高效液相色谱介绍和应用资料
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▪ 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁 基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。
▪ 反相离子对色谱法常用ODS柱，流动相为 甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范 围内进行分离。被测组分保留时间与离子 对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离 子强度有关。
三、HPLC使用注意事项
❖按双泵的连接方式可分为并联式和串联 式，一般说来并联泵的流量重现性较好 （RSD为0.1%左右，串联泵为 0.2~0.3%），但出故障的机会较多（因 多一单向阀），价格也较贵。
梯度洗脱注意事项
❖溶剂的纯度要高，否则重现性差；梯度 混合的溶剂互溶性要好；进样之前必须进 行空白梯度洗脱 ，以辨认溶剂峰；每次梯 度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡， 使之回到流动相组成的初始浓度。 ❖示差折光检测器对流动相组成变化敏感， 不能进行梯度系统。
HPLC的日常操作条件
最好是恒温、恒湿 温度：15~30℃ 相对湿度<80%
在一个分析周期内依据被测组分的极性 而按程序改变流动相组成进行洗脱的方法 叫做梯度洗脱。
优点：能缩短分析时间，提高分离度，改善 峰形。
缺点：基线漂移。在不同仪器或色谱柱上较 难重现。
高压/低压梯度洗脱系统及特点
❖ 由两台以上输液泵将两种以上溶剂分别送入混合 器混合，然后进入色谱柱的洗脱方式称为高压梯 度洗脱。特点：梯度准确度好。
吸光度 荧光强度 电流
无
无
有
小
小
大
10-10 10-13
10-13
离子流强度 散射光强
无
无
小
10-9
(g/ml) 池体积(µl) 2~10 梯度洗脱 适宜 样品破坏 无
2~7 适宜 无
＜1 不宜 无
–– 适宜 有
–– 适宜 无
检测器的保养
紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时打 开检测器，20分钟后可以进行检测；在分析 完闭后，先关紫外灯。（频繁的开关灯会缩 短灯的使用寿命）
一元泵系统
一个输液泵只能控制 一个输液瓶，即只能用一 种溶剂（单一或混合溶剂） 进行洗脱（等度洗脱）。 由于等度洗脱用的流动相 组成始终保持恒定，所以 只适合组分数目少，性质 差别不大的样本的分离。
二元泵系统
对于组分多、性质差别大的复 杂样本在一个条件下难以将各 个组分洗脱下来，如在一个分 析周期内按程序改变流动相的 组成（如极性、离子强度和pH 值)，使各组分在适当条件下 得到分离。
键合相色谱
▪ 分离原理：认为吸附、分配兼有之。 ▪ 正相色谱：采用极性固定相（如硅胶、氨基
与腈基键合相），流动相为相对非极性的疏 水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常 加入甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等 以调节组分的保留时间。用于分离中等极性 和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基 类及氨基酸类等）。
▪ 反相色谱：一般用非极性固定相（如C18、 C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、 乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶 的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非 极性和极性较弱的化合物。
▪ 离子交换色谱：固定相是离子交换树脂。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。主要 用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
▪ 改变流动相的pH值和离子强度可以改善分离。
▪ 排阻色谱法 固定相为有一定孔径的多孔 性填料。常用于分离高分子化合物，如组 织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
▪ 离子对色谱法 主要用于分析离子强度大 的酸碱物质。
▪ 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺 酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。高 氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成 很强的离子对。
检测器
