC；再通过步骤(2)所述的吡啶硼烷反应，步骤(1)中获得的DNA样本中5caC完全还原为DHU，从而获得转化后DNA样本。

与重亚硫酸盐转化法相比，步骤(1)所述的TET酶氧化和步骤(2)所述的吡啶硼烷反应的反应条件较为温和，可有效降低待测DNA片段的降解率，保证待测DNA片段的质量；同时，与重亚硫酸盐转化法将待测DNA样本中未修饰的胞嘧啶
完全转化为胸腺嘧啶导致序列的复杂性严重降低不同的是，本方法是将待测DNA样本中修饰的胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶，这就保证了序列的复杂性，从而提高后续检测的特异性。

另外，本方法中采用的四重荧光PCR反应可实现对Septin 9基因三个区域的甲基化状态的
检测，相较于Epigenomics AG公司的Epi test试剂盒仅检测Septin 9基因一个片段的甲基化状态，本发明所提供的Septin 9基因特定区域甲基化检测方法具有更高的检测通量、更高的检测特异性和更低的假阳性比例。

此外本发明所述的检测试剂盒各反应试剂组份还适用于国内更加普及的荧光定量PCR仪，从而有利于临床推广及普及。

[0042]本发明所述的Septin 9基因甲基化检测方法和试剂盒具有以下优点：
[0043](1)检测灵敏度高、特异性好：本发明采用TET辅助吡啶硼烷转化待测DNA能有效保证转化后DNA的质量和序列的复杂性，从而提高后续检测的灵敏度和特异性；本发明针对Septin9-v2外显子1分别设计三组甲基化特异性引物和探针，特异性引物能确保目的序列准确有效的扩增，从而提高检测的灵敏度，特异性引物和特异性探针均特异性识别甲基化DNA区域，从而提高了检测特异性，降低了假阳性率。

[0044](2)检测通量高：本发明实现一次性完成对Septin 9基因三个区域的甲基化状态的检测，从而提高了检测通量。

[0045](3)检测结果准确可靠：本发明设计有阴性质控品和阳性质控品，能更好地防止假阳性结果和假阴性结果的产生，从而确保检测结果准确可靠。

[0046](4)适用于国内普及率较高的荧光定量PCR仪，有利于在临床应用上推广。

[0047](5)适用的DNA样本类型多样：可用于血浆DNA样本、组织DNA样本、粪便DNA样本等。

附图说明
[0048]图1为本发明实施例2中检测25pg/ml转化后甲基化人类基因组DNA的扩增曲线图的示意图；
[0049]图2为本发明阴性质控品的扩增曲线图；
[0050]图3为本发明阳性质控品的扩增曲线图。

具体实施方式
[0051]除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA 的传统技术，其属于本领域技术范围。

参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

[0052]除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0053]下面将结合实施例对本发明进行进一步说明。

需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。

本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

[0054]实施例1：一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒
[0055]一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒，涉及的检测方法即利用TET酶将待测DNA中5mC和5hmC氧化5caC，随后吡啶硼烷将5caC还原为二氢DHU，再使用针对Septin9基因甲基化设计的特异性引物和探针建立多重荧光PCR体系进行PCR扩增，在此过程中DHU 转化为T，根据多重荧光PCR反应的荧光信号判断Septin 9基因甲基化状态；所述试剂盒包括TET氧化缓冲液、TET酶、荧光PCR预反应液、聚合酶、阴性质控品、阳性质控品。

Septin 9基因甲基化检测试剂盒的制备包括以下步骤：
[0056](1)按照本发明的TET氧化缓冲液配方配制TET氧化缓冲液，分装保存备用。

所述TET氧化缓冲液配方如下：167mM HEPES pH＝8.0，333mMNaCl，3.3mMα-酮戊二酸二钠水合物，6.67mM L-抗坏血酸，4mMATP，8.33mM二硫苏糖醇。

配制好的TET氧化缓冲液分装并于－80℃保存；
[0057](2)TET酶的制备：TET酶购买自Epigentek(货号E12002-1)，以原装储存，根据检测需求取适量制备成浓度为4μM/μl的工作液，分装保存于－80℃备用。

[0058](3)Septin 9基因引物和探针的设计及制备：针对Septin 9基因v2转录本的外显子1(SEQ ID 1)的三个区域(SEQ ID 2至SEQ ID 4)分别设计若干对甲基化检测的特异性引物和荧光探针，将各引物和探针进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终优选出用于Septin 9基因甲基化检测的三组特异性引物和探针，具体如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.13。

