中科院力学所科技成果——低成本高纯度纳豆激酶的生产技术

合集下载

纳豆激酶分离纯化技术的研究

第 22 卷第 3 期 2008 年 9 月
山东轻工业学院学报 JOURNAL OF SHANDONG INSTITUTE OF LIGHT INDUSTRY
文章编号 :1004 - 4280 (2008) 03 - 0024 - 04
纳豆激酶分离纯化技术的研究
0 引言
纳豆激酶 (Nattokinase ,NK) 是日本学者须见洋行从日本食品纳豆中纯化分离出的一种具有溶血栓功能的丝氨酸蛋白酶 ,它是由枯草杆菌 ———纳豆菌 ( Bacillus natto) 发酵大豆后所产的酶[1] 。由于 NK 作用迅速 ,维持时间长 ; 源于食品 ,安全性好 ; 分子量小 ,是一个单链蛋白质 ,更易被人体消化道吸收 ;对纤维蛋白的作用机制不同于尿激酶等现用于临床的药物 ,它同其他纤溶酶一样直接作用于纤维蛋白 ,同
Phenyl Sepharose 疏水柱层析 Sephadex G2150 凝胶过滤层析 Sephadex G2100 凝胶过滤层板
第 22 卷
SDS - PAGE 测得分子量ΠkDa
—
28 28 28 和 38
纯化倍数酶率活Π回%收
①4. 75 ②1. 32
—
①74. 3 ②77. 0
—
50
40
产品的生产主要是发酵液经过一系列的分离纯化方
具有操作简便、可规模化生产及选择性强等特点 ,广泛应用于规模化工业生产中。基本工艺流程是离心除菌 →盐析 (或有机溶剂沉淀) →超滤浓缩 →凝胶过滤层析脱盐 →离子交换层析或疏水层析。一般是将凝胶层析、疏水层析、亲和层析和离子交换层析中两种以上的层析方法配合使用来进行酶的分离。
膨胀床吸附分离作为一种新型的蛋白质分离纯化方法 ,其主要原理是根据静电吸附作用 ,将带有相反电荷的蛋白酶吸附在离子交换柱上。该分离方法避免了柱层析分离过程中 ,因复杂的纯化步骤而导致纳豆激酶失活的缺点 ,具有快速分离纯化的优点。胡洪波等[17] 对膨胀床分离纳豆激酶过程的各个阶段进行了考察 ,发酵液中经离心得上清液 ,将粗酶溶液的 pH 值调节至低于其等电点 ,采用 Streamline SP 强离子交换吸附剂 ,Streamline 25 膨胀床柱 ,XK16 层析柱 ,吸附时最佳的 pH 为 6. 0 ,电导率应低于 6. 2 msΠcm。然后进行清洗解吸 ,得到比较纯的纳豆激酶 ,整个分离过程缩短为 8～10 h ,回收率提高了约 50 %。

纳豆激酶的生产提取工艺

纳豆激酶的生产提取工艺纳豆激酶(nattokinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，属于胞外酶。

具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。

一、发酵液生产1、菌种活化无菌室内用无菌环挑取保存的纳豆杆菌，连续划线于平板培养基上，盖上培养皿盖，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。

2、种子液的制备种子培养基成分无机离子：MgSO4 0.5 g/L，K2HPO4 1 g/L其它成分：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L（pH=7.0-7.2）挑取斜面种子接入种子培养基，种龄8 h，装液量50 mL/250 mL，接种量2%，在37 ℃，200 r/min下摇床培养24 h。

3、发酵培养无机离子：MgSO4 2 g/L，Na2HPO4 9 g/L，NaH2PO4 0.5 g/L，CaCl2 0.4 g/L其它成分：麦芽糖15 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，豆油2 g/L（pH=7.0）按照2% (V/V)的接种量转接种子液于发酵培养基中，装液量100 mL/500 mL，于30 ℃，200 r/min 摇床振荡培养72 h。

二、预处理和固液分离采用离心的方法。

将所得到的发酵液立即分装在的离心管内,冷冻离心10 min,转速5000 r/min。

收集上清液，弃去沉淀，调pH值到7.0，即得粗酶液。

三、提取1、分级盐析法使用分级盐析法，分段将杂蛋白和目的蛋白沉淀，达到分离的目的。

将粗酶液倒于锥形瓶内，利用蛋白质盐析原理,加入研细的固体(NH4)2SO4，使其浓度达到40%，4 ℃过夜，使其析出杂蛋白。

再将过夜的发酵液转移到干净的离心管内，然后离心，弃去沉淀，再次得到上清液，调节上清液pH值到8.6，后转移到锥形瓶内，加入研细的固体（NH4）2SO4，使其浓度达到65%，4 ℃过夜，使目的蛋白沉淀下来。

