转基因拟南芥中外源基因的Southernblot检测_芦春斌
转基因拟南芥中外源基因的Southernblot检测_芦春斌
研究报告 芦春斌 :转基因拟南芥中外源基因的 Sou thern blo t检测
1. 2. 2 PCR引物 猪 α-乳清蛋白基因的引物序列参照文献 [ 9] 。
1. 2. 3 质粒 DNA 参照文献 [ 8]提取质粒 DNA, 测定浓度并计算纯
度后 , 为 PCR扩增模板 。 1. 2. 4 基因片段的 PCR扩增和 probe制备
转基因植物技术可以定向改造生物性状 , 其应用 打破了传统育种方式只能利用亲缘关系相近物种间的 基因来改造生物的局限 , 因此转基因技术可以以前所 未有的速度和能力 , 在短时间内实现改良动 、植物品种 的产量 、质量 [ 1 - 4] 。
获得具有优良性状的转基因作物新品种 , 首先必 须确保外源 目的基因以 预期设计 的方式高 效表 达 [ 5, 6] 。然而许多情况下 转基因的表达不可预测 , 也
植物 转 化 双 元 载 体 pCG-CB-L act 为 前 期 实 验 构建 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 基因组 DNA 提取
取 100 mg样品 (叶片或种子 )放在研钵中 , 加液氮 研磨成粉末 , 采用改进的 CTAB 法提取转基因烟草的 基因组 DNA [ 7] , F lurescent 定 量剂 盒 (B io-R ad 产 品 , 170-2480)对 DNA定量 。
《种子》2007年1～12期总目次
镉处理对绿豆种子萌发及蛋 白质含量 的影响
… … … … … … … … … … … … … … …
卢
… …
莉
薛
赵一鹏
香
蔡祖 国 等 （ — ５ ３ ３）
茹萍萍（ ３ ） ３— ８ 刘崇欣 （ ４ ） ３— ０
柳枝浸提液对小麦籽粒发芽的抑制作 用研究
… … … … … … … … … … … … …
郑有 良 等 （ ６ ４— ）
２ ４Ｄ包膜处理对黄瓜种子发芽、 ， 幼苗生长和生理特性 的影响
… … … … … … … … … … … … …
小麦秸杆浸提物 的化感作用研究
… … … … … … … … … … … … … … …
杨文清
张
转基 因拟南芥 中外源基 因的 Ｓｕｈｒ ｌｔ ｏｔｅｎｂｏ检测 ……… 芦春斌 （ ２—１ ） ４
王 国鼎
文晓鹏
季祥彪 王
等（ — ４ ３ ２） 倩（ － ７ ３ ２）
胡志辉
陈禅友
雷
刚（ —１） １ ８
等（ —２ ） １ ２
大葱种 子人工老化与膜脂过氧化的研究 李 颜
酸性 Ｐ Ｇ Ａ Ｅ鉴定杂交水稻品种纯 度的研究
… … … … … … … … … … … … … … …
壳聚糖 对黄瓜种子萌发及 幼苗抗冷性 的效应
苦瓜 Ｉ Ｒ Ｃ Ｓ ．Ｒ反应体 系的建立 Ｓ
… … … … … … … … … … … … …
王 绪
１ 种兰属植物 Ｄ Ａ的提取及 Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ实验体系的建立与优化 １ Ｎ Ａ Ｄ－Ｃ
… … … … … … … … … … … … …
转基因拟南芥培养ppt课件
GFP报告基因
发现：
绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）
水母中发现发光蛋白（20世纪60年代）
GFP报告基因
性质： 238氨基酸组成的单链多肽 在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光
有什么用呢?
蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观 察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位）
PstI StuI
MAP65-1
tubulin
转染成功?
35SprombaI
如何判定载体转化成功，植株内是否有目 的基因的表达？
——载体及植株的筛选
生 长 一 个 月 左 右 的
转 基 因 植 株
GFP
体式荧光显微镜观察GFP转基因植株
生 长 两 个 月 左 右 的
转 基 因 植 株
GFP
Confocal荧光显微镜观察GFP-tubulin 在气孔保卫细胞中的定位
材料与试剂
材料：GFP转基因拟南芥种子及幼苗
试剂：MS培养基(wild type) ；
MS卡那抗性培养基(GFP-MAP65)； 75％乙醇； 10％NaClO；
无菌水。
种子消毒及播种实验流程
种子春化（ 加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）； 75％乙醇润洗一遍，再用75％酒精消毒1min
（混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 10％NaClO润洗一遍，再用10％NaClO消毒
10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 无菌水洗五遍，用牙签将种子点在培养基表
面（每皿4-5颗种子 尽量均匀）； 封膜，做好标记，平放于培养架上培养。
目的基因
目的基因tubulin 拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞中微管骨
拟南芥突变体的功能鉴定及应用
拟南芥突变体的功能鉴定及应用拟南芥是一种模式植物，因其具有小型、短周期、基因底子丰富等特点，成为了植物学和遗传学领域的研究工具。
通过突变体的筛选，拟南芥成为了研究植物生长发育和基因功能的重要模式植物之一。
在拟南芥突变体筛选中，以T-DNA插入技术为主，通过敲定不同基因，以观察植物的生长发育状态，挖掘新的生物学机制。
拟南芥突变体是利用突变体筛选技术，自然形成的或通过基因操作人工获得，产生了某些特殊表型的植物。
以T-DNA插入技术为例，将T-DNA随机插入到植物基因组中，导致部分基因的功能紊乱，从而产生了特殊的表型表现。
因此，拟南芥突变体不仅具有丰富的基因型资源，也是研究基因功能、分子生物学和植物生长发育的重要材料，其发现和应用有直接联系。
因此，如何鉴定拟南芥突变体的功能尤为重要。
目前鉴定方法主要包括：表型分析、基因克隆、启动子分析、蛋白质相互作用网络分析、分子标记等技术手段。
表型分析是首先考虑的鉴定方法，通过比较突变体与野生型在不同生长条件下的表型差异，筛选出表现异常的突变体。
对鉴定有难度的突变体，使用其他鉴定方法，如基因克隆，会有更好的效果。
其中，启动子元素克隆有助于探究基因表达特异性。
蛋白质相互作用网络分析有用于探究基因调控网络方式。
分子标记在表型特征不明显时，如果phentoype特征无法激活突变体，可以发现突变原因及搜索对应的遗传切口。
同时，拟南芥突变体在研究中的应用也非常广泛。
例如：研究花器官发育中的关键基因，通过拟南芥突变体突变鉴定方法，筛选出相关基因，进而探究开花的分子机制。
利用拟南芥突变体进行耐盐性、耐旱性等方面的研究。
在探究植物防御基因的调节网络时，拟南芥突变体也广泛地使用。
此外，还可用作药物和环境污染物筛选的生物传感材料，如zinc、生物染色体修复等方面的研究。
拟南芥突变体是全面了解植物生物学机理的重要材料，是揭示生长发育和基因功能的主要途径之一。
随着逆境应对、营养吸收、发育调控等方向的研究的深入，对拟南芥突变体的催生和应用必将愈加广泛。
鉴定转基因是否成功的方法
鉴定转基因是否成功的方法
转基因是一种重要的遗传工程技术，可以将外源基因导入到生物体内，从而改变其性状和功能。
但是，如何鉴定转基因是否成功呢？下面介绍几种方法。
1. PCR扩增法。
PCR是一种可以扩增DNA序列的技术，可以通过PCR扩增转基因序列和内部参考序列，然后对扩增产物进行电泳，观察是否存在目标大小的DNA条带，从而证明是否成功转基因。
2. Southern blotting。
Southern blotting是一种检测DNA序列的方法，可以将DNA片段转移到膜上，然后使用探针特异性检测转基因序列的存在。
3. Northern blotting。
与Southern blotting类似，但是是用来检测RNA序列的方法，可以检测目标RNA是否被表达。
4. Western blotting。
Western blotting是一种检测蛋白质的方法，可以检测目标蛋白质是否被表达。
5. 生理表型。
转基因生物的表型通常会发生明显的变化，如植物的生长速度、耐旱能力、抗病性等。
通过观察生理表型的变化，也可以鉴定转基因是否成功。
综上所述，以上方法可以用来鉴定转基因是否成功，研究人员可以根据需要选择合适的方法。
- 1 -。
Southern杂交技术在农作物遗传转化研究中的应用
Southern杂交技术在农作物遗传转化研究中的应用作者：代军来源：《安徽农业科学》2015年第01期摘要Southern杂交技术作为分子生物学中的经典技术，为特定DNA片段的检测提供了快速、准确、灵敏的方法。
在植物遗传转化研究中，Southern杂交技术广泛应用于外源基因的检测及拷贝数的鉴定工作，为植物转基因研究的准确性提供了充分的保障。
综述了Southern杂交技术在水稻、玉米、小麦、大豆等主要农作物遗传转化研究中的应用，可为农作物转基因研究方法的明确及转基因食品安全检测方法的探索提供参考。
关键词Southern杂交;农作物;遗传转化;外源基因检测中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）01-020-04Application of Southern Blot in the Genetic Transformation of CropsDAI Jun（Liaoning National Normal College， Fuxin， Liaoning 123000）AbstractAs one of classical techniques of molecular biology， Southern blot provides a fast，accurate and sensitive method for the detection of specific DNA fragments. In the research of genetic transformation in plants， Southern blot is widely used in the detection of genetic transformation and identification of gene copy number. It provides adequate safeguards for the accuracy of transgenic research. This paper summarizes the application of Southern blot in the staple crops， such as rice，maize， wheat， soybean， etc.， which provides references for the definitude of the ways for studying genetic transformation， as well as the explore of the ways for detecting genetically modified food safety.Key wordsSouthern blot; Crops; Genetic transformation; Detecting exogenous gene基金项目国家林业公益性行业专项资助项目（200904064）。
鉴定转基因是否成功的方法
鉴定转基因是否成功的方法随着生物技术的发展，转基因技术逐渐成为一种有效的方法，应用在农业、医药、生物制药等领域。
转基因技术通过人工改变生物基因，进而创造出新品种或个体。
在转基因工程中，鉴定转基因是否成功是极其重要的。
本文将从多种角度介绍鉴定转基因是否成功的方法。
一、利用PCR技术确认转基因是否成功PCR反应是鉴定转基因是否成功最为简便和经济的方法之一，这种技术是利用酶切扩增DNA的特点，在反应中对改造的基因进行检测，在特定的条件下扩增目的基因片段，并与未转基因进行比较。
如果扩增所得的基因片段与转基因所期望的片段大小一致，说明转基因已经成功。
二、Southern blotting 鉴定转基因Southern blotting是一种DNA测定技术，通过将RNA 转换为DNA并进行胶体电泳将目标DNA片段从细胞中分离并检测目标片段。
Southern blotting 可以检测到基因定位，基因拷贝和突变，改变DNA构型和次级结构。
Southern blotting的结果可以表明：在细胞内是否存在谷氨酸脱羧酶基因等转基因相关的基因组位置。
三、利用生物学筛选法进行鉴定利用生物学筛选法可以鉴定出转基因是否成功，它们往往是通过化学诱变法，以及处理基因的特殊性质，来筛选目标基因。
例如可以利用抗草甘膦，病毒耐受性，抗虫淀粉酶等性质来鉴定。
只要观察到相应的特性，就可以证明此转基因已经成功。
四、荧光成像鉴定转基因Fluorescent Proteins如GFP和RFP等，诞生于最近十几年之间。
通过构筑转基因生物，来融入荧光基因，从而使生物体内部发亮。
并且，荧光标记的转基因生物能使生物学家们观察到某些细胞活动的细微变化以及动物生命体系资源的流入流出等现象。
五、PCR约束消化鉴定转基因PCR约束消化也被广泛用于检测转基因。
将PCR扩增的产物，用细菌中相应的酶切割，然后进行胶溶电泳，这么做可从大小上直观鉴定出目的基因片段是否已被插入基因位点，以及是否是单一拷贝。
Southern杂交技术在农作物遗传转化研究中的应用
2、DNA digestion：将基因组DNA进行限制性内切酶消化，得到特定长度的 DNA片段。
3、凝胶电泳：将消化后的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳分离，将不同大小的 DNA片段分离出来。
4、Southern转移：将凝胶中的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上，以便进行进 一步的杂交操作。
5、探针标记：将特异性探针进行放射性标记，以便在杂交过程中进行信号 的放大和检测。
参考内容二
一、引言
Southern印迹杂交是一种常用的分子生物学技术，用于分析特定DNA序列在 基因组中的存在和分布。这项技术的改良版本，既保留了原始方法的准确性，又 极大地提高了效率和易用性，对于各类科研和临床应用具有重要的实际价值。
二、方法描述
在改良的Southern印迹杂交方法中，我们采用了更高效的DNA提取和纯化步 骤，以及创新的凝胶电泳和转移步骤。这使得我们能更好地保留和检测到DNA的 特异性序列。
三、详细介绍
1、印迹剂的选择
在Southern印迹杂交过程中，需要选择合适的印迹剂。常用的印迹剂包括尼 龙膜、滤纸、PVDF膜等。选择合适的印迹剂非常重要，因为它直接影响到DNA的 转移效果和杂交效率。
2、杂交条件的设定
杂交条件的设定对于Southern印迹杂交技术的结果至关重要。这些条件包括 杂交温度、盐浓度、缓冲液类型等。这些参数需要根据实验目的和具体实验条件 进行调整，以获得最佳的杂交效果。
6、杂交反应：将标记好的探针与硝酸纤维素膜上的DNA片段进行杂交反应， 使得特异性序列能够结合在一起。
7、洗膜和显影：洗去未结合的探针，并通过放射性自显影技术显现出杂交 信号，从而确定目标基因的位置和拷贝数。
参考内容
基本内容
Southern印迹杂交技术是一种在基因组学和分子生物学中广泛应用的印迹技 术，主要用于检测和识别特定DNA序列。本次演示将详细介绍Southern印迹杂交 技术的原理、实现过程、优点、不足以及其他相关印迹技术，最后对Southern印 迹杂交技术的优劣和应用前景进行全面评价。
拟南芥AtTR1相互作用蛋白质筛选和鉴定
拟南芥AtTR1相互作用蛋白质筛选和鉴定朱旭辉;黄奎;姚润东;彭露;裴林森;刘志斌;王健美【摘要】本研究利用酵母双杂交系统筛选与E3连接酶A t T R1存在相互作用的靶蛋白.首先,根据AtTR1所含有的结构域,我们对其进行了不同程度的截断以及点突变处理,以验证其各个片段的自激活活性和毒性.最终我们选取A t T R1-△119为诱饵蛋白对拟南芥归一化通用型cDN A文库进行筛选.结果初步获得了13个与其有潜在互作的候选蛋白.经酵母正向和反向多次验证发现转化了AtTR1与CURT1C 和AtTR1与SWEET5的酵母在三缺和四缺培养基中均正常生长,而且在含有X-α-gal的培养基中出现蓝斑.双分子荧光互补技术也证明AtTR1与CURT1C或SWEET5之间也有相互作用.%In this study,yeast two-hybrid system was used to screen the target protein that interacts with AtTR1,an E3 ligase.First of all,according to the domains of AtTR1,we truncated and mutated it to some extent and verified their self-activation activity and toxicity.Finally,we selected AtTR1-△119 as the bait protein to screen Arabidopsis thaliana Normalized universal cDNA library.As a result, 13 candidate proteins with potential interactions were obtained.Multiple validation with forward and re-verse two-hybrid system revealed that diploid yeast containingAtTR1&CURT1C or AtTR1 &SWEET5 grew on SD/-T rp/-Leu/-His and SD/-T rp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal minimal media and generated blue-colored product.BiFC technique also demonstrated that AtTR1 interacts with CURT1C or SWEET5. All this will lay a foundation for better understanding of its functions and molecular mechanism.【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(055)002【总页数】6页(P419-424)【关键词】拟南芥;E3连接酶AtTR1;酵母双杂交;类囊体膜曲率相关蛋白1C;蔗糖转运蛋白5【作者】朱旭辉;黄奎;姚润东;彭露;裴林森;刘志斌;王健美【作者单位】四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065【正文语种】中文【中图分类】Q9451 引言本实验室之前从油菜中克隆到一个参与热胁迫应答并可提高植物热耐受性的基因，简写为BnTR1(Thermal Resistance 1)[1]，在后续研究中发现其定位于细胞膜且在体外具有E3泛素连接酶活性[2].在油菜中，BnTR1的过表达株系对热、盐、双氧水和甘露醇模拟干旱等逆境胁迫表现出很强的抗性[2]，另外该株系还表现出一定的铀耐受性[3].在烟草中，BnTR1的转基因株系也表现出对盐和干旱的抗性[4].同样的，BnTR1的转基因的水稻不仅表现出对热的耐受性提高，而且产量也得到了提高[5].研究证明拟南芥的AtTR1与钙离子信号通路高度关联，并且可对多个钙依赖性蛋白激酶进行泛素化修饰，另外该基因的表达受盐诱导[5].本研究的对象为AtTR1，其与BnTR1的核苷酸序列相似性高达86%，且氨基酸序列中都含有一个C4HC3型的RING结构域.将AtTR1基因转入大肠杆菌之后，可以提高微生物的耐热性，这一功能与BnTR1相同.近年来，温室效应导致全球气温上升，植物的生长受到严重的影响，农作物的生产面临高温逆境的严重挑战.鉴于TR1所具有的耐热性，因此其在应用前景上非常的广阔.可不论是BnTR1还是AtTR1，二者既不属于热激蛋白也不是热激转录因子，而是单因子耐热，因此在体内找到与AtTR1互作的蛋白，推断其参与的信号途径就显得格外重要.我们选用了Clontech的MatchMaker系列酵母双杂交系统，以拟南芥为模型，筛选拟南芥cDNA文库中与AtTR1互作的蛋白，希望能为植物抗逆机制的研究提供新的线索.2 材料与方法2.1材料与试剂克隆菌株DH5α和用于烟草瞬时转化根癌农杆菌GV3101及相应的双分子载体pSAT1-nEYFP-N1和 pSAT1-cEYFP-N1均为本实验室留存；拟南芥cDNA文库和酵母双杂交系统试剂盒购买自Clontech公司.Taq DNA polymerase、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购买于TaKaRa公司；同源重组试剂盒CloneEZ；离心柱型DNA纯化回收试剂盒购买自天根生化科技(北京)有限公司；AureobasidinA(AbA)和X-α-gal及所有的酵母培养基购自Clontech公司.其余无机试剂均为分析纯产品.2.2 实验方法2.2.1 酵母双杂交(Y2H)及自激活验证将目的基因克隆到BD(pGBKT7)载体上后，转化酵母AH109菌株，涂布于缺色氨酸(SD/-Trp)的酵母固体培养基上，30℃培养3d.待酵母长出后，挑取酵母单克隆于缺色氨酸的酵母液体培养基(SD/-Trp)中，30℃，220r/min，振荡培养12～16h.用移液器量取5μl培养物滴在缺色氨酸缺组氨酸缺腺嘌呤(SD/-Trp/-His/-Ade)的三缺固体培养基上进行自激活检验，培养3d后如果没有长出菌落，说明该蛋白没有自激活活性.将已克隆的含有目的片段的AD(pGADT7)转化入上述已含有BD的菌株中，涂布于缺色氨酸缺亮氨酸(SD/-Trp/-Leu)两缺固体培养基上，30℃培养3d待酵母长出后，挑取单菌落于SD/-Trp/-Leu两缺液体培养基中，30℃，220r/min，振荡培养12h后，用移液器移取5μL分别滴在SD/-Trp/-Leu两缺、SD/-Trp/-Leu/-His三缺和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal四缺固体培养基上培养3d后，照相记录.bait 载体为pGBKT7，prey 载体为pGADT7.2.2.2 拟南芥酵母文库筛选的方法挑选2-3mm大小的诱饵酵母单斑(BD- TR1-△119)接种于50mL SD/-Trp液体培养基中，30℃，250～270 r/min过夜培养16～20h，直到OD600达到0.8，4℃，然后1000×g离心5 min，弃上清；接着用4～5mL SD/-Trp液体培养基重悬酵母细胞.室温融化1mL酵母文库和上一步所得诱饵酵母菌混合在2 L的锥形瓶中，加入45mL 2×YPDA(含50μg/mL Kana)液体培养基，并用1mL 2×YPDA清洗酵母文库的EP管，重复一次，将液体加入到锥形瓶，30℃，30～50r/min培养20～24h.20h后，吸取一滴培养液在显微镜40×条件下观察，如能观察结合子就继续下一步，如果观察不到结合子则继续培养4h.收集细胞，4℃，1000×g离心10 min，弃上清；与此同时，用50mL 0.5×YPDA(含50μg/mL Kana)液体培养基清洗2L锥形瓶2次将瓶壁上的细胞洗净并用清洗液重悬，再次收集细胞，4℃，1000×g离心10 min.用10mL 0.5×YPDA(含50μg/mL Kana)液体培养基重悬细胞.将重悬液涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade平板(约60个，每个平板涂布150μL)，30℃，培养5～7d.2.2.3 酵母菌落PCR方法挑选2～3mm大小的酵母菌斑于含20μL 0.02% SDS的1.5mL离心管中，涡旋30s，加入180μL ddH2O 吹打混匀，12000r/min，瞬时离心15s，吸取上清液2μL作为PCR模板(20μL体系).2.2.4 双分子荧光互补(BiFC) 将需要转化的质粒转入农杆菌GV3101，然后振荡培养至OD600= 1.0～1.2，3000 r/min离心30 min收集菌体，用LM缓冲液(10 mM氯化镁，10 mM MES，200 μM乙酰丁香酮)重悬至OD600=0.4～0.6，p19的OD600= 0.8～1.0，用注射器对4周大烟草叶片的下表皮进行注射，使菌液充满整个叶片，黑暗放置过夜后正常培养3d后用激光共聚焦显微镜观察.3 研究结果3.1 AtTR1的生物信息学分析及诱饵蛋白的自激活性检测通过SMART (Simple modular architecture research tool)网站和在线预测软件TMHMM对AtTR1蛋白的保守结构域进行了分析[6,7]，结果表明在AtTR1蛋白的N端含有一个C4HC3型RING结构域，C端有两个跨膜结构域，一个在220～240 之间，另一个在180～200 之间(图1 A).图1A所示的TR1-△119表示把TR1截短到第119位氨基酸处；TR1-△181表示把TR1截短到第181位氨基酸处；TR1-△181(PM)表示把TR1截短到第181位氨基酸处并把第98位的半胱氨酸图变成丙氨酸；TR1-△181(DM)表示把TR1截短到第181位氨基酸处并把第98位的半胱氨酸突变成丙氨酸，第95位的组氨酸突变成酪氨酸；TR1-FL 表示TR1全长；TR1-FL(PM) 表示把全长TR1的第98位的半胱氨酸突变成丙氨酸.将相应的AtTR1片段克隆到BD(pGBKT7)载体上后，在三缺的固体培养基上进行自激活检验，正对照为AD-T/BD-53，负对照为AD-T/BD-Lam.结果显示存在自激活的片段有TR1-△181、TR1-△181(PM)和TR1-△181(DM)(图1 B)；没有自激活的片段有TR1-△119、TR1-FL 和TR1-FL(PM).这可能因为截断导致AtTR1的空间结构发生变化，具有了转录激活活性.再者Clontech的MatchMaker系列酵母双杂交系统是基于酵母转录因子GAL4，所以该系统适合筛选定位在细胞质和细胞核中的蛋白，而AtTR1含有两个跨膜结构域，是一个膜定位的蛋白质，所以我们最终采用TR1-△119进行文库筛选.图1 AtTR1的自激活验证A．用于酵母双杂交筛选中的AtTR1截短片段的示意图B.AtTR1截断片段自激活验证的结果SD/-Trp表示缺色氨酸(Trp)的培养基；SD/-Leu/-His /-Ade表示缺亮氨酸(Leu)、组氨酸(His)和腺嘌呤(Ade)的培养基Fig.1Test TR1 for autoactivationA.Schematic representation of TR1 deletion con structs used in yeast two-hybrid screensB.The result of TR1 deletion constructs autoactivation SD/-Leu/-Trp stands for synthetic defined (SD) medium lacking leucine (Leu) and try ptophan (Trp)；SD/-Leu/-Trp/-His stands for synthetic defined (SD) medium lacking leucine (Leu), tryptop han (Trp) and Adenine (Ade)3.2 PCR扩增、测序及序列比对将pGBKT7-TR1-△119酵母转化菌与拟南芥cDNA文库杂交后，涂布四缺培养基(平板直径150mm)上，30℃，培养5～7d.