重组体的选择与鉴定1

间接选择法
依赖于重组子结构特征分析的筛选法
快速裂 限制性 菌落杂 解菌落 内切酶 PCR法 交筛选 鉴定分 酶切法 子大小
依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一 快速裂解菌落鉴定分子大小
基本原理：
由于外源片段插入的重组质粒与载体 大小不同，故可以利用琼脂糖凝胶电泳将 重组体分离出来。
依赖于重组子结构特征分析的筛选法之一 快速裂解菌落鉴定分子大小
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二析的筛选方法三 PCR法 基本原理：
在载体DNA分子中，外源DNA插入位 点两侧的序列多为已知，通过与插入位点 两侧已知序列互补的引物，从单克隆中提 取少量质粒 DNA 作为模板进行 PCR 扩增， 琼脂糖凝胶电泳分析确定是否为重组子。
抗药性基因失活
抗药性基因失活
注意事项：
（ 1 ）以 Amp 、 Tc 等抗生素作为选择药物时， 37℃培养时间约 12~16h ，超过时间视为杂 菌（假转化子菌落）。 （ 2 ）挑选单菌落作为转化子以便进一步实验 验证。挑的菌落在培养基中震荡培养。
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
用体外标记基因 DNA 或相应的 RNA 为探针同转 化后的菌落进行原位杂交，筛选含重组DNA的克隆。 这个方法可以快速地从数百个菌落中挑选出含有重组 DNA的克隆。 该方法的优点是通用性比较强，可以用来检测任 何一种插入的DNA序列。这种方法依据的是核酸分子 杂交的原理，而不以插入的DNA序列能否实现基因表 达为前提，因此，只要有可利用的标记探针就可检测 出重组质粒DNA。
基本原理：
许多质粒载体具有β -半乳糖苷酶显色反应的检测功能。 当外源 DNA 插入到它的 lacZ 基因（编码 β - 半乳糖苷酶） 上时，可造成β -半乳糖苷酶的失活，就可通过大肠杆菌转化 子菌落在添加 X-gal-IPTG 培养基中的颜色变化鉴别出重组子 和非重组子。（X-gal是β -半乳糖苷酶的显色底物）
抗药性基因失活
例如：
非重组的 pBR322 质粒 DNA 上的四环素和氨 苄青霉素抗性基因都是正常的。带有这种质粒的 受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性 平板上生长。但是, 如果在该质粒的氨苄青霉素抗 性基因内插入外源片段 , 就会造成氨苄青霉素抗 性基因失活, 携带这种质粒的宿主菌可以在四环素 的平板上生长 , 而不能在氨苄青霉素抗性平板上 生长。
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
注意事项：
（1）由于被转化的基因产物作用于X-gal需 要较长 时间，因此，观察和确定转化子菌 落的培养时间可适当延长。与37℃温箱取 出后放4 ℃冰箱几小时后观察效果更好； （2）为了防止假阳性需挑菌进一步验证。
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法三 PCR法 注意事项：
• 如需检测插入片段及其方向，则使用 载体特异引物和方向插入特异引物或互换。 如只需确认是否存在插入片段，可用 2 个 插入片段特异引物。 • 扩增反应前在 94℃变性两分钟，有 利于细菌的裂解，提高PCR产物扩增的成 功。
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法四 菌落杂交筛选 主要原理
氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cm） 卡那霉素（Kan）、四环素（Tet或Tc） 链霉素（Sm或Str）
抗药性基因不失活
基本原理：
外源基因片段插入载体的位点在抗药性 基之外， 不导致抗药性基因的失活，仍能编 码抗药性基因产物。含有这种重组子的转化 细胞可以在含有相应抗生素的琼脂平板上生 长成菌落，未能接受载体DNA的细胞因不能 生长而被排除。
优点：直观快捷， 适用于插入片段较 大的重组子的筛选。 缺点：不能鉴别插 入片段大小相近的 非目的基因片段。
依赖于重组子结构特征分析的筛选方法二 ——限制性内切酶酶切法 基本原理：
根据已知的外源DNA序列的限制酶切图 谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比 较电泳结果（DNA的带数和长度）。或用合 适的内切酶酶切插入片段，再用其它酶酶切 这个片段，电泳后比较电泳结果是否符合预 计的结果。
总

结
重组子的筛选往往需要几种方法综合起来， 仅用一种方法可能不能很好的筛选出我们所需的 重组体。一般先用直接筛选法初步筛选，再用间 接法筛选进一步筛选。
例如： 实验中常先利用抗药性进行初步筛选，再进 行电泳检测，最后甚至会去测序，确定重组子已 插入。
常用的选择方法
直接选择法
抗药性筛选 限制性内切酶酶切法 β -半乳糖苷酶 显色法 PCR法 菌落杂交筛选
间接选择法
快速裂解菌落鉴定分子大小
直接选择法
抗药性筛选
依赖于遗传表型 的选择法 β -半乳糖苷酶显色法
遗传学表型筛选方法一—抗药性筛选
分类：
（1）抗药性基因不失活 （2）抗药性基因失活
常用的抗药性选择标记：
抗药性基因不失活
实验步骤：
（1）培养基中加入千分之一的抗性药物，再倒平板； （2）将转化后的菌液均匀涂布在平板上； （3）放在37℃培养箱培养12~16小时； （4）观察菌落生长情况。
抗药性基因不失活
抗药性基因失活
基本原理：
如果外源基因片段插入载体的位点在 抗药性基因中 间，导致抗药性基因失活， 这个抗药性标志就会失活。检测外源DNA 插入作用的一种通用的方法是插入失活效 应。
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
举例：
pUC质粒：带有β -半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序 列和β -半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个
编码区中插入了一个多种限制性核酸酶单一识别位点
的多克隆位点，但并没有破坏lacZ的阅读框架。 大肠杆菌菌株：带有β -半乳糖苷酶C端部分序列的 编码信息。 在各自独立的情况下，pUC质粒和大肠杆菌编码的β -
半乳糖苷酶片段都没有活性。
遗传学表型筛选方法二 β -半乳糖苷酶显色法
当质粒转化大肠杆菌后,可形成具有酶活性的 蛋白质,它在生色底物X-gal的存在下被IPTG(异丙 基-β -D-硫代半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外 源片段插入到pUC质粒的多克隆位点上后，则会导 致读码框架改变，表达蛋白失活，因此，在同样条 件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能 形成白色菌落。因此，根据这种β -半乳糖苷酶的 显色反应，可将重组质粒与自身环化的载体DNA分 开。
• 载体和一个或数个串联目的基因连接 • 载体发生自连 • 目的DNA分子发生自连
• 未发生连接反应的载体和目的DNA片段
为什么要对重组子进行选择与鉴定
因此 , 在成千上万个转化子中，真正含 有期望的重组 DNA 分子的比例很少，为了将 含有外源DNA的宿主细胞和不含外源DNA的宿 主细胞分开，以及将含有正确重组子的宿主 细胞和含有其他外源 DNA 的宿主细胞分开， 就需要设计出最易于筛选重组子的方案并加 以验证。
重组体分子的选择与鉴定方法及原理
何为重组体？
转化子：在 DNA 分子克隆中，通常将导入外
源 DNA 分子后能稳定存在的受体细胞称为
转化子；
重组体：含有重组DNA分子的转化子； 目的重组体：含有外源目的基因的重组体。
为什么要对重组子进行选择与鉴定
在转化反应中 , 并非所有的细胞中都转入 重组DNA分子,即使所有的受体细胞都变为转化 体 , 所获得的转化子仍是多种类型的 DNA 分子 , 因为在连接反应中会有以下几种情况发生: