基础生物学实验(三)基础生物学实验(安徽大学生物研究生复试生命科学学院)

实验三
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
一、实验目的 1.学习醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理。 2.了解醋酸纤维素薄膜电泳的操作技术。 3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。
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二、实验原理 醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持 物的电泳方法。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形 成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、 氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋 酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗 透性，对分子移动无阻力，厚度为120um。
二、实验原理 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种 血清蛋白。血清中含有清蛋白、a一球蛋白、β 一球 蛋白、 γ 一球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由 于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状 不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点 低，在相同碱性 pH 缓冲体系中，带负电荷多的蛋白 质颗粒在电场中迁移速度快。例如，以醋酸纤维薄 膜为支持物，正常人血清在 pH8 ． 6 的缓冲体系中电 泳 1 h 左右，染色后可显示 5 条区带。清蛋白泳动最 快，其余依次为α 1-、α 2-、β -、γ -球蛋白。这些 区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行 光吸收扫描，自动绘出区带吸收峰及相对百分比， 临床医学常用它们间相对百分比的改变或异常区带 的出现作为临床鉴别诊断的依据。
三、实验操作
1．纸的处理 取18 cm长、18 cm宽的滤纸一张，离底边2 cm处用铅 笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点 (原点)划圈，使圈的直径小于0.5 cm。 2．点样 在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号（混合样可写 M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈 内，待晾干或用冷风吹干后再点1次。每个样品共点2次。 3．层析 将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点位于 一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图1)。 将培养皿中放入2／3量的展层剂，放入层析缸中，然后 将滤纸直立于层析缸的培养皿中，样品端向下垂直放置，切 勿使展层剂浸到样品点，开始层析。 当溶剂前沿到达离上端2 cm处，取出滤纸，用铅笔描出 溶剂前沿，晾干 。
将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操 作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的 总糖含量，按下述公式计算出山芋粉总糖百分含 量。 总糖=（水解后还原mg数×样品稀释倍数×100 ％）/样品重量
四、实验要求
1.实验过程中所有的试管要干净，加入各种试剂量要准 确。 2.试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取，用后盖 好瓶塞，防回原处。 3.分光光度计使用：溶液不要倒太多；毛边不要对着透 光处；用后用自来水冲洗干净，防回原处。 4.移液管使用：有色看外边缘，无色看中间凹处。 5.实验室中所有的仪器上面不能放置烧杯、试管、试剂 瓶等，以防试剂污染仪器。 6.每组同学离开实验室时，须经实验老师检查并同意后， 方可离开。 7.值日生打扫干净实验室后，方可离开。
Rf值的定义为： Rf =(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶 剂前沿的距离）
影响Rf值的因素有： ①物质本身的化学结构； ②展层所用溶剂系统； ③展层剂pH值； ④展层时的温度； ⑤展层所用滤纸； ⑥展层的方向(横向，上行或下行)。 用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相 比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物 质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。
表1—2测定样品中含糖量时各试剂的用量
项目 样品量（ml） 蒸馏水（ml） 空白 0 2.0 1 1.0 1.0 2 1.0 1.0 3 1.0 1.0
DNS试剂(m1)
加热 冷却 蒸馏水(ml)
光密度(O.D．520)
1.5
1.5
1.5
1.5
均在沸水浴中加热5min 立即用流动冷水冷却
21.5 21.5 21.5 21.5
作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳，它具有微量、快 速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点， 该技术已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂 蛋白、结合球蛋白、同功酶的分离和测定等方面。 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清 蛋白。血清中含有清蛋白、a一球蛋白、β 一球蛋白、 γ 一球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组 分、立体构象、分子量、等电点及形状不同(见表1)， 在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低，在相同 碱性pH缓冲体系中，带负电荷多的蛋白质颗粒在电场中 迁移速度快。

纸上层析的原理：常以水和有机溶剂作为展层剂； 水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶 剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤 纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机 溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相， 有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两 相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配 较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分 配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。 一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的 Rf 值。
图ll一1 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白；2，3，4，5分别为α 1-，α 2-，β -及γ -球蛋白；6为点样原点
此法由于操作简单快速、分辨率高及重复性好等优点， 目前已成为临床生化检验的常规操作之一。它不仅可用于 分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶 的分离测定。
（二）点样 用竹夹子取出薄膜，将无光泽面向上平放在 滤纸上。点样区距阴极端1.5 cm处，点样时，先 用玻璃棒取血清，均匀涂在点样器表面(该点样 器是由载玻片一端磨成具有斜面而成}，再将点 样器轻轻印在点样区内，如图所示，使血清完全 渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。 此步是实验的关键，是获得具有清晰区带的电泳 图谱的重要环节。
目录