挑取长势较好的单菌落，再次转接到含AbA的四缺培养基上验证.用Taq DNA polymerase对平板上的阳性克隆进行菌液PCR检测.图2所示的是部分酵母阳性克隆菌落PCR扩增结果，扩增出来的条带，即表示阳性克隆中prey载体的插入片段.将PCR产物送成都擎科生物科技有限公司测序分析，测序结果通过NCBI中的Genbank进行blast分析，blast结果见表1，大致将结果可分成酶、分子伴侣蛋白、转运蛋白、转录因子及后续进一步研究的CURT1C和SWEET5等.3.3 Y2H验证AtTR1与CURT1C或SWEET5的相互作用将构建好的pGADT7-TR1别于与pGBKT7-CUR1C、pGBKT7- SWEET5共转化至AH109后，涂布于二缺的固体培养基上，30 ℃培养3d，待酵母长出后，挑取单菌落在二缺液体培养基中30 ℃ 220 r/min振荡培养12 h，移取5μL分别滴在二缺、三缺和含40μg/mL X-α-gal的四缺固体培养基上，30 ℃培养3d.在二缺、三缺和四缺平板上均正常生长，且在四缺培养基中出现蓝斑(图3)，说明AtTR1与CUR1C或SWEET5存在相互作用.AD-T/BD-53为正对照，AD-T/BD-Lam为负对照.图2 PCR产物凝胶电泳检测M表示DNAmarker(DL2000);1-24是PCR产物Fig.2Gel electrophoresis of PCR product.M: DNA molecular weight marker (DL 2 000);1-24：PCR products表1 AtTR1互作蛋白基本信息总结Tab.1Summary of AtTR1 candidate interacting protein basic information基因编号名称功能注释AT4G25150AT2G37940AT3G14080AT5G28540AT1G52220AT5G61250AT1G 76440AT5G62850AT1G71960AT5G61580AT5G42020AT1G50700AT5G1513 0HADsuperfamily，subfamilyIIIBacidphosphataseATIPCS2LSM1B，SM⁃LIKE1BBIP1CURT1CATGUS1HSP20⁃likechaperonessuperfamilyproteinA TSWEET5ABCG25(ATP⁃bindingcassette，ABC)PFK4BIP2CPK33ATWRKY72酸性磷酸酶活性肌醇磷脂酰神经酰胺合成酶2小核糖核蛋白结合蛋白(BiP)是一类重要的分子伴侣参与类囊体膜的折叠糖苷水解酶像伴侣蛋白超家族蛋白HSP20蔗糖外排转运蛋白家族蛋白转运蛋白家族，是目前发现的最大的蛋白家族之一磷酸果糖激酶4结合蛋白(BiP)是一类重要的分子伴侣植物特有的一类依赖钙激活的蛋白激酶WRKY转录调控因子家族3.4 BiFC验证AtTR1与CURT1C或SWEET5的相互作用将构建好的pSAT1-nEYFP-TR1 分别与pSAT1-cEYFP-CUR1C和pSAT1-cEYFP-SWEET5共同瞬时转化烟草叶肉细胞，48h后，在515nm黄光激发光、100×物镜激光共聚焦显微镜下观察荧光(黄色)信号，同时设置pSAT1-nEYFP-MOB1与pSAT1-cEYFP-SIK1为阳性对照，pSAT1-nEYFP-TR1与pSAT1-cEYFP、pSAT1-cEYFP-CUR1C与pSAT1-nEYFP和pSAT1-cEYFP-SWEET5与pSAT1-nEYFP为阴性对照.在激光共聚焦显微镜下检测到黄色荧光信号，表明AtTR1与CURT1C或SWEET5存在相互作用，但信号强度略若于阳性对照(图4A和B)，而且可以观察到它们的相互作用是定位于细胞膜.4 讨论泛素化系统的分子识别和特异性是由E3 RING决定，细胞内许多蛋白质均可被泛素化途径识别和修饰，包括细胞表面受体、信号转导蛋白、转录因子和参与细胞分裂的蛋白等，因此泛素化途径可参与到细胞信号传导、细胞周期、应激反应、细胞分化和植物耐受非生物胁迫等的调节过程中.泛素化系统调节这些过程的普遍机制是通过26S蛋白酶体途径调节泛素化底物的水平来调节相应的细胞过程[8].AtR1含有RING锌指结构域，是一个C4HC3型锌指蛋白，在体外具有E3泛素酶活性.因此，找到AtR1的底物蛋白就变得很关键.图3 TR1与CURT1C或SWEET5酵母双杂交分析SD/-Leu/-Trp表示缺少亮氨酸(Leu)和色氨酸(Trp)的培养基.SD/-Leu/-Trp/-His表示缺少亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)和组氨酸(His)的培养基.SD /-Leu/-Trp/-His/-Ade/ X-α-gal表示缺少亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)和腺嘌呤(Ade)但是包含有X-α-gal的培养基Fig.3Y2H results show that TR1 interacts with CURT1C and SWEET5SD/-Leu/-Trp stands for synthetic defined (SD) medium lacking leucine (Leu) and try ptophan (Trp)； SD/-Leu/-Trp/-His stands for synthetic defined (SD) medium lacking leucine (Leu), tryptop han (Trp) and histidine (His); SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal stands for synthetic defined (SD) medium lacking leucine (Leu), tryptop han (Trp), histidine (His) and Adenine (Ade), but containing X-α-gal SWEET(sugars will eventually be exported transporters)是近几年通过荧光共振能量转移传感器手段新鉴定得到的一类参与葡萄糖、蔗糖，以及其他糖类运输蛋白质[9].SWEET包括7次跨膜α-螺旋，两个重复的跨膜结构域；并具有低亲和性双向运输的特点，而且对能量和pH值不产生依赖[10-12].SWEET广泛存在于真核生物中，包括单核生物、高等植物和动物等.最近研究发现，在原核生物中存在SemiSWEET蛋白，它是SWEET的同源蛋白，并且具有相似的功能[13].除了参与糖转运以外，研究还发现在冷环境胁迫下，拟南芥中AtSWEET15基因会发生上调表达；在干旱和高盐的逆境胁迫时，该基因也可以被诱导表达[14].Klemens等人发现定位于液泡膜上的AtSWEET16和AtSWEET17基因作为同系物，共同参与逆境胁迫[15].Bauer等人的研究发现，在干旱条件下，SWEET5在叶片保卫细胞中的表达量增加了2～6倍，说明SWEET5可能是直接参与糖作为渗透调节物质运输的过程，或者是作为相对湿度信号机制的一部分参与细胞壁的装载[16].图4 AtTR1与CURT1C或SWEET5双分子荧光互补分析Fig.4BiFC results showing that AtTR1 interacts with CURT1C and SWEET5高等植物及一些绿藻的叶绿体最显著的一个特征就是类囊体膜分化为基粒膜区和基质膜区.基粒是指叶绿体中紧密垛叠的类囊体部分，与基粒相连的非垛叠的膜为基质类囊体.基粒膜和基质膜互相连接形成一个连续的膜系统.植物在长期进化中形成基粒很可能有利于光合作用的进行，如光能捕获、能量转换、电子传递等，但是这些过程又都受垛叠区与非垛叠区比例的影响[17].一般认为, 基粒的重要功能之一, 是它对激发能分配的调控.Ute Armbruster等人证明CURT1(CURVATURE THYLAKOID1) A, B, C, and D通过CURT1蛋白表达量的多少控制类囊体片层边缘处的曲率以此来影响类囊体结构的建成[18].我们已证明AtTR1可以和CURT1C或SWEET5直接相互作用，而AtTR1作为一个E3泛素连接酶，又可参与泛素蛋白酶体途径-蛋白降解的一种重要途径，能选择性地降解细胞内多种具有生物活性的蛋白质.例如已有研究报道，在干旱胁迫时，植物叶片保卫细胞中SWEET5基因表达量增加.AtTR1与SWEET5存在相互作用，那么AtTR1是会通过单泛素化修饰SWEET5，还是多泛素化降解SWEET5？这些仅仅是我们的猜测，因此接下来我们将通过体外泛素化、体外降解实验和体内泛素化和体内降解实验以及curt1c和sweet5两个突变体的表型研究等，来验证这种猜想.参考文献:[1] 许发伦, 刘志斌, 杨远友, 等. (45)Ca示踪技术对转基因油菜耐热机理的研究[A]//中国核科学技术进展报告(第二卷)——中国核学会2011年学术年会论文集第4册(核材料分卷、同位素分离分卷、核化学与放射化学分卷)[C]. 2011.[2] 陈彩丽, 曹昊昊, 樊莉娟, 等. 过量表达BnTR1的油菜对多种逆境的综合抗性分析[J]. 四川大学学报：自然科学版, 2017, 54: 215.[3] Zha Z, Wang D, Hong W, et al. Influence of Europium speciation on its accumulation in Brassicanapus and over-expressing BnTR1 lines[J]. J Radioanal Nucl Chem, 2014, 301: 257.[4] 曹昊昊, 王中浩, 范智勇, 等. 转BnTR1基因的烟草对多种逆境胁迫的抗性研究[J]. 四川大学学报: 自然科学版, 2016, 53: 453.[5] 樊莉娟, 陈彩丽, 朱旭辉, 等. 拟南芥AtTR1对AtCPK28和AtCPK32的体外泛素化修饰研究[J]. 四川大学学报: 自然科学版, 2017, 54: 617.[6] Bork P, Schultz R, Milpetz F, et al. SMART, a simple modular architect ure research tool: identification of signaling domains[J]. P Natl Acad Sci, 19 98, 95: 5857.[7] Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART: recent updates, new development s and status in 2015[J]. Nucleic Acids Res, 2015, 43: D257.[8] Borden K L. RING domains: master builders of molecular scaffolds[J]. J Mol Biol, 2000, 295(5): 1103.[9] Lq C, Bh H, S L, et al. Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens. Nature[J]. Nature, 2010, 468: 527.[10] 刘畅, 姜晶, 韩晓雪, 等. 植物中SWEET基因家族研究进展[J]. 植物生理学报, 2014, 50: 1367.[11] 玄元虎, 朱毅勇, 胡一兵. SWEET蛋白家族研究进展[J]. 中国科学: 生命科学, 2014, 44: 676.[12] 何佳, 黄学勇, 关跃峰, 等. 拟南芥MtN3/saliva基因家族分析[J]. 上海师范大学学报: 自然科学版, 2010, 39: 290.[13]Xuan Y H, Hu Y B, Chen L Q, et al. Functional role of oligomerization for ba cterial and plant SWEET sugar transporter family[J]. P Natl Acad Sci, 2013, 1 10: 3685.[14]He F, Kang J Q, Zhou X, et al. Variation at the transcriptional level among Chinese natural populations of Arabidopsis thaliana in response to cold stre ss[J]. Science Bulletin, 2008, 53: 2989.[15]Klemens P A, Patzke K, Deitmer J, et al. Overexpression of the vacuolar sug ar carrier AtSWEET16 modifies germination, growth, and stress tolerance in Arabidopsis[J]. Plant Physiol, 2013, 163(3): 1338.[16]Bauer H, Ache P, Wohlfart F, et al. How do stomata sense reductions in atm ospheric relative humidity [J]. Mol Plant, 2013, 6: 1703.[17] 陈晓英, 姜闯道, 邹琦, 等. 类囊体的空间结构及其对激发能分配的调控[J]. 植物生理学报, 2002, 38: 307.[18]Armbruster U, Labs M, Pribil M, et al. Arabidopsis CURVATURE THYLAKOID 1 proteins modify thylakoid architecture by inducing membrane curvature[ J]. Plant Cell, 2013, 25: 2661.。
植物 miR164 家族研究进展
85
Hale Waihona Puke 为 NAM（No Apical Meristem, 无顶端分生组织），次年 Aida 等[17]在拟南芥中又发现另外 3 个成员，命名为 CUC2（Cup-shaped cotyledon, 杯状子叶）、ATAF1 和 ATAF2，随后在多 种植物中发现大量的结构类似的转录调控因子。 Aida 等[17]将这类转录因子归集为一个家 族，取最先发现的三个成员的首字母组合为家族名称 NAC （矮牵牛 NAM 和拟南芥 ATAF1&2、CUC2）。
50
植物 miRNA 具有以下典型的生物学特征：1）一般来源于基因间隔区；2）作用位点通 常位于靶 mRNA 序列的侧翼区域；3）成熟 miRNA 的长度为 20~24 nt，其 5'端为磷酸基团， 3'端为羟基；4）成熟序列在不同物种间具有高度的进化保守性；5）表达具有严格的时序和 组织特异性，且受环境胁迫影响[1,4]。
90
NAC 家族的共同特征是 N 端为 150 个氨基酸序列高度保守的结构域，能特异性地结合 目标 DNA 和其它蛋白。该结构域可分为 5 个亚结构域（A、B、C、D 和 E），其中 A、C 和 D 相对保守，另 2 个亚结构域在不同成员中存在一定的差异。NAC 基因的 C 端为富含丝 氨酸、苏氨酸、脯氨酸和谷氨酸等氨基酸残基的转录激活区，具有丰富的序列多样性[18]。 Rushton 等[19]通过对烟草、拟南芥、水稻、白杨树、茄科植物中 450 个 NAC 基因的进化关
2 miR164 家族成员序列特征
55 Reinhart 等[5]通过 Northern 检测和克隆测序，首先在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中 发现了 2 个 miRNA，即 ath-miR164a 和 ath-miR164b，并在水稻（Oryza sativa）基因组数据 库中检测到 2 个同源的 miRNA 序列（osa-miR164a 和 osa-miR164b）。此后，人们通过克隆 测序[6,7]、 Northern 检测[8]、 深度测序[9,10]、 同源比对[11]、 高通量测序[12,13]等技术方法， 陆续在多种植物中发现了众多序列相同或相近的成熟 miRNA，它们构成 miR164 家族。在 60 英 国 曼 彻 斯 特 大 学 生 命 科 学 院 2012 年 8 月 发 布 的 miRBase 19.0 版 数 据 库 中 （）进行检索，可发现 miR164 家族共 91 个 miRNA 成员，它们来自 拟南芥、水稻、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、烟草（Nicotiana tabacum）、 胡杨（Populus trichocarpa）等 26 个物种。这些 miRNA 由不同的物种或同一物种不同的基 因位点产生，其前体序列各不相同，但成熟序列完全相同或非常相近。目前尚未在动物中发 65 现 miR164 家族成员，似可认为这是植物特有的 miRNA 类群。 在已报道的 91 个成员中，有 58 个成员（包括 ath-miR164a 和 ath-miR164b 在内）的成 熟序列完全相同，均为 5'-uggagaagcagggcacgugca-3'（21 nt），7 个成员（osa-miR164d、 sbi-miR164b、zma-miR164f、bdi-miR164、cme-miR164a、cme-miR164b 和 nta-miR164c）的 3'末端为 u， 5 个成员 （ath-miR164c、 aly-miR164c、 bna-miR164b、 bna-miR164c 和 bna-miR164d） 70 的 3'末端为 g， 3 个成员(gma-miR164b、 gma-miR164c 和 gma-miR164d)的 3'末端缺失 1 个 a， 长为 20 nt；2 个成员(osa-miR164c 和 cca-miR164)的第 14 位核苷酸为 u；与 ath-miR164a 相 比，2 个成员存在 1 个核苷酸差异，12 个成员存在 2 个核苷酸差异，4 个成员存在 3 个核苷 酸差异，1 个成员存在 5 个核苷酸差异。这些差异核苷酸均位于第 2~8 位种子序列之后。在 一些植物中，某些 miR164 前体的另一条臂也被加工产生成熟 miRNA，这种情况下，分别 75 用-5p 和-3p 标示 miRNA 成熟序列是来源于前体的 5'端还是 3'端，如 zma-miR164a-5p 和 zma-miR164a-3p、zma-miR164b-5p 和 zma-miR164b-3p 等。由 3'端生成的 miRNA 序列与一 般的 miR164 完全不同，它们不属于 miR164 家族（以前人们将这类 miRNA 用星号标识， 如 zma-miR164a*、zma-miR164b*等）。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA 转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
