突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建

将PCR产物克隆至T载体上进行筛选、扩增及鉴定,并送测序公司测序。
1．2．3突变型人胰岛素原基因的获得
采用重叠延伸PCR法,使人胰岛素原基因产生两处突变。以获得的野生型人胰岛素原基因为模板,首先进行B链/C肽连接处的突变。用引物INS1、INS4和引物INS3、INS2分别扩增出两段PCR产物,利用引物INS3和INS4的互补部分使这两段PCR产物互为模板和引物,在DNA聚合酶的作用下延伸出整条人胰岛素原基因,然后再加入引物INS1和INS2继续扩增含有第一个突变的人胰岛素原基因（命名为INSM1）,将扩增产物连接到T载体中,并送测序公司测序鉴定。第二处突变在C肽与A链的连接处。以经测序第一处突变改造成功的人胰岛素原基因为模板,用引物INS1、INS6和引物INS5、INS2经过以上同样的方法诱导产生含有第二个突变的人胰岛素原基因（命名为INS
赛百盛;引物由上海生物工程有限公司合成; pAdEasy1载体系统、DH5α菌株、BJ5183菌均由血研所中法实验室保存。
1．2方法
1．2．1引物设计
根据GenBank发表的人胰岛素原基因cDNA序列,综合利用Primer5和Oligo6引物设计软件设计人胰岛素原基因全长的引物, INS1: 5′GCT CTC GAG GCC ACC ATG GCC CTG TGG AT3′; INS2: 5′GAG AAG CTT GCT GCG TCT AGT TGC AGT AGT3′,划线部分为酶切位点（Xho I和Hind III）。再根据PCR定点突变原理,分别在人胰岛素原基因BC链及CA链连接处进行2次突变,突变引物设计如下: INS3: 5′TTC TTC TAC ACA CCC CGG ACC CGC3′; INS4: 5′GCG GGT CCG GGG TGT GTA GAA GAA3′; INS5: 5′GTC CCG
Ⅰ酶切鉴定。
1．2．5重组腺病毒载体的构建
先把BJ5183细菌用氯化钙法制备成感受态,将腺病毒骨架质粒pAdEasy1转化到BJ5183感受态细胞中,铺板
、挑菌、摇菌后再用同样的方法制备成感受态细胞。然后pAdtrackINSM2被限制性内切酶PmeⅠ线性化,再经碱性磷酸酶CIAP处理后,转化入含有腺病毒骨架质粒pAdEasy1的BJ5183感受态细胞中去同源重组。经过铺板、挑菌、摇菌、提取质粒等步骤获得重组质粒pAdINSM2。经HindⅢ、XhoⅠ和PacⅠ酶切鉴定。
突变型人胰岛素原基因的克隆及其腺病毒载体的构建
（作者:___________单位:___________邮编:___________）
【摘要】目的:构建含有定点突变的人胰岛素原基因的腺病毒表达载体。方法:首先利用RTPCR方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原cDNA;然后通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA上产生2个突变位点,使突变的cDNA编码的蛋白质含弗林蛋白酶的识别位点,该突变型胰岛素原cDNA片段命名为INSM2;最后将INSM2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点上,并与骨架载体共转染至细菌内,通过细菌内同源重组得到重组载体。结果: HindⅢ和Xho I酶切、Pac I酶切及测序均证实载体pAdINSM2构建成功。结论:构建的含定点突变人胰岛素原基因腺病毒载体pAdINSM2为进一步转染非胰岛β细胞,对糖尿病进行基因治疗奠定了基础。
M2）,将扩增产物连接到T载体中送测序公司测序鉴定。
1．2．4穿梭腺病毒载体的构建
将腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV和突变型人胰岛素原基因（INSM2）分别用HindⅢ和XhoⅠ双酶切,纯SM2双酶切产物5μL、pAdtrackCMV双酶切产物3μL、Buffer 1μL、T4 DNA连接酶1μL, 16℃16 h,连接产物命名为pAdtrackINSM2,转化DH5α感受态细胞,铺板、挑菌、摇菌、提取质粒, HindⅢ、Xho
GCA GAA GCG TGG CAT TGT3′; INS6: 5′ACA ATG CCA CGC TTC TGC CGG GAC3′;斜粗体划线部分为突变的位点。
1．2．2野生型人胰岛素原基因的获得
取胎龄5个月的经水囊引产的健康胎儿胰腺组织,液氮中冷冻过后用DEPC处理过的研钵研磨,然后加入TRIzol抽提总RNA,以提取的总RNA经逆转录后合成的cDNA为模板,以引物INS1和INS2进行PCR反应。反应条件: 94℃,预变性5 min;变性、退火及延伸条件分别是94℃30 s, 60℃30 s, 72℃30 s,共进行30次循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1材料和方法
1．1材料
PCR产物胶回收试剂盒、限制性内切酶HindⅢ、Xho I、Probest DNA聚合酶、Simple T Vector、DNA marker均购于大连宝生物公司; T4 DNA连接酶、MMLV逆转录酶购于Invitrogen公司;限制性内切酶Pme I、Pac I购于NEB公司;质粒DNA抽提试剂盒购于
【关键词】胰岛素原腺病毒载体/pAdEasy1弗林蛋白酶
糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大致死疾病,胰岛素是治疗糖尿病的主要药物,但由于随时需要注射胰岛素,给患者带来了极大的不便,对糖尿病的基因治疗成为了可能。随着分子生物学领域取得的迅猛发展,特别是重组DNA技术的建立［1］,我们通过重叠延伸PCR技术对胰岛素原基因进行2个位点的突变,将人胰岛素原基因cDNA上BC链连接处的碱基序列Lys Thr Arg Arg及CA链连接处的Leu Gln Lys Arg分别突变为Arg Thr Lys Arg及Arg Gln Lys Arg序列,以使其可以被弗林蛋白酶识别［2］。然后将突变型的人胰岛素原基因构建到腺病毒载体中,使其有望成为糖尿病基因治疗理想的候选载体之一,并为进一步进行人胰岛素原基因转染非胰岛β细胞,使之产生胰岛素治疗糖尿病奠定基础。