生理指标测定实验方案设计设计汇总情况情况

预测指标：

1•抗氧化酶系统、MDA

2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基

3. 叶绿素、类胡萝卜素

4. 可溶性糖

5. 游离氨基酸

6. 过氧化氢

7. 谷胱甘肽、ASA

1. 抗氧化酶系统、MDA

A酶活测定

试剂：

PBS 缓冲液0.05M （pH 7.8 ）:取0.663g NaH2PO4 • 2H2O 16.384g Na2HPO4 • 12H2O , 加PVPIOg，并加EDTA或者EDTA盐，使其浓度为2mM，加蒸馏水定容至1L。用前冰箱或冰上预冷。样品制备

鲜样0.1-0.5g加入1 ml磷酸缓冲液（0.05M , pH 7.8 ）,稍许石英砂，研磨成匀浆；移入

10 ml离心管中，再用4ml磷酸缓冲液分两次洗涤研钵并全部转入离心管中；10000 X g 4 C

下离心20 min ;上清夜贮于4 C冰箱中保存备测。同时称取鲜样一份（0.1g左右）烘干称重。

试剂配制：

实验步骤：

2.725mL反应液+ 250uL蒸馏水+ 25uL酶液【样品管】

2.75mL反应液+ 250uL蒸馏水（光照作为100%CK ）【照光对照管】

2.75mL反应液+ 250uL蒸馏水（黑暗作为调零）【空白调零管】

4000IX日光灯下反应20分钟，560nm比色。反应温度25~35 C。

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50 %为一个酶活性单位表示按下式计算SOD

活性：SOD 总活性=（Ack —AE）*V/ （0.5*Ack*w*Vt ）

（式中SOD总活性以鲜重酶单位每克表示，Ack为照光对照管的吸光度，AE为样品管的吸光度，V为样品液的总体积ml , Vt为测定时样品用量ml , w为样品鲜重g）

探※※【空白调零管】可在光反应快结束前配制并用黑色纸或铝箔包裹以避光。【样品管】和

【照光对照管】在光反应快结束后至测定前应避光处理。

POD （入=470nm 比色）

试剂配制： 1.5%愈创木酚（1.5ml愈创木酚，用蒸馏水定容到100 ml ）

300uM 的H2O2 :取30 %的H2O2 1.53ml ，用蒸馏水定容到50 ml ;

实验步骤：100ul酶液+2700ulPBS+100ul 愈创木酚+100ul H2O2 ，于普通比色皿，轻轻摇匀2-秒,

A470动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该

时间段。

结果计算：POD(mmol/g)=activity X A X V X a/(E X w)

A反应液总体积/ml ; V提取液总体积/ml ; a测定液体积/ml ; w材料鲜重/g ; E吸光系数/mM c m-1

100ul酶液+2800ulPBS+100ul H2O2，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒，A240动力学测

定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity，此后测定均参考该时间段。

结果计

CAT (mmol/g)=activity X A X V X a/(E X w)

算：

APX （入=290nm 比色）

试剂配制：7.5mM 的抗坏血酸（AsA）: 66mg AsA 用蒸馏水定容到50 ml ;

300uM 的H2O2 :取30 %的H2O2 1.53ml ，用蒸馏水定容到50 ml ;

实验步骤：

100ul 酶液+2700ulPBS+100ul AsA +100ul H2O2 ，于石英比色皿，轻轻摇匀2-秒,A290

动力学测定1分钟。选择时间段较为笔直的曲线斜率为activity ,此后测定均参考该时间段。

结果计算：CAT （mmol/g）=activity X A X V X a/（E X w）

B.丙二醛（MDA ）含量的测定（入=450 , 532 , 600nm 比色）

试剂配制：

5%三氯乙酸（TCA ）：25g三氯乙酸定容到500mL。

MDA反应液：2.5g硫代巴比妥酸，先用少量1M的氢氧化钠溶解，再用5%三氯乙酸定容

到500mL。

实验步骤：

0.5mL酶液+ 2.5mL反应液，沸水浴反应15分钟，立即冰浴，4800rpm 离心10分钟，

上清转入新管，波长450,532和600下比色，MDA反应液调零。

结果计算：丙二醛含量（nmol.g-1 ） = （D532 —D600 ）*A*V/ （a*1.55*10-1*w ）

式中A为反应液总量（mL）; V为提取液总量（mL ）; a为测量用提取液量（mL ）; w为材

料鲜重（g ）。1.55 X -10为丙二醛的umol/L消光系数（nmol/mL 消光系数）

或者：MDA 浓度（umol/L）=6.45（D532 —D600）—0.56D450

丙二醛含量（umol.g-1 ）= MDA 浓度X提取液总体积（ml）/组织鲜重（g）/1000 ----------

植物体可溶性蛋白质含量测定比色原理:

