PVDF转膜实验步骤及注意事项

蛋白质转膜实验注意事项（用于N端测序）
转膜实验操作要点
1、SDS－PAGE电泳：按常规条件进行（CAPS系统:用于>=20KD蛋白；Tris－Tricine系统：用于低分子量蛋白，也可用于高分子量蛋白）；
2、甲醇浓度：CAPS电印迹缓冲液中甲醇浓度范围是0-20％（甲醇浓度高，用于低分子量蛋白转印；甲醇浓度低甚至不含甲醇的用于高分子量蛋白的转印）；
3、PVDF膜处理：取出PVDF膜，用甲醇浸泡数秒钟，然后放入CAPS电印迹缓冲液中。

（注：此后的操作须防止PVDF膜干涸。

如果膜变干，须重复本步骤的操作）；
4、凝胶处理：取出电泳凝胶，在CAPS缓冲液中浸泡5-10分钟。

（注：转移某些强碱性蛋白pI>9.0时，可省略本步骤）；
5、安装转印槽子：将滤纸和海绵放入电印迹缓冲液中浸泡一下，然后按海绵、滤纸、PVDF 膜、凝胶、滤纸、海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中；
6、转印条件：在50V恒压条件下（100-170mA）于室温下进行电印迹转移，转移时间为0.5-2小时。

（注：务必排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。

例如对70kD以上的蛋白质须延长转移时间）；
7、PVDF膜染色前处理：取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，然后进行染色；
8、膜染色：考马斯亮蓝染色（将0.1％考马斯亮蓝R-250溶于40％甲醇/1％乙酸中）30-50秒（切勿超过1分钟），50％甲醇脱色（勤换脱色液），用去离子水充分洗涤，然后晾干即可；
转膜实验注意事项
1）电泳胶要求：尽可能使用厚胶，以保证膜上高载量；
2）预电泳处理：低电流跑空胶2～2.5小时，防止胶内杂质污染；
3）转印缓冲液：不能使用Tris-甘氨酸缓冲液，推荐使用CAPS缓冲液；
4）转印膜选择：不能用NC膜，务必使用PVDF膜；
5）染料选择：不能使用考马斯亮蓝G250，推荐使用丽春红，或者考马斯亮蓝R250；
6）转印效果：避免条带拖尾，用于测序的PVDF膜上条带应狭窄清晰；
7）脱色过程：乙醇可增加到40－60％，背景颜色很快脱掉后，纯净水漂洗，滤纸上晾干；8）膜保存：膜请夹在滤纸间装于自封袋中，冰箱内可以放置3～6个月；
9）10×CAPS（100mmol/L）缓冲液配制，方法如下：
CAPS，22.13g；加去离子水至900ml；用2mol/L NaOH （约20ml）将pH值调至11.0，然后定容至1L，贮存于4ºC。

CAPS电印迹缓冲液（含10％甲醇的1×CAPS）配制，方法如下：
10×CAPS 200ml；加入甲醇200ml；加入去离子水1600ml即可。