蛋白酶的盐析沉淀
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N—酶液稀释倍数
4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以4
10—反应时间为10 min
参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%， 50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150， 100，100，100，50倍
计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓 度，离子强度，蛋白酶溶解度和上清液 酶活残留，并填表。
离子半径小 > 离子半径大
阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-
• 蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用 Cohn经验式来表示：
log S K sI
式中：S—蛋白质的溶解度
I—离子强度
5. 另取3支试管，分别吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳 酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，于40℃水浴中保温20min显色 。
6.以0号管为对照，在波长680nm处测定1、2号管的吸光度， 求出平均值。
蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算
酶活力
4 10
ห้องสมุดไป่ตู้
K
N
O.D680
K—在酪氨酸标准曲线上O.D值为l时酪氨酸的微克数 （μg），K值为108.53
1.将2%酪蛋白溶液40℃预热3-5min
2. 取3支试管编号0、1、2，分别吸取待测酶液1ml放入试管中 ，40℃水浴中预热1-2min
3.往0号试管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支试管中加入 2%酪蛋白1ml，计时摇匀，40℃反应10min
4.往1、2号试管中加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，摇匀，取出3支 试管静置10min
以log S为纵坐标，I为横坐标作图，将 直线部分线性回归，求出Ks和β的数值， 建立起蛋白酶的盐析曲线。
β—常数，与温度和pH有关
Ks—盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关
• 其中I 根据下式计算：
I
1 2
c
i
z
2 i
式中：ci—i 离子的浓度（mol/L） zi—i 离子所带的电荷
盐析法最为常用的盐为硫酸铵。
硫酸铵溶液的浓度常用“饱和度”来表示， “饱和度”定义为在盐析溶液中所含的硫 酸铵质量与该溶液达饱和所溶解的硫酸铵 质量之比。25℃时硫酸铵的饱和浓度为4.1 mol/L（767 g/L），定义该浓度为100%饱 和度。
将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中，在 天平上称重平衡，用高速冷冻离心机离心 于10℃，10,000 r/min离心20 min。
将上层清液倒入量筒记录其体积，并分别 测定酶活（u/ml），即为该酶的溶解度S。
蛋白酶活力的测定
福林（Folin）试剂在碱性条件下可被酪 氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪 蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的 酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显 兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量， 从而推断酶活力的大小。
实验步骤
分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编 号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70， 8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵 粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%， 70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下， 将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min， 使硫酸铵完全溶解。然后静置使蛋白酶沉淀 完全。
实验报告
实验报告内容包括：目的、原理、方法 、结果、思考题和讨论（讨论的内容为 各人对实验的理解意见改进收获等等）
实验报告可以提交打印版
蛋白酶的盐析沉淀
稳定蛋白质胶体溶液的两个因素
(1)带同种表面电荷(在非等电点时)，形成 双电层结构
(2)形成水化膜
＋＋＋
＋ ＋＋＋ ＋ ＋
＋
＋＋＋ ＋
＋＋
＋＋
水化膜
盐析法
在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解 度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定 浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。
原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去 除水膜； ②大量盐能中和蛋白质分子 表面电荷，使分子间静电斥 力减弱，疏水作用增强，使 蛋白质沉淀。
盐析效果： 二价离子 > 一价离子
4—酶反应液为4 ml，取出1 ml测定，故乘以4
10—反应时间为10 min
参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%， 50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150， 100，100，100，50倍
计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓 度，离子强度，蛋白酶溶解度和上清液 酶活残留，并填表。
离子半径小 > 离子半径大
阳离子∶Mg2+>Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+ 阴离子∶PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-
• 蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用 Cohn经验式来表示：
log S K sI
式中：S—蛋白质的溶解度
I—离子强度
5. 另取3支试管，分别吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳 酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，于40℃水浴中保温20min显色 。
6.以0号管为对照，在波长680nm处测定1、2号管的吸光度， 求出平均值。
蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算
酶活力
4 10
ห้องสมุดไป่ตู้
K
N
O.D680
K—在酪氨酸标准曲线上O.D值为l时酪氨酸的微克数 （μg），K值为108.53
1.将2%酪蛋白溶液40℃预热3-5min
2. 取3支试管编号0、1、2，分别吸取待测酶液1ml放入试管中 ，40℃水浴中预热1-2min
3.往0号试管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支试管中加入 2%酪蛋白1ml，计时摇匀，40℃反应10min
4.往1、2号试管中加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，摇匀，取出3支 试管静置10min
以log S为纵坐标，I为横坐标作图，将 直线部分线性回归，求出Ks和β的数值， 建立起蛋白酶的盐析曲线。
β—常数，与温度和pH有关
Ks—盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关
• 其中I 根据下式计算：
I
1 2
c
i
z
2 i
式中：ci—i 离子的浓度（mol/L） zi—i 离子所带的电荷
盐析法最为常用的盐为硫酸铵。
硫酸铵溶液的浓度常用“饱和度”来表示， “饱和度”定义为在盐析溶液中所含的硫 酸铵质量与该溶液达饱和所溶解的硫酸铵 质量之比。25℃时硫酸铵的饱和浓度为4.1 mol/L（767 g/L），定义该浓度为100%饱 和度。
将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中，在 天平上称重平衡，用高速冷冻离心机离心 于10℃，10,000 r/min离心20 min。
将上层清液倒入量筒记录其体积，并分别 测定酶活（u/ml），即为该酶的溶解度S。
蛋白酶活力的测定
福林（Folin）试剂在碱性条件下可被酪 氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪 蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的 酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显 兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量， 从而推断酶活力的大小。
实验步骤
分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编 号，分别加入50 ml蛋白酶液，分别称量5.70， 8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵 粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%， 70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下， 将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5 min， 使硫酸铵完全溶解。然后静置使蛋白酶沉淀 完全。
实验报告
实验报告内容包括：目的、原理、方法 、结果、思考题和讨论（讨论的内容为 各人对实验的理解意见改进收获等等）
实验报告可以提交打印版
蛋白酶的盐析沉淀
稳定蛋白质胶体溶液的两个因素
(1)带同种表面电荷(在非等电点时)，形成 双电层结构
(2)形成水化膜
＋＋＋
＋ ＋＋＋ ＋ ＋
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水化膜
盐析法
在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解 度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定 浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。
原理 ： ①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去 除水膜； ②大量盐能中和蛋白质分子 表面电荷，使分子间静电斥 力减弱，疏水作用增强，使 蛋白质沉淀。
盐析效果： 二价离子 > 一价离子