表达序列标签技术
EST序列
EST序列表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。
这一概念首次由Adams等于1991年提出。
近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。
在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。
克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。
而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。
文本将就EST 技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。
1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。
因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。
Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。
虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。
Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。
表达序列标签(est)在基因组学研究中的应用
表达序列标签(est)在基因组学研究中的应用序列标签（Sequence Tag）是指由DNA或RNA片段构成的一系列序列标记，它可以在遗传疾病、基因表达、信号转导等生命科学研究中发挥重要作用。
其中，表达序列标签（EST）是一种简单而有效的标记技术，它的应用在基因组学领域得到了广泛关注。
一、EST技术简介EST技术是一种由测序技术支持的高通量筛选技术，其主要原理是通过随机挑选某些不同的cDNA克隆来获得所需的不同的EST序列。
它的应用可以大大降低生物学研究的难度，也可以在较短的时间内获得大量的基因序列。
二、EST在基因组学研究中的应用（一）基因组注释及功能预测基因组注释是指对基因组序列进行生物信息学分析，以确定其中的基因区域和基因的结构。
EST技术可以通过对基因组序列的全长编码区域进行建库、测序和组装，从而确定基因的结构和位置，从而实现基因组注释。
（二）基因家族的发现和分类EST技术可以应用于表达的基因家族的发现和分类，例如受体基因、酶基因和转录因子基因家族等。
EST序列可以用作启动点，通过比对模式，可将同源序列聚类形成基因家族，并进一步研究其与环境、生长过程或其它生物学过程的关系。
（三）隐形基因的寻找传统的基因克隆方法主要寻找已知的基因进行克隆，而隐形基因（也称未知基因）的寻找则需要更为深入的研究。
EST技术可以通过测序与注释，从全基因组的角度分析，实现隐形基因的发现。
这可以为了解未知疾病的发病机制、发病率等方面提供重要支持和信息。
（四）基因调控机理的研究EST技术不仅可以应用于基因组学研究，还可以应用于表观遗传学——研究基因调控机理。
EST序列常常用于测定细胞特异性基因表达、基因表达的时间和空间分布等方面。
它对于异等基因的表达差异、组织特异性基因表达模式、静态和动态转录调控等具有重要的科研价值。
同时，它还可以用于筛选差异表达基因，并进一步研究其相关的信号传导机制、生长发育机制等。
三、结论在基因组学研究中，EST技术可以为高通量测序提供支持，并更好地揭示基因组结构和基因调控机制。
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。
所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。
通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。
2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。
2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。
2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。
2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。
重大生物学考研题库-分子名词解释(3)
1、前导链（leading strand）：在DNA复制过程中，与复制叉运动方向相同，以5’→3’方向连续合成的链被称为前导链。
2、基因组（genome）：一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因，包括每一条染色体和所有亚细胞器的DNA序列信息。
3、分子杂交（molecular hybridization）：在退火条件下，不同来源的DNA互补区形成双链或DNA单链与RNA单链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。
4、锚定PCR（anchored PCR）：用于在体外扩增未知序列的DNA片段的方法，一般的PCR 必须预先知道欲扩增DNA片段两侧的序列，但人们经常需要分析一端序列未知的基因片段，此时就可利用锚定PCR。
该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因另一侧配对的特异引物参与下，扩增带有同聚物尾的序列。