染料考马斯亮蓝G-250在游离态下呈红色，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在

465nm ，后者在595nm 。在一定蛋白质浓度范围内（0〜100卩g/ml ,蛋白 质-色素结合物在 595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比。

故可用于蛋白质的定量测

定。蛋白质与考马斯亮蓝 G-250结合在2min 左右的时间内达到平衡， 完成反应十分迅速，

其结合物在室温下1h 内保持稳定。该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量，所以是一种 比较好的蛋白

质定量法。 【试剂】

1、 65mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH7.8）;如超氧阴离子自由基含量测定用。 称取 K2HPO4 3H2O （MW=228.22）9.1234g 和 KH2PO4（MW=136.09）3.406g ,蒸馏水定

容至U 1L 。或 K2HPO4 3H2O 4.562g 禾口 KH2PO4 1.703g ，蒸馏水定容到 0.5L 。 2、 考马斯亮蓝 G-250 :称取100mg 考马斯亮蓝 G-250溶于50ml 90% 乙醇中，加入85%

（W/V ）磷酸100ml ,最后用蒸馏水定容至 1000ml 。滤纸过滤后低温储存。常温下可放 置一个月； 3、 磷酸（85% , W/V ）:也即商业磷酸（浓度》85%）。直接用。 4、 0.15M 的NaCl （标准曲线用）：NaCI0.8766g 蒸馏水定容到 100ml 。 【方法】 1.

标准曲线的绘制

血清白蛋白（BSA ）先用0.15M 的NaCl 配制成2mg/ml 的原液。

表1 配制0〜1000卩g/m 血清白蛋白液 __________________________________________________

管号

1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白原液（ml ） 0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 磷酸钾缓冲液量（ml ） 1.0

0.9

0.8 0.7

0.6

0.5 蛋白质含量

（卩g/ml ）

0 200 400

600 800 1000

以上各管混匀后，各取 0.1ml 置2min ，在595nm 下比色， 于新的10ml 绘制标准曲线。 离心管内，各加 5ml 折衷： 考马斯亮蓝染液，混匀放

表2 配制0〜1000 口 g/m 血清白蛋白液__________________________________________________

管号

1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白原液（ul ） 0 10 20 30 40

50

磷酸钾缓冲液量（ul ）

100

90

80 70

60

50 蛋白质含量 （卩

200 400

600 800 1000

以上各管混匀后，各加 5ml 考马斯亮蓝染液， 混匀放置

2min ，在 595nm 下比色，绘制

标

准曲线。

2. 样品提取液中蛋白质浓度的测定

样品制备参见超氧阴离子自由基含量测定方案。 取样品上清液0.1ml 于新的10ml 离心管内，

各加5ml 考马斯亮蓝染液，混匀放置 2min ，在595nm 下比色。

3. 结果计算

样品蛋白质含量（mg/g 鲜重）=C*V/W

式中 C —查标准曲线所得每管蛋白质含量（ mg/ml ）; V —提取液总体积（ml ）;此为样品 提取液总体积为3ml ; W —取样量（g ）。探测定以上3项目时，同时取部分同批剩余鲜样 称重后转入纸袋烘干称重。

2. 可溶蛋白、超氧阴离子自由基

植物材料0.1-0.2g 左右（记录准确称量值）T 65 mmol/L 磷酸钾缓冲液（pH7.8）1ml 宀少许石 英砂T 冰上充分研磨T 转入离心管T 磷酸钾缓冲液洗涤研钵 2次，每次1ml 全部转入离心 管（样品提取液总体积为 3ml ） T 4 °C 10000r/min 离心15min T 取上清液转入新管标记低温 保存（待测液）。

A.超氧阴离子自由基（入=530nm ）

比色原理：