一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法[发明专利]

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1876810A[43]公开日2006年12月13日[21]申请号200510075057.9[22]申请日2005.06.08[21]申请号200510075057.9[71]申请人中国科学院过程工程研究所地址100080北京市海淀区中关村北二条1号[72]发明人阳承利邢建民官月平刘会洲 [51]Int.CI.C12N 9/12 (2006.01)权利要求书 1 页说明书 6 页[54]发明名称一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法[57]摘要本发明提供了一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法。

将表面偶联有亲和配基的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中，在室温下缓慢搅拌充分混合，使纳豆激酶特异性地吸附在磁性微球表面；采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来，用缓冲溶液清洗一次去除杂质，再用解析液进行解析，收集到纳豆激酶的洗脱液；最后经过冷冻干燥得到纳豆激酶产品。

分离后纳豆激酶的活力为85％，纯化因子为6.0。

本发明具有周期短、操作简单、生产成本低且易于规模化生产等优点。

200510075057.9权利要求书第1/1页 1 一种磁性微球分离纯化纳豆激酶的方法，其特征在于，所述的纳豆激酶分离纯化方法包括以下几个步骤：(1)纳豆激酶发酵液的制备从固体培养基上挑取纳豆激酶的单菌落接入20-100mL的种子培养基中，摇床中培养12-24h，按2％-6％接种量接入发酵液体培养基中，在25-37℃下发酵罐培养24-48h，液体发酵结束后，通过离心除去菌体，得到纳豆激酶发酵液；(2)亲和配基在磁性微球上的固定化将自制的磁性高分子微球进行表面功能化修饰得到表面含有环氧功能基团的磁性微球，在50-80℃条件下，以氢氧化钠为催化剂，进行亲和配基的固定化反应，获得表面含有亲和配基的磁性微球；(3)采用磁性微球从发酵液中分离纳豆激酶将表面含有亲和配基的磁性微球加入到纳豆激酶的发酵液中，在室温下缓慢搅拌充分混合30分钟，使纳豆激酶特定地吸附在磁性微球表面，采用磁铁将吸附有纳豆激酶的磁性微球从发酵液中分离出来，用缓冲溶液清洗一次去除杂质，再用解析液进行解析，收集到纳豆激酶的洗脱液，洗脱液保存在0-10℃条件下。

（提高纳豆激酶的方法）自制纳豆,游刃有余

（提高纳豆激酶的方法）自制纳豆,游刃有余三、提高纳豆激酶的方法材料一:纳豆激酶的生产提供一种得率高，酶活高，成本低，可进行产业化生产的纳豆激酶的生产方法。

依次包括下述两个步骤：(一)、发酵；所述第的发酵是固体发酵，该发酵过程依次有如下工序:①用特制浸泡液浸泡优质黄豆，所述的特制浸泡液的配方为：牛肉浸膏5～l0g，蛋白胨4～12g，酵母浸出汁3—8g，NaCl 5～l0g，葡萄糖l5～20g，自来水l000ml，PH值为6.8～7，浸泡到黄豆吸足水份，豆无硬心，表面无皱纹为止；②装瓶灭菌接种：采用常规灭菌方法，等瓶温自然冷却至40℃以下，在无菌条件下接种，接种所用的菌种是枯草芽孢杆菌；③培育：采用常规培养条件；采用高低温培养方法，先在37℃下培养22—32小时后马上转入3～10℃条件下保温，l2～24小时获得发酵物。

(二)、将经发酵步骤后得到的干燥物粉碎；①干燥：采用常规方法。

干燥工序中采用的是将发酵物进行低温真空冷冻干燥，发酵物水分小于l5％时干燥结束。

②粉碎是采用细胞破壁技术。

上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓药物，其特殊之处在于：制备片剂、冲剂、硬胶囊、软胶囊或口服液时，在所得产物中直接添加可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糊精(等)配料调整至每克内有200～680的酶活单位。

上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓药物每克内有200～380的酶活单位，具有预防心血管疾病的作用。

上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓药物每克内有300～680的酶活单位，具有治疗心血管疾病的作用。

上述生产方法培养的纳豆激酶制备的冻干粉每克内含大于800的酶活单位，制备的针剂纯度达95％以上。

下面将通过实施例对方案作详细叙述：第一部分：纳豆激酶的生产方法1、使用特制浸泡液的实施例及其与使用常规浸泡液的产物酶活比较实验条件：300ml三角瓶加入特制浸泡液浸泡过的大豆l0g，调PH7，121℃灭菌15min，接入枯草芽孢杆菌斜面菌种，在37℃条件下培养24小时，常规干燥、常规粉碎后测定酶活。

纳豆激酶液态发酵生产的研究进展

血栓性疾病严重危害人类健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。据统计，目前全世界每年约有
但可以直接水解交联纤维蛋白，而且可以激活体内的尿激酶原转变成为尿激酶，刺激血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ），间接地通过降解和失
吴燕，李英波，梁向峰，刘会洲，肖建辉ｈ
１（遵义医学院附属医院，医药生物技术研究所，贵州遵义，５６３００３）
２（中国科学院过程工程研究所，中国科学院绿色过程与工程院重点实验室，北京，１００１９０）
品中也发现了该酶。１９９２年日本学者ＮＡＫＡＭＵ．
ＲＡ首次对纳豆激酶基因ａｐｒＮ进行了克隆并对包含调控序列的１４７３ｂｐ的基因序列全长进行了测定。该酶的分子量为２７．７ｋＤａ，是由２７５个氨基酸残基组
成的单链多肽酶，在ｐＨ７～１２的范围内具有强大的
然而，大规模固态发酵生产中存在物
料灭菌不彻底，生产周期长，生物量浓度、ｐＨ、湿度等
各项参数指标不易在线检测，散热、发酵调控及发酵终点等问题未能得到很好的解决，严重影响菌体的生长和酶的产量，并导致不同批次的产量差异大，生产

纳豆激酶的研究综述

目前临床应用的溶栓药物袁如尿激酶尧链激酶尧重组型纤溶酶原激活剂等袁存在半衰期短尧用药量大尧对蛋白纤维的溶解不具有选择性袁用药量控制不好易导致内出血袁或易引起超敏反应等副作用[5]袁所以很难成为面向广泛的大众化药品遥而来源于传统食品纳豆的纳豆激酶袁可由细菌发酵生产袁成本低尧安全性好袁并且作用迅速袁是一种理想的预防和治疗血栓的天然药物袁具有极为诱人的广阔前景遥
目前研究早已证明袁血栓的形成是由血液中纤维蛋白与相关血细胞粘在一起导致袁而增大的血凝块会阻塞血液循环进而引起组织供血不足遥这是引起各种心血管病的重要原因遥由于纤维蛋白是血栓中的骨架成分袁所以分解血栓中的纤维蛋白成分是溶栓工作中的关键遥正常生理情况下袁机体血液循环系统处于凝血过程和溶栓过程的动态平衡中袁随着个体年龄的增加袁机体合成纤维蛋白的功能减退而使凝血过程加重袁凝血和溶栓之间的平衡被打破袁这就是老年人更
110 科技视界 Science & Technology Vision
容易出现心血管疾病的原因[3]遥心血管疾病已经成为威胁国民健康需要的重要原
因袁据权威组织调查数据显示袁在全世界范围内袁因心血管疾病而死亡的人数高达 1700 万袁明显超过呼吸系统疾病尧肿瘤和传染病遥到 2020 年袁死于心血管疾病的人数可能会超过 2000 万遥而中国作为占世界人口数量六分之一的人口大国袁加之现在又进入了老龄化阶段袁所以对于心血管疾病的治疗和研究已成为摆在国人面前的一项重大课题袁急须加大研究遥据有关文献报道袁在中国袁每年死于心血管疾病的人数高达 260 万人遥这种病不但致残率和死亡率高袁而且很难根治袁对人类的健康带来了严重的威胁[4]遥

一种高活性纳豆激酶粉的制备方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011074455.X(22)申请日 2020.10.10(71)申请人湖南更好愿景生物科技有限公司地址 410200 湖南省长沙市望城经开区杨家湾路499号(72)发明人张爱平　李艳　袁四岳　黄兴江　唐泽宇　张晓明　鄢家凡　(74)专利代理机构长沙星耀专利事务所(普通合伙) 43205代理人宁星耀(51)Int.Cl.C12N 9/56(2006.01)C12N 9/96(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12R 1/125(2006.01)(54)发明名称一种高活性纳豆激酶粉的制备方法(57)摘要一种高活性纳豆激酶的制备方法，包括以下步骤：发酵种子液制备；大豆浸泡磨浆及蒸煮；加蛋白酶酶解；加葡萄糖、无机盐、灭菌，配制成发酵培养基；接种及通气发酵；添加保护剂；干燥。