锚定引物PCR对分析未知序列基因有特殊用途。
5、基因工程（genetic engineering）：是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达，其核心技术是基因重组。
6、反式作用因子（transacting factor）：是指能够结合在顺式作用元件上调控基因表达的蛋白质或者RNAs。
7、核内不均一RNA（hnRNA，heterogeneous nuclear RNA）：即mRNA的前体，经过5’加“帽”和3’酶切加多聚腺苷酸，再经过RNA的剪接，编码蛋白质的外显子部分就连接成为一个连续的可译框，作为蛋白质合成的模板。
8、移码突变（frameshift mutation）：指一种突变，其结果可导致核苷酸序列与相对应蛋白质的氨基酸序列之间的正常关系发生改变。
移码突变是由删去或插入一个核苷酸的“点突变”构成的，突变位点之前的密码子不发生改变，但突变位点之后的所有密码子都发生变化，编码的氨基酸出现错误。
EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签
EST (Expressed Sequence Tag）表达序列标签EST (Expressed Sequence Tag)表达序列标签—是从一个随机选择的cDNA 克隆，进行5’端和3’端单一次测序挑选出来获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ±120bp。
由于cDNA文库的复杂性和测序的随机性，有时多个EST代表同一基因或基因组，将其归类形成EST 簇（EST cluster)原理：EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等，平均长度为360 ±120bp。
EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。
技术路线：首先从样品组织中提取mRNA，在逆转录酶的作用下用oligo (dT) 作为引物进行RT-PCR合成cDNA，再选择合适的载体构建cDNA 文库，对各菌株加以整理，将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序，这就是EST 序列的产生过程。
应用：EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA 序列高度保守而具有自身的特殊性质，与来自非表达序列的标记（如AFLP、RAPD、SSR等）相比更可能穿越家系与种的限制，因此EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用。
同样，对于一个DNA 序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。
具体说，EST的作用表现在：⑴用于构建基因组的遗传图谱与物理图谱；⑵作为探针用于放射性杂交; ⑶用于定位克隆；⑷借以寻找新的基因; ⑸作为分子标记；⑹用于研究生物群体多态性；⑺用于研究基因的功能；⑻有助于药物的开发、品种的改良；⑼促进基因芯片的发展等方面。
表达序列标签EST概要
表达序列标签EST概要摘要：随着EST研究的开展、深入，以及相关研究技术和分析手段的不断改进并走向成熟，EST 数据资源不断丰富，而其本身又具备独特的优势和多方面的利用价值。
本文介绍了EST序列的获取、加工、储存、分配、分析和释读的相关研究。
关键词：EST 表达序列标签聚类cDNA文库生物信息学从事对生物信息的获取、加工、储存、分配、分析和释读，并综合运用数学、计算机科学和生物学工具，以达到理解数据中的生物学含义的目的。
随着人类基因组计划在世界范围内的开展，生物信息学作为一门热门交叉学科，不断地完善和发展起来作为一种强有力的工具，它在帮助我们对巨量的生物信息进行归纳和理解，从而揭示生命的奥妙的过程中发挥了重要的作用。
然而信息的爆炸增长，面对复杂和庞大的数据库，如何有效地地获取我们所需要的信息，充分利用这些已有的数据资源，加速基因克隆研究已成为一个富有挑战性的课题。
表达序列标签的广泛应用，为大规模进行基因克隆和表达分析提供了强大的动力，也为生物信息学功能的充分发挥提供了广阔的空问表达序列标签(EST，Expressed Sequence Tag)是指从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列,代表了一个完整基因的一小部分。
Adams等人在1991年提出了EST技术，宣布了cDNA大规模测序时代的开始。
随着大规模的测序，EST数据呈指数级增长。
到了1995年中，GenBank里ESTs的数量已超过非ESTs的数量；2000年6月，将近460万的ESTs 已占了GenBank里所有序列的62%。
ESTs序列不止来源于人类，NCBI的dbEST （EST database）中已包含了超过250种生物来源的ESTs，包括小鼠、大鼠、秀丽线虫和黄果蝇等。
除此之外，也有许多商业性的机构保存了一些属于机构内部不公开的ESTs 序列。
EST序列的制备EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。
表达序列标签技术及其应用
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表 达序 列 标 签 （ ｘ ｒｓ ｅ ｕ ｎ ｅｔｇ ，以下 简 称 为 Ｅ Ｔ） ｃ Ｅ ｐ ｅｓｓｑ ｅ ｃ ａ ｓ Ｓ 是 ＤＮＡ 的 部分 序 列 ， 是将 ｍＲＮＡ 反 转 录成 ｃ ＤＮＡ 并克 隆到 载体 构建 成 ｃ ＤＮＡ 文 库 后 ， 规模 随机 挑 选 ｃ ＮＡ 克 隆 ， 其 ５ 或 ３ 端进 行 一步 法 测序 ， 大 Ｄ 对 ’ ’ 并
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表 达谱 分 析 、 因组 功 能 注释 、 因电 子 克隆 、 备 Ｄ 基 基 制 ＮＡ 芯 片 、 ＮＡｉＲ ｎｅｆｒｎ ｅ 技 术 的研 究 、 找其 Ｒ （ ＮＡ ｉｔｒｅｅ ｃ ） 寻
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生物信息学名词解释
1.计算生物信息学（Computational Bioinformatics）是生命科学与计算机科学、数理科学、化学等领域相互交叉而形成的一门新兴学科，以生物数据作为研究对象，研究理论模型和计算方法，开发分析工具，进而达到揭示这些数据蕴含的生物学意义的目的。
2.油包水PCR (Emulsion PCR) : 1) DNA片段和捕获磁珠混合; 2) 矿物油和水相的剧烈震荡产生油包水环境; 3) DNA片段在油包水环境中扩增;4) 破油并富集有效扩增磁珠。
3.双碱基编码技术：在测序过程中对每个碱基判读两遍，从而减少原始数据错误，提供内在的校对功能。
代表测序方法：solid 测序。
4.焦磷酸测序法：焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应,适于对已知的短序列的测序分析,其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美,而速度却大大的提高。
焦磷酸测序技术不需要凝胶电泳,也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标记和染色,具备同时对大量样品进行测序分析的能力。
在单核苷酸多态性、病原微生物快速鉴定、病因学和法医鉴定研究等方面有着越来越广泛的应用。
例如：454测序仪5.tblastn：用蛋白质序列查找核苷酸序列。
6.STS:STS是序列标记位点（sequence-tagged site）的缩写，是指染色体上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因组中只有一份拷贝的DNA短片断，一般长200bp－500bp。
它可用PCR方法加以验证。
将不同的STS依照它们在染色体上的位置依次排列构建的图为STS图。
在基因组作图和测序研究时，当各个实验室发表其DNA测序数据或构建成的物理图时，可用STS来加以鉴定和验证，并确定这些测序的DNA片段在染色体上的位置；还有利于汇集分析各实验室发表的数据和资料，保证作图和测序的准确性。
7.EST:表达序列标签技术（EST，Expressed Sequence Tags）EST技术直接起源于人类基因组计划。
分子标记技术的种类
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。
理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。
目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。
其特点比较见表一。
1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。
其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。
进行RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。
目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。
表达序列标签名词解释
表达序列标签名词解释
序列标签（Sequence Labeling）是自然语言处理中的一种任务，目标是给定一个输入序列，为该序列中的每个元素分配一个标签。
常见的序列标签任务包括命名实体识别（Named Entity Recognition）、词性标注（Part-of-Speech Tagging）和语义角色标注（Semantic Role Labeling）等。
在命名实体识别任务中，输入序列是一个句子，而标签表示该句子中的每个词语是否是命名实体，以及其所属的实体类别，如人名、地名、组织机构等。
词性标注任务中，输入序列同样是一个句子，而标签表示该句子中每个词语的词性，如名词、动词、形容词等。
语义角色标注任务中，输入序列是一个句子，而标签表示该句子中每个词语在句子中的语义角色，如施事者、受事者、时间、地点等。
序列标签任务在自然语言处理中具有重要的应用价值，可以帮助机器理解文本中的语义和结构信息，为后续的文本分析和理解任务提供支持。
第6章 分子生物学研究方法(下)
④具有良好的机械性能
非特异吸附少
4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低
（2）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到 固相支持物上。
（3）真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝
胶在上的方式将其放臵在一个真空室上，利用真空作用