地高辛标记探针Southern印迹杂交技术要点及改进
利 用 地 高 辛 标 记 探 针 进 行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂 交 时 ， 最 常 见 的 问 题 是 高 背 景 ［８］， 以 下 ２ 种 措 施 可 降 低 背 景 （ １） 适 当 延 长 梯 度 洗 膜 的 时 间 和 提 高 洗 膜 温 度 ［９］； （ ２） 控 制 地 高 辛 抗 体 的 浓 度 。Ｓｏｌａｎａｓ［３］认 为 使 用 足 够 量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号， 但过量 的 地 高 辛 抗 体 会 在 膜 上 产 生 非 特 异 结 合 斑 点［１０］。一 些 杂 交 试 剂 盒 说 明 书 提 到 ＥＢ 对 背 景 有 一 定 的 影 响， 但是 Ｓｏｌａｎａｓ［３］认为 ＥＢ 对背景的影响不大， Ｓｏｌａｎａｓ 亦 采 用 不 同 量 的 多 种 ＤＮＡ 上 样 缓 冲 液 ， 发 现 其 对 背景影响不大。 １．６ 杂交膜的选择与保存
杂 交 膜 有 ３ 种 ： 尼 龙 膜 、硝 酸 纤 维 素 膜 和 ＰＶＤＦ 膜。尼龙膜是一种较为理想的核酸固相支持物， 有 多 种 类 型 ， 其 结 合 能 力 、温 度 适 应 性 、韧 性 比 硝 酸 纤
·技 术 与 方 法·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
转基因植物(农产品)中转基因成分的PCR检测
转基因植物(农产品)中转基因成分的PCR检测芦春斌【摘要】转基因(植物)食品的安全性是科学界及公众普遍关心的问题.在转基因植物研究中,根据转基因植物所带有的转基因成分的DNA序列,设计引物对耐草铵膦转基因植物中转入的转基因成分进行了PCR分析,结果表明,采用PCR扩增对外源基因和遗传标记基因的分析方法灵敏、准确.【期刊名称】《种子》【年(卷),期】2006(025)001【总页数】3页(P1-3)【关键词】草铵膦耐性;转基因成分;PCR分析【作者】芦春斌【作者单位】暨南大学生殖免疫中心,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】Q94转基因植物技术是将抗除草剂基因、抗病毒基因、抗虫基因等各种优良性状基因等遗传物质片段，导入植物中使其具备新的生物性状［1～5］的技术。
目前国内外已经得到100种以上转基因植物，其中玉米、大豆和棉花等转基因作物已经在世界各地大面积种植，其推广及种植对世界和我国的农业已做出很大的贡献。
长期以来，国际上都存在着转基因植物对人体和环境安全的争论。
欧美、日本、澳大利亚、俄罗斯、新加坡等已经设立专门机构，对每一项转基因的田间试验和成果发放进行逐个的审批，以立法或其它形式要求对转基因产品加贴标签，供消费者购买时参考，或以其它方式限制转基因产品的进口。
而我国检验检疫系统由于没有对转基因产品进行检测的统一标准，许多国外转基因产品没有检测直接进入我国，严重危害我国食品安全问题，也侵犯了公众的知情权和选择权。
近年来我国的大豆进口数量逐年增加，从2000年进口大豆1 040万t激增至2003年的2 000万t，而国产大豆产量约1 600万t。
根据美国有关的数据显示，销往中国的大豆占其总销售额的三分之一以上，而70%的美国大豆是转基因大豆。
转基因大豆大量进口直接影响我国的农产品生产发展，也影响国家经济利益和食品安全。
国务院于2001年5月发布了《农业转基因生物安全管理条例》，规定了在中国境内销售列入农业转基因生物目录的农业转基因生物，应当有明显的标识。
一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法[发明专利]
![一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/8362fc458f9951e79b89680203d8ce2f00666514.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010609570.6(22)申请日 2020.06.29(71)申请人 贵州省水稻研究所地址 550006 贵州省贵阳市花溪区贵州省农科院水稻研究所(72)发明人 闫志强 王晓雪 邓茹月 朱诉讼 尹燕斌 夏忠敏 宫彦龙 王忠妮 (74)专利代理机构 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262代理人 陈丹 张奎燕(51)Int.Cl.G01N 21/64(2006.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 15/65(2006.01)A01G 7/00(2006.01)(54)发明名称一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法(57)摘要本发明公开了一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括将荧光蛋白基因和目标基因片段插入到双元载体中，随后转化农杆菌；用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。
该方法简化了筛选步骤、缩短了筛选周期、提高了筛选效率。
权利要求书1页 说明书11页序列表6页 附图11页CN 111896506 A 2020.11.06C N 111896506A1.一种筛选转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括：步骤1：将荧光蛋白基因插入到双元载体中，形成经改造的双元载体；步骤2：将目标基因片段插入到所述经改造的双元载体中；步骤3：用步骤2制备的双元载体转化农杆菌；步骤4：用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；步骤5：将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；步骤6：出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。
Dip法获得转反义磷脂酶Dγ( PLDγ)基因拟南芥植株
Dip法获得转反义磷脂酶Dγ( PLDγ)基因拟南芥植株韩红岩;崔德才;张岳民;刘天臻【期刊名称】《山东农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2003(034)001【摘要】在含反义PLDγ基因的质粒根癌农杆菌的介导下,以生长到初果期的健壮拟南芥植株为转基因材料,用Dip法进行转基因实验,对影响转化率的浸染条件进行了比较研究.适宜的转化条件是将拟南芥的整个花序浸泡于农杆菌悬浮液中(含5%蔗糖,0.04%吐温-80),每次浸染10min,间隔3天浸染一次,共浸染3次.每次浸染后将植株横放于暗箱中24h,再置于22～24℃的光照下正常生长.待种子收获后在含有卡那霉素70mg/L的选择培养基中选择转化植株.PCR 及PCR-Southern blot 分析检测,该方法的转化率每100粒种子可高达2%.【总页数】5页(P19-23)【作者】韩红岩;崔德才;张岳民;刘天臻【作者单位】山东农业大学生命科学院,山东,泰安,271018;山东农业大学生命科学院,山东,泰安,271018;山东农业大学生命科学院,山东,泰安,271018;山东农业大学生命科学院,山东,泰安,271018【正文语种】中文【中图分类】Q812【相关文献】1.利用花粉管导入法获得转反义PEP基因大豆植株 [J], 胡张华;黄锐之;刘智宏;郎春秀;陈锦清2.拟南芥AtSEC14基因反义RNA植株的获得及抗病性检测 [J], 瓮巧云;黄聪聪;赵亚婷;姜婷婷;周帆;邢继红;董金皋3.转反义PLDγ基因小麦的获得及其抗白粉病的初步鉴定 [J], 刘芳;吕维涛;崔德才;赵檀方4.转反义磷脂酶Dγ基因白三叶草的获得 [J], 赵志文;赵强;崔德才5.农杆菌介导法获得转反义磷脂酶Dγ基因大麦 [J], 吕维涛;刘芳;崔德才;赵檀方因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
拟南芥的遗传转化
XU E SHU TA N TA O学术探讨拟南芥的遗传转化河南农业职业学院刘晓丽魏楠摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。
通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。
后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
关键词：拟南芥；遗传转化；实验一、实验材料（一）试验材料转基因所需的菌株：农杆菌EHA105；转基因所需的模式植物：野生型拟南芥；转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。