本发明方法加酶酶解，有效提高了产酶效率；麦芽糊精作为保护剂的加入，使后续将发酵液进行喷雾干燥时，有效减少纳豆激酶在高温环境中酶活的损失，提高喷雾干燥的效率，减少喷雾干燥所需能耗。

本发明方法制得的高活性纳豆激酶粉，活性高达3万～4.5万IU单位。

权利要求书2页说明书4页CN 112251425 A 2021.01.22C N 112251425A1.一种高活性纳豆激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：发酵种子液制备；大豆浸泡磨浆及蒸煮；加蛋白酶酶解；加葡萄糖、无机盐、灭菌，配制成发酵培养基；接种及通气发酵；添加保护剂；干燥。

2.根据权利要求所1所述的高活性纳豆激酶的制备方法，其特征在于，具体操作步骤如下：（1）发酵种子液制备：在无菌环境下，将枯草芽孢杆菌用接种环挑出1～2环接种到灭菌后的新鲜斜面培养基上，在37℃培养箱中培养24h，得到活化后的枯草芽孢杆菌；将活化后的枯草芽孢杆菌在无菌条件下挑取1～2环到已灭菌的种子液培养基中，在37℃、100～150r/min条件下振荡培养15～20h，得发酵种子液，备用；（2）熟豆浆制备：将大豆浸泡6～8小时，沥水、清洗干净，按浸泡前大豆:水=1:3～3.5的质量比进行磨浆，过滤，得除渣后的生豆浆；生豆浆通入蒸汽在0.10～012MPa压力下进行加热，沸腾后3～5分钟停止加热，得熟豆浆；（3）熟豆浆酶解：在熟豆浆中加入相当于熟豆浆重量0.1～0.3%的复合蛋白水解酶，调pH为7.0～7.2，在酶解罐中55～60℃恒温酶解80～120分钟，得酶解好的豆浆；（4）发酵培养基配制：将酶解好的豆浆按体积比5～8倍水量加水稀释，在稀释后酶解豆浆中按每升液体分别加入8～12克的葡萄糖，0.1～0.5克的氯化钙、0.2～08克的硫酸镁、0.8～1.5克的磷酸二氢钾、0.8～.5克的磷酸氢二钾，充分溶解，121℃灭菌15分钟，冷却至35～37℃，得发酵培养基；（5）接种、发酵：按发酵培养基体积的6～10%接种步骤（1）制得的发酵种子液，恒温36～37℃，搅拌，通气，保持发酵罐内气压0.03～0.05MPa，发酵16～20小时，通气量，每1升发酵液每分钟通入0.8～1升净化空气；（6）保护剂添加：发酵结束后，在发酵液中加入麦芽糊精作为干燥保护剂，并搅拌均匀，添加后，麦芽糊精占总发酵液的重量为10～30%；（7）对添加了干燥保护剂的发酵液进行干燥。

【CN109722426A】一种纳豆激酶的制备方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910170443.8(22)申请日 2019.03.06(71)申请人武汉轻工大学地址 430023 湖北省武汉市东西湖区常青花园学府南路68号(72)发明人刘梁　乔斌　潘显虎　赵玲　陈新　燕宇剑　倪丹妮　关金涛　(74)专利代理机构深圳市世纪恒程知识产权代理事务所 44287代理人胡海国(51)Int.Cl.C12N 9/56(2006.01)C12R 1/125(2006.01)(54)发明名称一种纳豆激酶的制备方法(57)摘要本发明公开一种纳豆激酶的制备方法，涉及发酵技术领域。

所述纳豆激酶的制备方法包括以下步骤：将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液；将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液；用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液；将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品。

本发明技术方案中，通过采用连续化膜分离-大孔吸附树脂法纯化-真空低温微波干燥的工艺流程来制备纳豆激酶，实现了产业化生产高纯度、高活性纳豆激酶。

权利要求书2页说明书10页附图2页CN 109722426 A 2019.05.07C N 109722426A权　利　要　求　书1/2页CN 109722426 A1.一种纳豆激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液；将所述粗酶液通过多级膜分离以清除分子量不在纳豆激酶分子量范围内的杂质，得浓缩液；用大孔吸附树脂法对所述浓缩液初步提纯，得洗脱液，将所述洗脱液用超滤法精细提纯，得精酶液；将所述精酶液进行真空低温微波干燥，得纳豆激酶干品。

2.如权利要求1所述的纳豆激酶的制备方法，其特征在于，所述将纳豆菌发酵液离心分离，取上清液过滤，得粗酶液的步骤中，所述离心时，转速为8000～12000r/min，离心时间为10～15min；所述过滤时，采用砂滤棒过滤。