将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真 空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或
硝酸纤维素膜上。
各种转移方法的比较：
6.1.2 RNA选择性剪接技术
RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、 5’ 选择性剪切、 3’ 选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。 果蝇 Dscam 基 因可 以通过可变 剪接产生38000多 种 可 能 的 mRNA 异构体
Illumina Solexa 测序 Workflow
Illumina Sequencing Technology
有参考基因组序列生物信息分析
• 基因结构优化
• 鉴定基因可变剪接 • 预测新转录本 • SNP 分析 • 基因融合鉴定
5.4.1 RACE 法克隆基因全长 (Rapid Amplification of cDNA Ends)
4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法
STS STR ITS SDs总结
1、STS(序列标签位点)，是已知核苷酸序列的DNA片段，是基因组中任何单拷贝的短DNA序列，长度在100～500bp之间。
任何DNA序列，只要知道它在基因组中的位置，都能被用作STS标签。
作为基因组中的单拷贝序列，是新一代的遗传标记系统，其数目多，覆盖密度较大，达到平均每1kb一个STS或更密集。
用途：这种序列在染色体上只出现一次，其位置和碱基顺序都是已知的。
在PCR反应中可以检测出STS来，因此STS适宜于作为人类基因组的一种地标，据此可以判定DNA 的方向和特定序列的相对位置。
任何一个DNA序列要成为STS，须满足两个前提：第一：它的序列必须是己知的，以便于用PCR方法检测STS在不同DNA片段中存在与否。
第二个要求是STS必须在待研究的染色体上有唯一的定位，或当DNA片段群覆盖全基因组时，STS在整个基因组中具有唯一的定位位点。
如果STS序列具有多个定位点，那么作图数据将会模糊不清。
因此需要确保STS不包含重复DNA的序列。
获得STS途径：①、表达序列标记：表达序列际记(expressed sequence tag, EST)是通过互补DNA (cDNA)克隆分析获得的短序列。
制备互补DNA是将mRNA转化成双链DNA.由于细胞中mRNA来自于编码蛋白的基因，故此cDNA代表了mRNA来源的细胞中表达的基因序列。
EST被看做获得重要基因序列的快捷途径。
即使其序列不完整，也仍然有价值。
如果EST 来自于单一序列DNA，不是基因家族中的某一成员，它也可以被用作STS。
而所谓基因家族是指一组具有相同或相近序列的基因。
②、SSLP：SSLP在物理作图中也可以被用作STS，具有多态性的SSLP以及已通过连锁分析定位的SSLP特别有用，因为它们可在遗传图谱和物理图谱间提供直接联系。
③、随机基因组序列：可以通过对克隆的基因组DNA的随机小片段进行测序或在数据库中搜寻贮存序列获得。
2、STR(短串联重复序列)：又称微卫星DNA（micro satellite DNA），是一类广泛存在于人类基因组中的DNA多态性基因座。
表达序列标签研究进展及其在甲壳动物中的应用概况
表达序列标签研究进展及其在甲壳动物中的应用概况摘要：随着生物信息学的发展，表达序列标签（ＥＳＴ）在分子标记开发、新基因分离鉴定、基因表达谱分析、基因组功能注释、基因电子克隆等方面具有重要作用。
简要介绍了ＥＳＴ分析的原理及其在基因识别、基因预测、物理图谱的构建、ＤＮＡ芯片制备等方面的应用概况。
综述了甲壳动物ＥＳＴ的研究现状，并对ＥＳＴ的应用前景进行了展望。
关键词：表达序列标签（ＥＳＴ）；甲壳动物；生物信息学Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ（ＥＳＴ）played ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅiｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｎｅｗｇｅｎｅｓｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｇｅｎｏｍｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｎｏｔａｔｉｏｎａｎｄｓｉｌｉｃｏｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ．TｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆＥＳＴａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓiｎｇｅｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＤＮＡｃｈｉｐｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎwas briefly introduced．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｓｔａｔｕｓｏｆｃｒｕｓｔａｃｅａｎＥＳＴａｎｄthe ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆＥＳＴａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅａｌｓｏｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ（ＥＳＴ）；ｃｒｕｓｔａｃｅａｎ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ表达序列标签（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）是从一个随机选择的ｃＤＮＡ克隆进行５’端和３’端单一次测序获得的短的ｃＤＮＡ部分序列。