优选的特异性引物和探针以100μM的母液储存，根据检测需求制备成20μM的工作液备用。

[0059]Septin 9-v2外显子1的序列如下：
[0060]
[0061]其中，Septin 9-v2外显子1序列的第一个靶点区域如下：
[0062]CAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCCGCCCGGG AGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTT(SEQ ID NO.2)
[0063]Septin 9-v2外显子1序列的第二个靶点区域如下：
[0064]GCTCCTCCGGCGGCTAGCTCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAG(SEQ ID NO.3)
[0065]Septin 9-v2外显子1序列的第三个靶点区域如下：
[0066]TCCGCGCGACCCGCTGCCCACCAGCCATCATGTCGGACCCCGCGGTCAACGCGCAGCTGGATGGGATC ATTT(SEQ ID NO.4)
[0067]所述试剂盒的引物和探针序列具体如下表所示：
[0069](4)内标基因引物和探针的设计及制备，针对ACTB基因设计引物和探针，具体如SEQ ID 14至SEQ ID 16。

将该内标基因引物和探针分别配制成100μM的母液储存，根据检测需求制备成20μM的工作液备用。

[0070](5)荧光PCR预反应液的配制：按照本发明的荧光PCR预反应液配制方案配制荧光PCR预反应液，保存。

[0071]荧光PCR预反应液的配制方案如下：
[0072]
[0073]
[0074](6)阴性质控品和阳性质控品的配制：以牛血清蛋白和Septin 9基因非甲基化的人基因组DNA配制成阴性质控品，以牛血清蛋白(4μL)、Septin 9基因非甲基化的人基因组DNA480μL(1ng/μL)和Septin 9基因甲基化的人基因组DNA20μL(1ng/μL)配制成阳性质控品，。

(阳性质控品的设定是弱阳性)。

[0075](7)试剂盒的分装与组装：试剂盒规格为24人份/盒，分装与组装方案如下：
[0076]
[0077]本实施例的检测过程包括以下步骤：
[0078](1)准备所述试剂盒以及相关的各种试剂及物料，包括无核酸酶的水、蛋白酶K、
P-30凝胶柱、1.8×Ampure XP磁珠、Zymo-IC柱(购自Zymo Research公司)、PB缓冲液(购自Qiagen公司)、ThermoMixer恒温混匀仪(Eppendorf)，荧光PCR仪为国内普及率较高的机型如ABI 7500，以及1.5mM Fe2+、3M乙酸钠溶液、10M吡啶硼烷等可从商业途径购买原材料按照检测需求的浓度自行配制。

其中，1.5mM Fe2+使用氯化亚铁进行配制，现配现用(因Fe2+溶液放置过久会被氧化)。

[0079](2)按照下表配制TET酶氧化反应体系：
[0080]
[0081]
[0082](3)待测DNA样本的TET酶氧化反应体系配制好后，置于37℃孵育80min，再加入1μl 蛋白酶K(0.8U)置于50℃孵育1h，然后使用P-30凝胶柱(购自伯乐生命医学产品
(上海)有限公司)和1.8×Ampure XP磁珠(购自美国贝克曼库尔特有限公司)按相应的产品说明书进行纯化处理，最终以35μl无核酸酶的水进行洗脱以获得氧化后DNA样本。

[0083](4)按照下表配制吡啶硼烷反应体系：
[0084]
试剂名称用量
氧化后DNA样本35μl
3M乙酸钠溶液(pH＝4.3)10μl
10M吡啶硼烷5μl
总体积50μl
[0085](5)吡啶硼烷反应体系配制好后，置于ThermoMixer恒温混匀仪(Eppendorf)37℃，850rpm下孵育16h，然后反应产物使用Zymo-IC柱和PB缓冲液按照相应的产品说明书进行纯化处理，最终获得转化后DNA样本。

[0086](6)按照下表配制荧光PCR反应体系：
[0087]
试剂名称用量
荧光PCR预反应液40μl
聚合酶5μl
转化后DNA样本5μl
总体积50μl
[0088](7)荧光PCR反应体系配制好后，放入荧光定量PCR仪，按下表设置PCR反应条件，荧光定量PCR仪荧光通道FAM、HEX、ROX和CY5通道，进行扩增反应。

[0089]
[0090]
[0091](8)检测结果判读：根据检测到的FAM、HEX、ROX和CY5荧光信号的Ct值来判断。

荧光信号收集是在荧光PCR反应第2阶段55.5℃时收集，每个循环收集一次荧光信号。

检测反应体系的FAM、HEX、ROX和CY5荧光强度，以CY5达到设定的阈值时表示DNA上样量在允许范围内，FAM、HEX、ROX信号结果可信；以FAM、HEX、ROX达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0大于等于45：阴性；Ct值小于45：阳性。