（二）试验试剂本实验所需试剂主要有：Mu⁃rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）；YEB、YEP液体培养基；YEP固体培养基；抗生素氯霉素（chlorampheni⁃col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）；草铵膦（phosphinothricin，PPT）；v／v（1∶5）的次氯酸钠溶液；琼脂；蔗糖；表面活性剂silwet L－77等。
二、实验方法（一）超表达载体的构建采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM－T－目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans5α转化菌液，12，000rpm 离心1min，吸除上清；第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1（已加入RNase A和0.5％的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；第三，向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解；第四，向离心管中加入350μl溶液P5，立即快速地上下颠倒12～20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min；第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。
农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得
农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得查中萍;万丙良;殷得所;杜雪树;戚华雄【摘要】NAT3 gene coding protein with high nitrate combining ability cloned from Cylindrotheca fusiformis was transmitted into rice ' zhonghua 11' via Agrobacterium-mediated transformation. 456 regenerated rice plants with resistance were obtained by screening on the culture medium with 30 mg/L basta. 313 positive transgenetic plants were gained by PCR amplification analysis targeting at NA T3 gene. It was confirmed that NA T3 gene had been integrated into the genome of ' zhonghua 11'.%将从深海硅藻中克隆的与氮具有高度亲和性的硝酸盐转运蛋白基因NAT3通过农杆菌介导的遗传转化方法,转入水稻品种中花11,在含30 mg/L Basta的选择培养基上筛选,获得456棵抗性植株,对NAT3目标基因检测,获得313棵阳性植株,初步证明目标基因已整合到中花11基因组中.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2011(050)024【总页数】3页(P5247-5249)【关键词】转基因水稻;硝酸盐转运蛋白;氮高效利用【作者】查中萍;万丙良;殷得所;杜雪树;戚华雄【作者单位】湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064;湖北省农业科学院粮食作物研究所,武汉 430064【正文语种】中文【中图分类】S511;Q78植物的生长需要合适的氮量，氮是限制植物生长的重要因素［1］。
在ipt-GUS转基因拟南芥中双组分信号传导基因应答体内细胞分裂素的增加
在ipt-GUS转基因拟南芥中双组分信号传导基因应答体内细胞分裂素的增加郭建春;胡新文;段瑞军;符少萍【期刊名称】《植物生理与分子生物学学报》【年(卷),期】2005(31)6【摘要】ipt-GUS转录融合基因在拟南芥植物中表达,其体内细胞分裂素的含量可达到野生型的20～30倍.从拟南芥种子萌发后的6、12、20和30 d四个时间分析了植物体内细胞分裂素含量的提高对其双组分信号传导系统中基因的影响.研究发现:细胞分裂素受体基因CREl比CKll基因更容易被增加的植物细胞分裂素诱导表达.拟南芥植物细胞分裂素反应调节基因ARR4和ARR5在植物发育的不同时期应答植物体内增加的植物细胞分裂素,ARR4的应答反应比ARR5早,种子萌发后的第6天幼苗真叶形成初期,ARR4基因被明显诱导;而ARR5的应答反应在幼苗真叶形成后的几个时间段均能检测到,并且在种子萌发后的第20天,花枝形成开始时特别明显.在双组分信号传导途径中,从受体到反应调节基因传导磷酸基团的传导基因AHP4在幼苗发育的后期种子萌发后的第20和30天,应答植物体内增加的植物细胞分裂素,并且在花枝形成初期比较明显.%The ipt-GUS activated transgenic Arabidopsis had 20-25 fold higher cytokinin contents than the wild type. Changes in cytokinin content in vivo triggering gene expressions involved in signal pathway of two-component system have been analyzed on the day of 6 d, 12 d, 20 d and 30 d after seed cultivation on MS medium in light conditions. The results showed that the two cytokinin receptors; His-kinase CRE1 was more sensitive to the increased cytokinin contents thanCKI1. Arabidopsis response regulators,ARR4 and ARR5, were induced by the increased cytokinin contents at different time after seed germination. ARR4 responded to cytokinins at early time of seed germination, especially on the 6 d when seedlings were around true leaf initiation, while cytokinins induced ARR5 activation after 6 d of seed cultivation in light conditions, an obvious increase was on the 20 d when seedlings were around inflorescent shoot initiation. Hpt-type transmitter kinase AHP4 increased its activation by cytokinin induction only between the 20 d and 30 d after seed cultivation in light conditions, and an obvious increase was on the 20 d.【总页数】8页(P599-606)【作者】郭建春;胡新文;段瑞军;符少萍【作者单位】中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室,海口,5711012;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口,571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口,571101【正文语种】中文【中图分类】Q74【相关文献】1.转基因拟南芥研究能提高作物生长速度有望增加油料作物和生物燃料产量 [J], 中国科技网-科技日报2.拟南芥5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS)的定点突变及抗草甘膦转基因拟南芥获得 [J], 陈荣荣;曹高燚;刘允军3.拟南芥COI1基因在茉莉素信号传导中的作用 [J], 陈艳; 任春梅4.细胞分裂素基因（T－cyt）在转基因烟草中的表达及其对生长发育的影响 [J], 麻密;周达锋;许家喜;匡廷云;汤佩松;林忠平5.脂类分子内佐剂Th/CTL多表位肽体内诱导HLA-A2转基因鼠HBV特异性CTL 应答的研究 [J], 石统东;吴玉章;任红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物 转 化 双 元 载 体 pCG-CB-L act 为 前 期 实 验 构建 。 1. 2 方 法 1. 2. 1 基因组 DNA 提取