分子标记特点和应用
分子标记技术方法和他们特点1、限制性片段长度多态性标记分析(Re striction Fragment Length Polymorphism，RFLP)—RFLPRFLP技术的是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可的产生RFLP技术特点：RFLP技术优点：①结果稳定，重复性好，特别是PCR-RFLP（CAPS）由于是特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性更高。
②是一种共显性标记，可区分纯合体与杂合体，数据多态信息量大，不受显隐性关系、环境条件、发展阶段及组织部位影响。
③RFLP标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响，具有个体、种、属及各种各层次水平的特异性。
④核基因组的RFLP标记表现为孟德尔的共显性遗传，而细胞质基因组的RFLP一般表现为母性遗传。
RFLP技术缺点：①分析所需DNA量较大，分析速度慢。
②步骤较多，周期长，技术复杂，费用高。
③检测多态性水平过分依赖限制性内切酶，使多态性降低，对DNA质量要求高。
④检测中需放射性物质，限制了广泛应用。
⑤对于线粒体DNA而言，因为其进化速度快，影响种以上水平的RFLP分析的准确性。
但是种以上水平影响很小。
2.随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphism DNA）—RAPD以单一的随机引物(一般为10个碱基)利用PCR技术随机扩增未知序列的基因组DNA获得的DNA片段长度变异。
它是利用随机引物通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。
RAPD技术特点：RAPD优点：①无种属特异性,一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛和通用的特点。
②适合于自动化分析。
操作技术简单，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术，省工省力和工作进度快。
表达序列标签
表达序列标签科技名词定义中文名称：表达序列标签英文名称：expressed sequence tag;EST定义1：从互补DNA(cDNA)分子所测得部分序列的短段DNA(通常300~500bp)。
从cDNA文库所得到的许多表达序列标签集合组成表达序列标签数据库，代表在一定的发育时期或特定的环境条件下，特定的组织细胞基因表达的序列。
可用于验证基因在特定组织中的表达，推导全长cDNA序列，或作为标签标志基因组中的特殊位点以确定基因的位置等。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义2：代表基因表达信息的cDNA序列片段。
所属学科：遗传学（一级学科）；基因组学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布目录编辑本段EST(Expressed Sequence Tag)表达序列标签EST是从一个随机选择的cDNA 克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA 部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20 到7000bp 不等,平均长度为360 ±120bp。
EST 来源于一定环境下一个组织总mRNA 所构建的cDNA 文库,因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。
首先从样品组织中提取mRNA ,在逆转录酶的作用下用oligo ( dT) 作为引物进行RT -PCR 合成cDNA ,再选择合适的载体构建cDNA 文库,对各菌株加以整理,将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序,这就是EST 序列的产生过程。
编辑本段应用EST作为表达基因所在区域的分子标签因编码DNA 序列高度保守而具有自身的特殊性质,与来自非表达序列的标记(如AFLP、RAPD、SSR 等) 相比更可能穿越家系与种的限制,因此EST标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性状信息是特别有用。
同样,对于一个DNA 序列缺乏的目标物种,来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图,加速物种间相关信息的迅速转化。
基因表达轮廓(gene expressed profile)技术(2)
基因表达轮廓（gene expressed profile）技术(2)经过这轮ＲＤＡ过程,Tester中的目的DNA将得到第一次富集。
将第一轮产物更换新接头,进行第二轮RDA过程,目的DNA可得到进一步的富集。