实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六
糖类的定量测定 纸层析法分析氨基酸 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 酵母RNA的提取及含量测定 外界因素对酶活性的影响 碘滴定法测定抗坏血酸
实验一
糖类的定量测定
—3，5-二硝基水杨酸比色定糖法
一、实验目的
1．掌握3，5一二硝基水杨酸法定糖的原理及方法。 2．用3，5一二硝基水杨酸比色法测定山芋粉 中总糖。 3．熟悉分光光度计的原理及使用方法。
实验二 纸层析法分析氨基酸
一、实验目的
1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。
二、实验原理
纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰 性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、 糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。 所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好， 为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用 于科研和生产分析工作中。
图11—2 醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图 虚线处为点样位置
（三）电泳 先恒流，后恒压 用竹夹子将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的 滤纸桥上 ( 点样面朝下 ) 、另一端平贴在阳极端支架上 (如图所示)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下 垂。如一电泳槽中同时安放几张薄膜，则薄膜之间应相 隔几毫米。盖上电泳槽盖，使薄膜平衡10min。 用导线 将电泳槽的正、负极与电泳仪的正、负极分别连接，注 意不要接错，在室温下电泳，打开电源开关，用电泳仪 上细调节旋钮调到每厘米膜宽电流强度为0.3mA（8片薄 膜则为4.8mA）通电10～15 min，将电压调节到90～110 V ，电泳时间 50 ～ 60min 。电泳后调节旋钮电流为 O ，关 闭电泳仪切断电源。
表1-1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量
项目
含糖总量（mg）
空白
1 0.4 0.4
2 0.6 0.6
3 0.8 0.8
4 1.0 1.0
5
6
0 葡萄糖液（ml） 0
1.2 1.4 1.2 1.4
蒸馏水（ml）
DNS试剂(m1) 加热 冷却 蒸馏水(ml)
光密度(O.D．520)
2.0
1.5
1.6
1.5
三、实验操作 （一）仪器与薄膜的准备 1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 2.电泳槽的准备 在两个电极槽中，各倒人等体 积的电极缓冲液，在电泳槽的两个膜支架上各放 两层滤纸条，使滤纸一端的长边与支架前沿对齐， 另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后， 用玻璃棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡， 使滤纸的一端能紧贴在膜支架上。滤纸条是两个 电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸 桥。 3.电极槽的平衡
三、实验操作 （一）仪器与薄膜的准备 1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 用竹夹子 取一片薄膜，小心平放在盛有缓冲液的平皿中。 若漂浮于液面的薄膜在15～30s内迅速润湿，整 条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳； 若薄膜润湿缓慢，色泽深浅不一或有条纹及斑点， 则表示薄膜厚薄不均匀应弃去，以免影响电泳结 果。浸泡于缓冲液中约30 min，当完全浸透后， 用镊子轻轻取出，夹在两层滤纸内吸去多余液体， 用于电泳。
五、实验建议
(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否 则手指上的氨基酸会造成滤纸上众多斑点。 (2)在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 (3)展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。 (4) 点样斑点不能太大（其直径应小于0.5cm），防 止氨基酸斑点重复；吹风温度不宜过高，否则斑 点变黄。 (5)根据目的、要求，选择合适溶剂系统。
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳
一、实验目的
1.学习醋酸纤维素薄膜电泳的基本原理。 2.了解醋酸纤维素薄膜电泳的操作技术。 3.掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量的方法。
二、实验原理
醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维素薄膜为支持 物的电泳方法。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形 成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、 氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋 酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗 透性，对分子移动无阻力，厚度为120um。
2.电泳槽的准备 根据电泳槽膜支架的宽 度，剪裁尺寸合适的滤纸条。在两个电极槽中， 各倒人等体积的电极缓冲液，在电泳槽的两个 膜支架上各放两层滤纸条，使滤纸一端的长边 与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。 当滤纸条全部润湿后，用玻璃棒轻轻挤压在膜 支架上的滤纸以驱逐气泡，使滤纸的一端能紧 贴在膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸 纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。 3. 电极槽的平衡 用平衡装置 ( 或自制平 衡管 ) 连接两个电极槽，使两个电极槽内的缓 冲液彼此处于同一水平状态，一般需平衡15～ 20 min。注意，取出平衡装置时应将活塞关紧。
1.4
1.5
1.2
1.5
1.0
1.5
0.8 0.6
1.5 1.5
均在沸水浴中加热5min 立即用流动冷水冷却
21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5
将以上各管溶液混匀后，用分光光度计 (520nm)进行比色测定，用空白管溶液调零点， 记录光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度 为纵坐标，绘制出标准曲线。 一大组同学做一个标准曲线 （三）样品中含糖量的测定 取4支大试管，分别按表1—2加入各种试剂。
图1.滤纸的缝合
4．显色 用喷雾器向滤纸上均匀喷洒0.1%茚三酮，晾干后， 将滤纸放入烘箱中(80-100℃)，烘烤5分钟后，滤纸 上即显出紫红色的氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮 廓(见图2)
四.结果处理
用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前 沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。
图2.层析谱 1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿
二、实验原理
糖类的测定方法有物理方法和化学方法两类。 由于化学方法比较准确，常常使用之。还原糖的测定 是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基和酮 基的糖类。
3，5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕 红色的氨基化合物，在一定范围内，棕红色物质颜色 的深浅程度与还原糖的量成正比。因此，我们可以利 用比色法测定样品中还原糖以及总糖的含量。 该法是半微量定糖法，操作简便、快速，杂质干 扰较少。 三、实验操作 （一）样品中总糖的水解及提取 准确称取山芋粉 1g，放入小三角烧瓶中，加入10ml6N HCL和15ml蒸 馏水，混匀。在沸水浴加热30min后，用KI-I2溶液检 查水解程度。若已水解完全，则不呈现蓝色。冷却后 加入酚酞试剂一滴，以10%NaOH中和至溶液呈微红 色。过滤并定容至100ml。再精确吸取上述溶液10ml， 放入100ml容量瓶，稀释到刻度，备用。 （二）葡萄糖标准曲线的制作 取7支大试管分别按 表1-1顺序加入各种试剂。