具体的Septin 9基因甲基化检测结果判断表如下：
[0092]
[0093]实施例2：灵敏度分析实验
[0094](1)待测样本选择
[0095]本实施例中选择甲基化人类基因组DNA作为待测样本。

为了模拟游离DNA片段长度，本实验中采用超声波处理上述作为待测样本的甲基化人类基因组DNA，使其片段化。

[0096](2)DNA样本的转化
[0097]用实施例1中得到的一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒按照实施例1中的检测步骤对片段化的甲基化人类基因组DNA进行TET辅助吡啶硼烷处理获得转化后DNA。

[0098](3)多重荧光PCR检测
[0099]按照实施例1所述方法获得的转化后DNA浓度调整至10ng/ml、1ng/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、10pg/ml、1pg/ml，分别作为DNA模板用实施例1中所述Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒按照实施例1中的检测步骤进行多重荧光PCR检测，每种浓度设立2个重复，上样量为5μl，设立1空白对照，根据检测结果分析本发明试剂盒的灵敏度。

[0100](4)检测结果与分析
[0101]检测结果表明，当转化后的甲基化人类基因组DNA上样浓度低至25pg/ml时，CY5、FAM、HEX和ROX四条通道均有扩增信号，且都呈S型扩增曲线，检测结果仍为Septin 9甲基化阳性(请参见图1和图3，)；也就是说，本发明可以检测到低至2.5pg/ml的DNA模板量，这低于
同类产品Epigenomics AG公司的Epi test试剂盒所报道的最低检测量4.7pg/ ml，证明了本发明的检测灵敏度高，可提高对甲基化DNA含量低的样本检测结果阳性检出率。

具体结果见下表：
[0103]实施例3：特异性分析实验
[0104](1)待测样本选择
[0105]本实施例中选择非甲基化人类基因组DNA、甲基化人类基因组DNA、8例来自健康者的DNA样本、8例经重亚硫酸盐测序法确定为Septin 9甲基化阳性的DNA样本作为待测样本。

其中，非甲基化人类基因组DNA、甲基化人类基因组DNA经超声波处理片段化。

[0106](2)DNA样本的转化
[0107]用实施例1所述Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒按照实施例1中的检测
步骤分别对上述待测样本进行TET辅助吡啶硼烷处理获得转化后DNA。

[0108](3)多重荧光PCR检测
[0109]上述获得的转化后DNA作为DNA模板用实施例1中得到的一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒按照实施例1中的检测步骤进行多重荧光PCR检测，上样量为2ng/μl上样5μl，设立1空白对照，根据检测结果分析本发明试剂盒的特异性。

[0110](4)检测结果与分析
[0111]检测结果显示，1份非甲基化人类基因组DNA和8例来自健康者的DNA样本检测结果皆为Septin 9甲基化阴性，1份甲基化人类基因组DNA和8例8例经重亚硫酸盐测序法确定为Septin 9甲基化阳性的DNA样本检测结果皆为Septin 9甲基化阳性，证明了本发明的检测特异性好，阴性符合率为100％，阳性符合率为100％。

具体结果见下表(N1-N9分别代表非甲基化人类基因组DNA和健康者的DNA样本，P1-P9分别代表甲基化人类基因组DNA和Septin 9甲基化阳性的DNA样本)：
[0112]
[0114]实施例4：同类产品比较实验
[0115](1)待测样本选择
[0116]本实施例中从广州益善医学检验所收集确诊后的血浆DNA样本共100例，作为待测样本。

其中，8例来自健康者，21例来自结直肠良性病变，其余71例来自结直肠癌患者。

[0117](2)DNA样本的转化
[0118]上述收集的100例血浆DNA样本分别取适量，用实施例1所述Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒按照实施例1中的检测步骤分别进行TET辅助吡啶硼烷处理获得转化后DNA。

[0119](3)多重荧光PCR检测
[0120]上述获得的转化后DNA作为DNA模板用实施例1中得到的一种Septin 9基因甲基化检测的方法及试剂盒按照实施例1中的检测步骤进行多重荧光PCR检测，设立1空白对照，检测结果与同类产品检测结果对比分析本发明试剂盒的准确性。

[0121](4)同类产品检测
[0122]上述收集的100例血浆D N A样本取适量分别使用重亚硫酸盐测序法和
EpigenomicsAG公司的Epi test试剂盒进行检测。

重亚硫酸盐测序法是利用重亚硫酸盐将DNA样本中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，经PCR扩增，则尿嘧啶转化为胸腺嘧啶；最后，对PCR产物进行测序，与未经处理的序
列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。

此方法被认为是甲基化检测的“金标准”。

Epi
test试剂盒则是获FDA批准的一种针对Septin 9基因甲基化的血液检测方法。