拟南芥种植及处理基本方法

培养基

MS培养基 (Sigma公司)

B5培养基 (pH 5.5)

Content mg/L Content mg/L Content mg/L

KNO3 2500

ZnSO47H2O 2.0

Nicoti nic

1

CaCl22H2O 150 H3BO3 3.0 Thiami ne HCl 10 MgSO47H2O 250 KI 0.75 Pyri ndox ine 1 NaH2PO4'H2O 150 Na2MoO42H2O 0.25 m-I no sitol 100 FeSC47H2O 27.8 CoCl26H2O 0.025 Glyci ne 200 MnSO4H2O 10 Na2EDTA 37.3 Ki netin 0.1 CuSO45H2O 0.025 IAA 0.1-1

改良的1/4 Hoagland 培养液(mM, pH6.0):

Content mM Content mM

KNO3 1.25

Zn SO40.002

Ca(NO3)2 1.50 H3BO3 0.050

MgSO40.75 KCl 0.050

KH2PO4 0.5 (NH4)6Mo7°24 0.075

FeSq

0.072 CuSO40.0015

Na2EDTA 0.072 Na2SiO30.1

2植物材料的常规种植

拟南芥种子均匀地播撒于1/3 B5液体培养基浸润的蛭石上，塑料膜遮盖至种子萌

o

发，揭开膜，让其自然生长，适当间苗，烤苗至蛭石表面干燥后加水。置于23 C，16/8 h的光照培养间中生长。

3拟南芥种子的表面灭菌处理

1）拟南芥种子在4 C下春化3-5天

2）在超净台上用70%酒精处理种子2-5分钟

3）弃去酒精，用无菌水洗1-2次。

4）将种子用15% Bleach （KAO公司）处理15分钟，间歇振荡。

5）用无菌水洗4-6次，每次充分振荡混匀。

6）将种子悬浮在灭菌的0.1% Agar中。

7）均匀地将种子播撒在B5培养基平皿中。

4植物材料的水培体系

拟南芥种子经表面灭菌处理后均匀播撒于1/2 MS固体培养基上，10-15粒/ 皿，生长2周后，小心地将其转入水培体系中。

水培体系是由培养皿及起支撑作用的锡箔纸组成。培养皿中盛适当的液体培养基（通常用上述改良的1/4 Hoagla nd培养液）；锡箔纸上留出相距适当的小洞后，盖于培养皿之上。将拟南芥幼苗的根小心地经由锡箔纸上的小洞浸入培养液中。塑料膜覆盖，2-3天后揭去。整个体系置于光照培养间中生长，每3-6天更换

一次培养液。

5拟南芥T-DNAS入突变体的筛选方法

到网站输入salk号设计引物LP、RP

T-DNA LB : LBb1: GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT

LBa1: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG

用于PCR扩增。采用双引物法，分别用LP + RP, BP+ RP扩增基因组DNA

方法:

1）将拟南芥突变体种子播种于MS培养基平皿中，生长2周后，将其转入蛭石中，待长至抽苔期准备DNA的提取。

2） DNA提取缓冲液的配制：

Genome\ /Flankira SaaiifincfiL

Pa

N

pZme Exl5Ext3pZcne

EPa

w

3）剪取一片叶于1.5 ml Eppendof管中，液氮充分研磨。

4）加40 I提取缓冲液，涡旋充分混匀。

5） 95C中水浴20分钟，间或混匀几次。

6） 12,000 rpm 离心15 分钟。

7）吸取上清于一新的Eppendof管，取10 I稀释50倍。然后取稀释后的DNA 用于PCR扩增。

PCR扩增体系为（25 l体系）：

PCR反应程序: