碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定
碱性磷酸酶米氏常数的测定实验报告
碱性磷酸酶米氏常数的测定实验报告实验目的：1、学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理。
2、测定牡蛎碱性磷酸酶水解对硝基苯磷酸钠盐时的Km和Vm值u。
实验原理：1、米氏方程：V=Vm[S]/Km+[S]其中[S]为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数.Vm/2=Vm[S]/Km+[S]Km=[S]Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是浓度单位。
米氏常数K是酶的一个基本特征常数。
2、动力学参数的测定:测定Km和Vm，可通过作图法求得。
最常用的Lineweaver-Burk双倒数作图法米氏方程转化为倒数形式，即：1/v=Km/Vm*1/[S]+1/Vm3、本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm反应式：产物对硝基苯酚pNP在405nm波长有吸收可通过分光光度法测定产物pNP的含量测定并制作产物pNP的标准曲线根据催化反应产生的产物OD值从标准曲线求出产物浓度，换算成反应速度v。
实验试剂与器材：试剂：0.5μmol/mL pNP 溶液、10 mmol/L pNPP溶液、20 mmol/L MgCl2,溶液、0.1 mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠 pH 10.1缓冲液、0.1 mol/L NaOH、碱性磷酸酶。
器材：恒温水浴锅、722分光光度计实验操作流程：1.对硝基苯酚标准曲线的制作取15支试管编号，0号一支，1-7号各二支，按下表操作：以对硝基苯酚的绝对量(μmol数）为横坐标，OD405nnm值为纵坐标，绘制标准曲线。
求出PNP的摩尔消光系数(s）值。
2.反应速度测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照分别以01-05调零点，测定对应样品管ODq0s。
3.数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。
从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm。
相当于产物对硝基苯酚的μmol数。
碱性磷酸酶km值测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
实验五碱磷酶的纯化和比活性的测定
管号
不同酶液
O -
S -
1(AE) 2(BE) 3(CE) 4(DE) 0.1 0.1 0.1 0.1
0.1mg/ml标准酚液
0.1 3
0.1
3
3
3
3
3
0.01mol/LpH8.8Tris
预温37℃复合基质液
考马斯亮蓝法测定蛋白含量
游离状态的考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中 呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，蛋白质 含量与颜色深浅成正比 595nm测定吸光度，做标准曲线，求出蛋白 质浓度
实验结果
分离阶段 蛋白质 (mg/ml) 酶活性 （U/ml） 比活性 (U/mg) 纯化倍数 得率
Summary of porcine platelet-derived growth factor purification protocol
Step Total protein (mg/ml) 39 800 237.32 45.83 6.25 4.35 0.17 Total activity (z/U) 1.8×106 9.2×105 6.1×105 8.4×104 6.9×104 5.8×104 Specific Fold activity Recovery purificat (%) ［(z/B)/U*mgion 1］ 45 3 876 13 310 13 440 15 862 341 176 1 86 296 299 352 7 582 100 51 34 5 4 3
取D液0.1mL置于编号为DE的试管中,供测酶活性 取D液0.1mL置于编号为Dp的试管中，供测蛋白 质含量
磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性
根据产物红色的深浅测定酚的含量
酶活性单位：37℃下15 min生成1mg酚为1个酶活性单位 每mL样品中 = 酶活性单位
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。
AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。
AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。
血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。
AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。
一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。
有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。
正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。
2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。
酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。
本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。
酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。
于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。
碱性磷酸酶分离纯化及比活性测定1
试剂（ml）
生理盐水 标准蛋白溶液 样品 考马斯亮蓝试剂
空白管
0.1标Biblioteka 管ABC0.1 A2液0.1 5.0 5.0 5.0 B2液0.1 5.0 C2液0.1 5.0
室温5min，各管进行A595测定 计算：样品中蛋白质的含量=A样品/A标准×C标准×稀释倍数