取 100 mg样品 (叶片或种子 )放在研钵中 , 加液氮 研磨成粉末 , 采用改进的 CTAB 法提取转基因烟草的 基因组 DNA [ 7] , F lurescent 定 量剂 盒 (B io-R ad 产 品 , 170-2480)对 DNA定量 。
第 26卷 第 2期 2007年 2月 种 子 (Seed) V o.l 26 N o. 2 Feb. 2007
转基因拟南芥中外源基因的 Sou thern b lot检测
芦春斌 (暨南大学生殖免疫中心 , 广州 510632)
摘要 :外源基因在转基因植物的稳定表达是获得 理想转基因植物的首要条件 。 在我们进行的转基因植物研究中 , 根据转 基因植物所带有的转基因成分和标记基因的 DNA 序列 , 采用 Southe rn b lo t技术对转基因植物中的猪 α-乳清蛋白基因和 标记基因的拷贝数进行了分析 。 结果表明 :外源 基因的拷贝数和外源基因的稳定表达相关 。 关键词 : 转基因植物 ;基因沉默 ;猪 α-乳清蛋白基因 ;Southe rn b lo t分析 中图分类号 : Q 812 文献标 志码 : A 文章编号 :1001-4705(2007)02-0014-03
双元载体 (pCG-CB-Lact)(图 2)特有的边界序列 LB和 RB之间包含 2个 35 S启动子序列驱动的 α-乳 清蛋白基因 , 以及除草剂抗性基因 Bar表达单元 , α-乳 清蛋白基因和 Bar基因编码区中只有一个 H id Ⅲ酶切 位点 , H ind Ⅲ可用于 Southern b lo t的基因组 DNA消化 。
10 μg基因组 DNA 加入 0. 8 μl的内切酶 H ind Ⅲ (80 U /μl), 75 μM 精胺 , 总体积 25 μl, 37 ℃消化过夜 。 0. 8%琼脂糖胶分离酶处理的 DNA, 转移到 Ze ta-P rober GT 尼龙膜 (B io-Rad产品 , 162-0196), UV 交联仪固定 , 用含有 0. 1 ×SSC, 0. 1%SDS溶液洗涤滤膜进行预杂 交和杂交 。 分别用α-32 P dCT标记的 Lact和 Bar探针杂 交 , X 光片曝光处理 。
株的叶片和种子进行 PCR反应 , 都检测到这两种外源 基因成分 [ 9] , 上述引物对检测猪 α-乳清蛋白 基因和 Bar基因具有高度的特异性 。
以质粒 (pCG-CB-Lact)DNA 为模 板 , 该引 物可以 特异 性 地 扩 增 得 到 目 的 基 因 DNA 片 段 , 进 一 步 P α-32 dCTP随机引物标记法 标记 PCR 产物作为探 针 , 该探针高度灵敏 、特异 , 是进行 Southe rn分析的关键 。
Southern B lot A nalysis of Exogenous Transgenic G enes in Transgenic A rab idopsis P lan ts
LU Chun-b in (Institu te of Reproductive Imm uno logy, Ji’ nan Un ive rsity, Guangzhou 510632, C hina)
收稿日期 :2006-11-16 基金项目 :教育部留学回国人员科研启动基金资助 。 作者简介 :芦春斌 (1964 -), 男 , 陕西长安人 。 副研究员 , Iow a S tate U n i-
vers ity博士后 , 主要从事转基因植物和食用疫苗研究 。
14
存在基因沉默现象 。 基因沉默无法使转基因植物表现 预期的优良经济性状 , 研究基因沉默的机理和克服外 源基因的不表达是转基因植物研究和应用的关键 。 本 研究中以 Sou thern blo t对我们获得的猪 α-乳 清蛋白 转基因拟南芥的基因拷贝数进行分析 , 旨在探讨拷贝 数与外源基因表达之间的关系 。
转基因植物技术可以定向改造生物性状 , 其应用 打破了传统育种方式只能利用亲缘关系相近物种间的 基因来改造生物的局限 , 因此转基因技术可以以前所 未有的速度和能力 , 在短时间内实现改良动 、植物品种 的产量 、质量 [ 1 - 4] 。
获得具有优良性状的转基因作物新品种 , 首先必 须确保外源 目的基因以 预期设计 的方式高 效表 达 [ 5, 6] 。然而许多情况下 转基因的表达不可预测 , 也
genes in transgencic p lan.t The resu lts show ed the copynum ber o f exogenous genes is dram atically re la ted to the stab le expression o f exogenous genes. K ey word s: transgenic p lants;gene silencing;porcine α-lactalbum in;southe rn blo t
图 1 PCR扩增植物猪 α-乳清蛋白基因和除草剂 Bar基因 注 :M :Invitrogene公司 1 K b P lu s DNA ; Lane 1、 2:除草剂 B ar基因引物 Ba rSeq扩增 ;Lane 3、4:猪 α-乳清蛋白引
物 LactSeq扩增 ; Lane 1、3:野生型拟南芥基因组 DNA , 阴性对照 ;Lane 2、4:pCG -CB-LACT
然而在许多情况下外源基因整合进受体植物的基 因组后 , 经常发生外源基因在转基因植物中的基因沉 默 (gene silec ing)现象 , 以及多种外界环境条件和植物 的生长发育因素影响其表达与稳定性 , 结果不仅外源 基因没有表达, 反而影响了内源基因的正常表 达 。 [ 5, 6, 11]
外源基因的基因沉默是一个非常复杂的现象 , 基 因沉默不同于 DNA 岐变或位置效应引起的基因表达 水平低下 , 也不同于外源基因在子代分离过程中的丢 失 。外源基因沉默现象在 DNA修饰水平 、基因转录水 平和转录后调节水平均可发生 [ 5, 6] 。
Sou thern杂交结果发现 , 抗除草剂 F inale 阳性拟 南芥转化株 A rab 06和 A rab 15的植物基因组中均整 合了猪 α-乳清蛋白基因单拷贝 (图 3 B. Lact), 同样这 两株抗除草剂 F ina le阳性转化株的基因组中除草剂基 因 Bar基因也是单拷贝整合 (图 3A. Bar )。
Ab stract:The fo reign genes are stably expressed in transgen ic p lant, w hich ism ain issue for plan t transform ation research. In this artic le, accoding to transgenic components and DNA sequence o f m arker genes in transgenic p lant, we adopt southern blot techno logy to analyze porcine α-lactalbum in and copy num be rs of m arke r
转在获得的转化植物及其后代中 , 生长过程中只有拟 南芥转化株 A rab 06和 A rab 15的多个组织器官 , 即种 子和叶片都有猪 α-乳清蛋白基因蛋白的稳定表达 。
3 讨 论
植物转化的受体植物中导入外源的基因必须在转 基因植物后代中稳定表达 , 外源基因能否以预期的方 式稳定 表 达是 影响 转 基因 植 物应 用 前景 的 首要 因 素 。 [ 5, 6, 11]
研究报告 芦春斌 :转基因拟南芥中外源基因的 Sou thern blo t检测
1. 2. 2 PCR引物 猪 α-乳清蛋白基因的引物序列参照文献 [ 9] 。
1. 2. 3 质粒 DNA 参照文献 [ 8]提取质粒 DNA, 测定浓度并计算纯
度后 , 为 PCR扩增模板 。 1. 2. 4 基因片段的 PCR扩增和 probe制备
图 3 转基因拟南 芥 Southe rn分析 注 :Lane 1:Invitrogene公司 1 K b Plu s DN A;ck:野 生型拟南 芥基因组
DNA , 阴性对照 ;A rab 06和 A rab 15:转化株 。
15
第 26卷 第 2期 2007年 2月 种 子 (Seed) V o.l 26 N o. 2 Feb. 2007
随着生物科学的发展 , 转基因植物技术等分子育 种技术为培育作物优良新品种开辟了一条崭 新的途 径 。植物转化可将具有优良性状的外源基因导入受体 植物 , 使之具备新的生物性状 , 由此而得到具有各种重 要经济价值 的 “遗 传修饰生 物 ” (G ene tic m odified organism , GM )-转基因作物 。 目前进入实际应用的商业 化转基因作物主要是导入抗除草剂基因 , 抗病毒基因 、 抗虫基因等各种优良性状基因 。玉米 、大豆和棉花等 转基因作物已经在世界各地大面积种植 , 对世界农业 已做出很大的贡献[ 1 -4] 。
(1)PCR反应体系和反应程序参照文献 [ 9] 。 猪 α-乳清蛋白基因 94 ℃变性 45 s, 55 ℃退火 1 m in, 72 ℃延伸 , 循环 35次 。Bar基因 PCR扩增的条件 , 除 50 ℃退火 1m in外 , 其余条件同前者 。