该技术假阳性很低。
但仍不能解决个体mRNA在丰度上存在巨大差异的问题,当靶序列浓度较低时,其富集受抑制。
3：抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术是Diatchenko于1996年建立的另一种应用PCR方法的消减杂交技术.该技术是反转合成testercDNA和drivercDNA, RsaⅠ或HaeⅢ酶切成为短片段T和D,将T分为两份加不同的接头1（A1）和2(A2)(均为44/10 bp5’脱磷双链，5’脱P可保证只有接头中的长链可以与cDNA的5’-末端连接，分别具有一段反向末端重复序列，具体序列见实验),将T1和T2分别与过量的D杂交,第一轮杂交后,两组杂交产物混合,将这些产物再与D进行第二轮杂交,产生如下杂交体：T1/T2;T1/T1;T2/T2;T1/D;T2/D;D/ D。
杂交产物补平后作为模板,用A1和A2作为引物进行PCR扩增。
在上述杂交体中T1/T2双链两端带有不同接头序列，因此可以指数扩增；T1/D和T2/D因只有一个引物配对序列所以只能线形扩增，而T1/T1和T2/T2尽管双链两端均带有接头，但由于其双链带的接头为同类，在末端补平后形成长反向重复序列，并且链内退火优于链间退火，因此在退火时产生“锅柄样”结构，无法与引物配对，不能扩增（此即为抑制PC R）；而D/D因没有引物配对序列则无法扩增，因此经过两次杂交及PCR后只有T1/T2复合体才能得到扩增。
这样仅在目标样品中表达而在驱动样品中不表达的基因转录产物被差显。
SSH与cDNA-RDA相比除具有假阳性低，稳定性好的共性外，还解决了mR NA丰度差异的问题。
基因工程名词解释
变性：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基之间的氢键断裂，使DNA分子双螺旋结构松散，变成单链。
复性：高温变性的DNA逐渐冷却后，分开的两条单链重新结合成双链DNA退火：热变性的DNA经缓慢的冷却后，复性的过程PCR聚合酶链反应，是模仿体内细胞DNA复制的过程的体外DNA快速扩增方法。
以DNA互补链聚合反应为基础，通过DNA变性，引物与模板一侧的互补序列复性杂交，耐热DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，获得待扩增的特异性DNA片段。
模板：一条单链DNA片段，其3'上具有与引物杂交的序列引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段，其3'端必须具有游离的-0H基团。
限制核酸内切酶：能专一性的识别双链DNA上的特殊核苷酸序列，并使每一条链的一个磷酸二酯键断开。
DNA连接酶：催化DNA链的相邻3'羟基和5'-磷酸基团发生缩合反应，形成磷酸二酯键，分为ATP依赖型和NAD依赖型。
Klenow片段：是大肠杆菌DNA聚合酶I的羧基端片段,长度为全酶的70 %。
具有5' 3'聚合酶活性及3 ' t 5 '外切酶活性。
限制性图谱：DNA分子上的限制性内切核酸酶的识别序列的分布图同裂酶：即从不同的原核生物中分离出来，具有相同识别序列的限制性核酸内切酶。
切割的位点可以相同，也可以不相同。
同尾酶：来源不同，识别序列也不同，但切割DNA分子所得到的DNA片段具有相同的黏性末端，这样一组限制性核酸内切酶称为同尾酶。
黏性末端：大多数断裂的结果形成的DNA片段,具有互补碱基的单链延伸末端.这种末端叫黏性末端。
酶活性单位：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下,60min内完全切割lug入DNA所需要的酶活性定为1酶活性单位（unit 或U）容积活性：1ul 酶液中具有的酶活性单位，即U/ul缺口：在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。
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及分析正处于研究阶段。
1 原理
此技术以大规模 cDNA 测序为基础，即提取生部分（即 EST 序列）进行序列测定，然后通过生物信息学手段得到全长的基因序列。通常 EST 序列位于
一段 cDNA 的 3’—端非翻译区，也可以在该 cDNA 中随机选取。利用 EST 技术克隆基因及功能分析，使克
表达序列标签技术（EST，Expressed Sequence Tags）
EST 技术直接起源于人类基因组计划。但是，由于人类基因数量巨大，以及真核基因特有的复杂性（如
内含子、外显子的区别、重复序列等），使得一次性不加选择地对基因组全长进行测序成为几乎不可能完
成的工作。Venter 等在 1991 年提出了表达序列标签（EST）技术。
隆和定位新基因的策略发生了巨大变革。
2 实验流程构建 cDNA ↓DNA 测序↓
信息处理和管理
↓
①
②
③
去除载体序列、宿主序列和重复序列 聚类分析、拼接
数据库查询
↓
生物信息学分析
3 特点
EST 自身的局限性集中体现在序列分析中的精确程度，另外还有由高丰度与低丰度序列之间的巨大差
异造成的重复测定与漏测。
4 应用
EST 的应用范围很广，但大多以测序为该技术应用的核心。一般用来进行基于 EST 序列的基因克隆与
基因表达分析。基因组学的研究从结构基因组学过渡到功能基因组学，利用结构基因组学的同存数据，充
分发挥 EST 技术的优势，将为大规模进行基因识别、克隆和表达分析提供空前的动力，为功能基因组的研
究提供广阔的空间。而在植物领域中，无论是模式植物拟南芥，还是以水稻为代表的农作物，其 EST 测序