目录
3. 结果处理与分析
结果处理表
酶活性计算 体积 (ml) A 值
目录
检测酶提取纯化的指标
1. 酶的纯度： 用比活性代表（单位重量蛋白质样品中 的活性单位） 2. 酶的回收效率 所含酶
※在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的回收率
目录
实验内容
酶的提取及比活性测定
目录
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP) 的分离纯化及比活性测定
[目的] 1．掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注 意事项 2．了解检测AKP活性测定的原理和方法。
25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液）
A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测活性
A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度
+2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （3000rpm)5min 下清液（吸取） 沉淀（弃）
蛋白含量计算 酶的总 活性 （ U） A 值
稀 释 倍 数
酶活性 (U/ml)
稀 释 倍 数
比活 酶的 性 蛋白浓度 得率 (U/mg) (mg/ml)
A 液 B液
4 2.2
100%
C液
2
目录
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。
分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。
本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。
材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。
方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。
结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。
同时，样品纯度也有了显著的提高。
分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。
实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。
透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。
在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。
但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。
结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。
同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质
在生物工程中的应用
生产生物催化剂
碱性磷酸酶可以作为生物催化剂，在生物工程中用于 合成磷酸酯、脱氧核糖核酸等物质。
蛋白质剪切
碱性磷酸酶可以催化蛋白质剪切，对蛋白质的结构和 功能进行修饰。
生产药物
碱性磷酸酶可以用于制备药物，如抗癌药物、抗生素 等。
在医学诊断中的应用
肝功能检查
碱性磷酸酶是肝功能检查的重要指标之一，可 以反映肝细胞的损伤程度。
碱性磷酸酶可以作为营养补充剂，用于补充 人体所需的矿物质和维生素。
05
CATALOGUE
碱性磷酸酶的研究展望
研究现状与挑战
研究现状
目前对碱性磷酸酶的研究已经涉及多个领域 ，包括生物学、医学、化学等。在生物体内 ，碱性磷酸酶的作用是参与磷酸基转移反应 ，具有重要的作用。然而，对于碱性磷酸酶 的精确调控机制，仍需进一步研究。
琼脂糖凝胶电泳
利用琼脂糖凝胶作为支持物，根据蛋 白质分子大小和形状的不同进行分离 。
03
CATALOGUE
碱性磷酸酶的酶学性质
酶的磷酸酶的米氏方程可以表示为V=Vmax\*[S]/（ Km+[S]），其中V是反应速率，Vmax是最大反应速率， [S]是底物浓度，Km是米氏常数。
挑战
尽管已经对碱性磷酸酶进行了广泛的研究， 但仍存在许多挑战。例如，如何提高碱性磷 酸酶的分离纯化效率，以及如何精确调控碱 性磷酸酶的酶学性质等。此外，对于碱性磷 酸酶在生物体内的具体作用机制，也需要进
一步深入研究。
未来研究方向
研究方向1
进一步探究碱性磷酸酶的调控机制。 通过对碱性磷酸酶的基因表达、后转 录修饰以及与其他分子的相互作用等 方面的研究，可以更深入地了解其调 控机制，为相关疾病的治疗提供理论 依据。
碱性磷酸酶实验报告
实验日期：2023年10月25日实验地点：生化实验室实验目的：1. 了解碱性磷酸酶（AKP）的分离纯化原理和方法。
2. 掌握碱性磷酸酶活性测定的原理和方法。
3. 通过实验验证碱性磷酸酶的动力学特性，计算其米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验原理：碱性磷酸酶（AKP）是一种非特异性磷酸单酯酶，主要存在于动物和微生物体内，具有磷酸基团转移活性。
在碱性条件下，AKP能水解多种磷酸单酯化合物，生成相应的醇和磷酸盐。
本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP，并通过比色法测定其活性。
实验材料：1. 兔肝匀浆液2. 丙酮3. 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）4. 磷酸苯二钠5. 4-氨基安替比林6. 铁氰化钾7. 移液管、移液枪、试管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计实验步骤：1. 碱性磷酸酶提取：- 将兔肝匀浆液与丙酮以体积比1:1混合，室温下静置过夜。
- 4,000 rpm离心10分钟，弃去上清液。
- 将沉淀用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解，得到碱性磷酸酶粗提液。
2. 碱性磷酸酶活性测定：- 取6支试管，分别加入0.02 mol/L磷酸苯二钠溶液、0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）、4-氨基安替比林溶液和铁氰化钾溶液。
- 在上述溶液中加入不同浓度的碱性磷酸酶粗提液，混匀后置于恒温水浴箱中反应10分钟。
- 在510 nm波长下测定吸光度，以酶活力单位（U）表示。
3. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）计算：- 以酶活力单位（U）为纵坐标，底物浓度（mol/L）为横坐标，绘制酶活力曲线。
- 利用双倒数法（Lineweaver-Burk plot）计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
实验结果：1. 碱性磷酸酶活性曲线：- 随着底物浓度的增加，酶活力逐渐增加，但在一定浓度后趋于稳定。
2. 米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）：- 米氏常数（Km）为0.05 mol/L，最大反应速度（Vmax）为150 U/min。
碱性磷酸酶生化实验报告
一、实验目的1. 熟悉碱性磷酸酶（ALP）的生化特性；2. 掌握ALP的分离纯化方法；3. 学习ALP比活性测定和动力学分析；4. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理碱性磷酸酶（ALP）是一种广泛存在于生物体内的酶，具有磷酸基团转移活性，在碱性条件下能水解多种磷酸单酯化合物。
ALP在生物体内具有重要的生理功能，如参与骨骼生长发育、肝脏解毒、钙磷代谢等过程。
本实验旨在通过分离纯化ALP，测定其比活性和动力学参数，为进一步研究ALP的生物学功能提供实验基础。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：兔肝匀浆液、正丁醇、丙酮、乙醇、NaCl、MgCl2、MnCl2、磷酸苯二钠、4-氨基安替比林、铁氰化钾、pH缓冲液等。
2. 实验仪器：恒温水浴箱、离心机、分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验方法1. ALP的分离纯化（1）将兔肝匀浆液与等体积的正丁醇混合，充分振荡，静置，取上层滤液。
（2）向滤液中加入1/10体积的MgCl2、MnCl2溶液，混匀。
（3）加入等体积的丙酮或乙醇，静置，离心（3000r/min，10min），取沉淀。
（4）沉淀用少量pH7.0的磷酸缓冲液溶解，再次离心，取上清液。
2. ALP比活性测定采用磷酸苯二钠为底物，在pH10的碳酸缓冲液中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸盐。
苯酚与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌类衍生物，通过测定吸光度变化计算ALP的比活性。
3. ALP动力学分析采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，测定不同底物浓度下的酶活性，计算米氏常数（Km）和最大反应速度（Vmax）。
五、实验结果1. ALP的分离纯化通过有机溶剂沉淀法，从兔肝匀浆液中成功提取纯化ALP。
SDS-PAGE结果显示，纯化后的ALP蛋白呈单一条带。
2. ALP比活性测定通过测定不同底物浓度下的酶活性，计算出ALP的比活性为1.5U/mg。
3. ALP动力学分析采用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算出ALP的米氏常数（Km）为0.01mmol/L，最大反应速度（Vmax）为200U/min。
实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定
VX = 5/6（0.83） VB/ /
注意事项
1. 低温条件进行 2. 有机溶剂边加边搅拌 3. 加完有机溶剂后，立即离心，分析沉淀 4. 加有机溶剂的量计算精确 5. 乙醇上层液入回收瓶
比色分析的原理
有色溶液
设： I IO
T (透光度)
A = lg IO = -lg I = -lg T
I (吸光度)
实验二 碱性磷酸酶的提 取及其比活性测定
材料选择
细胞的破碎
分离纯化
鉴定
碱性磷酸酶 (ALP , AKP) Alkaline phosphatase
一、实验目的
1、 掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶 的原理和方法；
2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、 得率及纯化倍数的概念及计算；
3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般 方法。
（待测蛋白质含量）
剩余A液
加2ml正丁醇，搅拌 3-5'，室温放置30'， 过滤，入离心管
上述滤液
加等体积冷丙酮，混匀， 离心2000 rpm、5分钟
上清入回收瓶
沉淀
加4.0 ml 0.5 M Mg(Ac)2,
搅拌，记体积VB
B液
B1管
0.10ml B 液 + 4.9 ml 0.01M pH 8.8 Tris
① 取材 取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织
本次实验：肝脏
② 生物组织与细胞的破碎
➢ 机械破碎法 ：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵 ➢ 渗透破碎法 ：低渗条件使细胞溶胀而破碎
➢ 反复冻融法 ：
➢ 超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而
使细胞破碎
➢ 酶法 ：如用溶菌酶破坏微生物细胞
生物化学实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的
目的要求： 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活 测定的方法
1.原理 1.原理
碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为ALPase) 简称为ALPase) 广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应， 产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以 催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯 转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。