▪ 检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。 其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信 号。根据检测原理可将其分为选择性检测 器和通用型检测器。
检测器
选择性 通用型
紫外(VWD、DAD)
荧光
电化学
示差折光 蒸发光散射 质谱
几种常用检测器的主要性能
UV
荧光 电化学 质谱 蒸发光
信号 流速影响 温度影响 检测限
❖ 由一台输液泵通过比例阀和在线脱气机完成的梯 度洗脱方法称为低压梯度洗脱。特点：需要配备 在线脱气机，易发生时间滞后效应。
▪ 现在的HPLC输液泵多用柱塞往复泵，它的 液缸容积可小至0.1ml，易于清洗和更换流 动相，特别适合于梯度洗脱，而且由于改变 电机转速就能方便地调节流量，所以流量不 受柱阻影响，输液泵压力可达400kg/cm2。 其主要缺点是输出的脉冲性较大，双泵系统 较好地克服了输出脉冲性较大的缺点。
样品池要常清洗
柱温箱
▪ HPLC分析一般在室温条件下进行,但适当 提高柱温能降低流动相黏度和柱前压，有 利于改善传质和提高分析速度，有利于提 高保留时间的重现性。
高效液相色谱分类方法与特点
HPLC 分类
▪ 根据固定相可以分为：液-固色谱、液-液色 谱及键合相色谱；
▪ 根据分离原理可以分为：吸附色谱、分配色 谱、离子交换色谱、离子对色谱、排阻色谱 等。
HPLC法的分离原理
▪ 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定 相时，与固定相(stationary phase)发生吸附、 分配、离子交换、排阻等作用，由于不同组分理 化性质不同，与固定相发生作用的大小、强弱不 同，导致在固定相中滞留时间不同，从而先后流 出色谱柱。
高效液相色谱仪的结构流程
主要内容
一、高效液相色源自文库法简介 二、高效液相色谱系统 三、高效液相色谱法分类 四、HPLC 使用注意事项
高效液相法色谱简介
高效液相色谱法的发展
▪ 高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)起始于 60年代后期，是在经典液相色谱法的基础 上引入了气相色谱理论而迅速发展起来的 一种分离分析方法。
色谱柱
高
检
压
测
泵
器
进 样 器
色谱 工作站
高效液相谱系统
输液泵
▪ 输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。输液 泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应＜ 0.5%；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到 150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好， 耐腐蚀。
▪ 反相离子对色谱法常用ODS柱，流动相为 甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范 围内进行分离。被测组分保留时间与离子 对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离 子强度有关。
三、HPLC使用注意事项
❖按双泵的连接方式可分为并联式和串联 式，一般说来并联泵的流量重现性较好 （RSD为0.1%左右，串联泵为 0.2~0.3%），但出故障的机会较多（因 多一单向阀），价格也较贵。
梯度洗脱注意事项
❖溶剂的纯度要高，否则重现性差；梯度 混合的溶剂互溶性要好；进样之前必须进 行空白梯度洗脱 ，以辨认溶剂峰；每次梯 度洗脱之后要对色谱柱进行充分的平衡， 使之回到流动相组成的初始浓度。 ❖示差折光检测器对流动相组成变化敏感， 不能进行梯度系统。
HPLC的日常操作条件
最好是恒温、恒湿 温度：15~30℃ 相对湿度<80%
在一个分析周期内依据被测组分的极性 而按程序改变流动相组成进行洗脱的方法 叫做梯度洗脱。
优点：能缩短分析时间，提高分离度，改善 峰形。
缺点：基线漂移。在不同仪器或色谱柱上较 难重现。
高压/低压梯度洗脱系统及特点
❖ 由两台以上输液泵将两种以上溶剂分别送入混合 器混合，然后进入色谱柱的洗脱方式称为高压梯 度洗脱。特点：梯度准确度好。
吸光度 荧光强度 电流
无
无
有
小
小
大
10-10 10-13
10-13
离子流强度 散射光强
无
无
小
10-9
(g/ml) 池体积(µl) 2~10 梯度洗脱 适宜 样品破坏 无
2~7 适宜 无
＜1 不宜 无
–– 适宜 有
–– 适宜 无
检测器的保养
紫外灯的保养：分析前，柱平衡差不多时打 开检测器，20分钟后可以进行检测；在分析 完闭后，先关紫外灯。（频繁的开关灯会缩 短灯的使用寿命）
一元泵系统
一个输液泵只能控制 一个输液瓶，即只能用一 种溶剂（单一或混合溶剂） 进行洗脱（等度洗脱）。 由于等度洗脱用的流动相 组成始终保持恒定，所以 只适合组分数目少，性质 差别不大的样本的分离。
二元泵系统
对于组分多、性质差别大的复 杂样本在一个条件下难以将各 个组分洗脱下来，如在一个分 析周期内按程序改变流动相的 组成（如极性、离子强度和pH 值)，使各组分在适当条件下 得到分离。
键合相色谱
▪ 分离原理：认为吸附、分配兼有之。 ▪ 正相色谱：采用极性固定相（如硅胶、氨基
与腈基键合相），流动相为相对非极性的疏 水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常 加入甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等 以调节组分的保留时间。用于分离中等极性 和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基 类及氨基酸类等）。
▪ 反相色谱：一般用非极性固定相（如C18、 C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、 乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶 的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非 极性和极性较弱的化合物。
▪ 离子交换色谱：固定相是离子交换树脂。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。主要 用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
▪ 改变流动相的pH值和离子强度可以改善分离。
▪ 排阻色谱法 固定相为有一定孔径的多孔 性填料。常用于分离高分子化合物，如组 织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
▪ 离子对色谱法 主要用于分析离子强度大 的酸碱物质。
▪ 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺 酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。高 氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成 很强的离子对。
检测器
▪ 检测器是HPLC仪的三大关键部件之一。 其作用是把洗脱液中组分的量转变为电信 号。根据检测原理可将其分为选择性检测 器和通用型检测器。
检测器
选择性 通用型
紫外(VWD、DAD)
荧光
电化学
示差折光 蒸发光散射 质谱
几种常用检测器的主要性能
UV
荧光 电化学 质谱 蒸发光
信号 流速影响 温度影响 检测限
❖ 由一台输液泵通过比例阀和在线脱气机完成的梯 度洗脱方法称为低压梯度洗脱。特点：需要配备 在线脱气机，易发生时间滞后效应。
▪ 现在的HPLC输液泵多用柱塞往复泵，它的 液缸容积可小至0.1ml，易于清洗和更换流 动相，特别适合于梯度洗脱，而且由于改变 电机转速就能方便地调节流量，所以流量不 受柱阻影响，输液泵压力可达400kg/cm2。 其主要缺点是输出的脉冲性较大，双泵系统 较好地克服了输出脉冲性较大的缺点。
样品池要常清洗
柱温箱
▪ HPLC分析一般在室温条件下进行,但适当 提高柱温能降低流动相黏度和柱前压，有 利于改善传质和提高分析速度，有利于提 高保留时间的重现性。
高效液相色谱分类方法与特点
HPLC 分类
▪ 根据固定相可以分为：液-固色谱、液-液色 谱及键合相色谱；
▪ 根据分离原理可以分为：吸附色谱、分配色 谱、离子交换色谱、离子对色谱、排阻色谱 等。
HPLC法的分离原理
▪ 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定 相时，与固定相(stationary phase)发生吸附、 分配、离子交换、排阻等作用，由于不同组分理 化性质不同，与固定相发生作用的大小、强弱不 同，导致在固定相中滞留时间不同，从而先后流 出色谱柱。
高效液相色谱仪的结构流程
主要内容
一、高效液相色源自文库法简介 二、高效液相色谱系统 三、高效液相色谱法分类 四、HPLC 使用注意事项
高效液相法色谱简介
高效液相色谱法的发展
▪ 高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)起始于 60年代后期，是在经典液相色谱法的基础 上引入了气相色谱理论而迅速发展起来的 一种分离分析方法。
色谱柱
高
检
压
测
泵
器
进 样 器
色谱 工作站
高效液相谱系统
输液泵
▪ 输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。输液 泵应具备如下性能：①流量稳定，其RSD应＜ 0.5%；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出压力高，一般应能达到 150~300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好， 耐腐蚀。