碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常数测定

碱性磷酸酶的分离纯化及比活性与米氏常

数测定

一、实验原理

(1).碱性磷酸酶的分离纯化

1. 机械破碎法制备肝匀浆

低浓度乙酸钠：低渗破膜

低浓度乙酸镁：保护和稳定AKP

2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP

加入不同有机溶剂重复离心

正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质

33%丙酮、30%乙醇：溶解AKP

50%丙酮、60%乙醇：沉淀AKP

(2).比活性测定

1.比活性的定义

*单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。

*通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。

*用以鉴定酶的纯化程度，是酶分离提纯完成的评价指标之一。

2.测定样品的比活性必须测定：

*每毫升样品中的酶活性单位数。

*每毫升样品中的蛋白质毫克数。

3.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性反应原理

(3).米氏常数测定

K m 即为米氏常数，V max为最大反应速度

＊如上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度,因此,

米氏常数的单位为mol/L。

当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 V max, K m = [S]＊吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标，

以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法可求出Km 值。

二. 器材

721分光光度计台式离心机恒温水浴锅微量移液器

托盘天平匀浆器试管

三. 试剂

1. 0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁 5.3625g溶于蒸馏水中,

稀释至50ml.

2. 0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠0.0820g溶于蒸馏水

中,

稀释至10ml.

3. 0.01mol/L醋酸镁---醋酸钠溶液取0.5mol/L醋酸镁溶液2ml

及0.1mol/L醋酸钠溶溶液10ml,混合均匀后加蒸馏水稀释至100ml.

4. 丙酮(分析纯).

5. 95%乙醇(分析纯).

6. Tris缓冲液(Ph8.8) 称取Tris 6.05g,用蒸馏水溶解成50ml,为0.1mol/L Tris液,取0.1mol/L Tris液10ml,加0.5mol/L 醋酸镁2ml,加蒸馏水80ml,再用1%醋酸调pH至8.8,然后用蒸馏水稀释至100ml.

7. 0.01mol/L基质液称取磷酸苯二钠(C6H5PO4Na2.2H2o) 0.3g,

4-氨基安替比林0.15g,分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中;两液混合并蒸馏水稀释至50ml,加0.2ml氯仿防腐,盛于棕色瓶中,冰箱内保存,可用一星期; 临用时与等量0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液混合即可.

8. 0.1mol/L pH10的碳酸盐缓冲液称取无水碳酸钠0.318g 及碳酸氢钠0.168g溶于蒸馏水,稀释至50ml.

9. 碱性溶液量取0.5mol/L氢氧化钠溶液与0.5mol/L碳酸氢钠溶液各20ml,混合后加蒸馏水至100ml.

10. 0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾0.25g和硼酸0.75g,各

溶于20ml蒸馏水中,溶解后两液混合均匀,再加蒸馏水至50ml,置棕色瓶中暗处保存.

11. 0.1mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁0.2145g溶于蒸馏水中,

稀释至10ml.

12. 酚标准液(0.1mg/ml).

四.实验步骤

(1). “碱性磷酸酶分离纯化”实验操作