上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用 Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋 白浓度高低而定。（一般稀释5 10倍）。 白浓度高低而定。（一般稀释5-10倍）。
3.3 结果处理 计算：
酶活力(U/mL) = B t ⋅ V1 C ⋅A V2
蛋白浓度(mg/mL) =
上清液
缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱和度（100 mL加入20.9 g），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。 ），不断搅拌溶解，置冰箱静置1 h。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集离心上清液，并量体积。 min，收集离心上清液，并量体积。 0.35饱和硫酸铵上清液 0.35饱和硫酸铵上清液 加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。 加入固体研磨细粉的硫酸铵至0.70饱和度（100 mL加入23.8 g）。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置2 h。 室温离心，4000 室温离心，4000 r/m 20 min，收集沉淀物。 min，收集沉淀物。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定项目名称碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定xinpingzhao@实验目的1. 了解酶提取纯化的基本实验技术;2. 掌握碱性磷酸酶酶活力及比活力的测定方法实验材料新鲜兔肝或兔肾主要仪器设备匀浆器,冷冻离心机,分光光度计,电子天平等.实验原理碱性磷酸酶（简称AKP）在磷酸盐代谢中起重要作用。
核酸序列分析、DNA重组技术、酶标免疫检测技术以及临床检验中都需要利用此酶。
本实验取材于兔肝，经匀浆、正丁醇抽提、硫酸胺分段盐析或者有机溶剂沉淀，获得碱性磷酸酶制品。
本实验采用对硝基苯磷酸二钠（p-NPP）为底物的方法测定酶活。
对硝基苯磷酸二钠在碱性磷酸酶的作用下被水解为游离磷酸及对硝基苯酚，对硝基苯酚在强碱性条件下显示亮黄色，在405nm处有强烈的吸收峰。
因此可以测定405nm处的吸收值A405nm来计算产物的生成量，从而计算出酶活力，然后通过各级纯化步骤产物蛋白含量的测定,从而计算出酶的比活力.第一部分: 碱性磷酸酶的提取以下操作均在4℃进行。
方案一:1. 称取新鲜兔肝2g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，按1:2（m/v）加入预冷的0.05mol/LTris-HCl （pH9.0）缓冲液，匀浆后4℃抽提20 min；4℃，8000r/min离心10min；取上清；此为A 液。
另取1支试管编号为A，取0.1mLA 液，加1.9mLTris缓冲液(pH 8.8)，混匀，供测酶活性用。
2.上清液中加入1/5体积预冷正丁醇脱脂20min；8000r/min离心10min，取上清；此为B液。
吸取0.1m1B 液，置于编号为B 的试管中，加入1.9m1Tris 缓冲液(pH 8.8)，供测酶活用。
3.加入硫酸铵至35%饱和度；4℃30 min；8000r/min离心10min，弃沉淀；取上清；此为C 液。
吸取C 液0.2m1置于编号为c 的试管中，加入1.8m1Tris 缓冲液(PH 8.8)，供测酶活性用4.然后在上清液中加入硫酸铵至75%饱和度，4℃静置30 min后8000r/min离心10min，得沉淀..用0.05mol/LTris-HCl（pH9.0）缓冲液溶解沉淀；此为D 液。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应，在多种生理过程中发挥重要作用。
其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。
一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），用高速离心离心3-5分钟，去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液，在实验台上加入玻璃珠或石英砂，放入冰箱冷冻器中。
2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），放入研钵中，加入冰冷甲醇，研磨5-10分钟。
将打磨液离心分离，上清液用分液漏斗收集，加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液，静置20分钟，收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。
3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂，轻微摇动，分离出沉淀，将上清液倒入烧瓶中，并用氯仿洗涤，收集洗涤液后将其合并，加入甲醇进行沉淀，离心分离，去除上清液，加入2-3倍体积的丙酮，静置反复冲洗多次。
将沉淀中加入适量的溶解液，摇混均匀，转移至离心管中，并用离心机转速2800r/min/5 min。
二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中，包括10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等，总体积为2ml。
2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品，并制备好标准品不同浓度的稀释液。
将稀释后的酶样品取1ml，加入酶活性试验体系中，并在无酶样品控制下，以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液，如α-萘酚磷酸钠。
注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生，以免误诊。
3、反应终止在反应末期，可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应，并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控，并测定比活力。
综上所述，选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定(优选参考)
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V= 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。
碱性磷酸酶的分离纯化鉴定
2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律
A ＝ K·L·C
吸光度 (Aabsorbance,A ) 消光度 (degree of extinction,E ) 光密度 (optical density,D )
参比溶液的选择
• 溶剂空白： 当显色剂及所用其它试剂在测定波长 都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比 溶液。
• 试剂空白： 当显色前的样品在测定波长没有吸收 峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时， 可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这 种方式最为常用。
基本组件及常见分光光度计
样品的蛋白含量
纯化倍数 =
每一步比活性 初提液比活性
得率 =
每一步总活性 初提液总活性
每一步总活性 = 酶活性 × 每一部记录的体积数
分光光度法 （Spectrophotometry）
根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收 （即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种 定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法 （Absorption spectrometry）。
不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来
（一）基本原理
1、光的基本知识 光具有波粒二相性。 波长和频率是光的波动性的特征。
K-- 吸光系数,是物质的特征性常数。
• 对比法进行定量分析
A样 = K ·L ·C样 A标 = K ·L ·C标
A样
K ·L ·C样
C样
A标
K ·L ·C标
C标
C样 = A样·C标 / A标
Lambert—Beer定律的适用范围：
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定
碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定一、实验原理(1).碱性磷酸酶的分离纯化1. 机械破碎法制备肝匀浆低浓度乙酸钠：低渗破膜低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加入不同有机溶剂重复离心正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP(2).比活性测定1.比活性的定义*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理(3).米氏常数测定K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。
二. 器材721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器托盘天平匀浆器试管三. 试剂1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中,稀释至50ml.2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.4. 丙酮(分析纯).5. 95%乙醇(分析纯).6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,稀释至10ml.12. 酚标准液(0.1mg/ml).四.实验步骤(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。
实验碱性磷酸酶米氏常数的测定
浓度
标准曲线与样品的测定条件必须一致。
（2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可 求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的 吸光系数，也称为摩尔吸光系数。
(三)米氏常数的测定原理
酶促反应v-[S]曲线
v
[S]
推导出米氏方程为：
（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射 光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光 程的厚度
2．常用方法 （1）标准曲线法
OD或Ａ
二、原理
一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 1．原理
2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长
蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长 为260nm。
1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸
（3）比较吸光度的比值
A260 nm 1.8 纯DNA A280 nm
No. 底物终浓度[S] (mM ) 10 mmol/L pNPP（mL ） 蒸馏水（mL ） 碳酸盐缓冲液（mL ） 20 mmol/L MgCl2 （mL ） 预热 酶液（mL ） 反应时间 0.1 mol/L NaOH（mL） 酶液（mL ） OD405 1 2 3 4 0.5 0.75 1.0 1.5 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 0.45 0.4 0.3 各加1.0 mL 各加0.2 mL 混匀，37℃，5分钟 测定管各加0.2 mL酶液 37℃，精确反应10分钟 各加2 mL 空白管各补加0.2 mL酶液 5 3 0.6 0
实验三 碱性磷酸酶的分离纯化和Km
AKP
磷酸苯二钠 PH 10
磷酸盐 + 酚
铁氰化钾 酚 + 4-氨基安替比林 碱性 红色醌类衍生物
利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活 性（A），按 Lieweaver-Burk 二氏法作图，从 x 轴上的截距求得其 Km 值。
三、实验仪器及试剂
仪器： 恒温水浴锅，721 型分光光度计。 试剂： 1. 0.04mol/L 作用物液：称取 10.16g 磷酸苯二钠 （C6H5PO4Na2· 2H2O），用 煮沸后冷却的蒸溜水溶解， 并稀释 至 1,000ml， 4ml 氯仿防腐， 加 贮于棕色瓶内， 置冰箱内保存， 可用一周。
• 将分离提取的硷性磷酸分装成 2ml 瓶，冰 冻干燥保存或液体保存也可，但 均置于60℃低温冰箱保存。应用时稀释 5—7 倍测 其 Km 值。
第二部分 碱性磷酸酶Km测定
一、实验目的
掌握碱性磷酸酶的的动力学鉴定—Km 鉴定
二、实验原理
• 当温度、pH 及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度 随作用物浓度[S]增 大而增大，但增大到一定限度时，作 用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此 时反应速度为 最大速度（Vmax）。Michaelis Menten 对酶促反应速度与
• 试剂：
1 0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至 1000
m1。 2 3 0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至 1000 m1。 0.0lmol/L 醋酸镁-0.01mol/L 醋酸钠溶液： 准确吸取 20ml0.5mol/L 醋 酸 镁溶液及 100ml0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至 1000 m1。 4 Tris-HCl pH8.8 缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷 12.1g，用蒸馏水溶解 后 定容至 1000mL，即为 0.1mol/LTrls 溶液。取 100m1 0.1mol/LTrls 溶 液，加蒸 馏水约 780mL，再加 0.1mol/L 醋酸镁溶液 100m1，混匀后 用 1％冰醋酸调 pH 为 8.8，用蒸馏水定容至 l000m1。 5 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。
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碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常
数测定
一、实验原理
(1).碱性磷酸酶的分离纯化
1. 机械破碎法制备肝匀浆
低浓度乙酸钠：低渗破膜
低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP
2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP
加入不同有机溶剂重复离心
正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质
33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP
50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP
(2).比活性测定
1.比活性的定义
*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。
*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。
*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。
2.测定样品的比活性必须测定：
*每毫升样品中的酶活性单位数。
*每毫升样品中的蛋白质毫克数。
3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理
(3).米氏常数测定
K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度
＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,
米氏常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，
以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。
二. 器材
721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器
托盘天平匀浆器试管
三. 试剂
1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中,
稀释至50ml.
2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水
中,
稀释至10ml.
3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml
及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.
4. 丙酮(分析纯).
5. 95%乙醇(分析纯).
6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.
7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,
4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.
8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.
9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.
10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各
溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.
11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,
稀释至10ml.
12. 酚标准液(0.1mg/ml).
四.实验步骤
(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作。