动物细胞培养基本技术与原理

倒出培养液，瓶底可能附着一些巨噬细胞，借此可将其分开（单独培养或 弃之不用）； ④800r/min离心5min，弃上清液，重悬于BSS液中，再重复离心一次； ⑤加入培养液制成细胞悬液，用于接种。
三、细胞计数(cell counting)
——计数悬浮液中细胞的形态及浓度，以判断消化或稀释程 度（亦用于培养液中细胞浓度的检查） ①染色：在干净的离心管中加入9滴细胞悬液，再加入1滴0.4% 台盼蓝，混匀，静置2~3min； ②充池：在计数板盖片边缘加入1~2滴染色的细胞悬液，使之完 全充满计数板与盖玻片间的空间（无气泡或溢出）
4. 培养条件下动物细胞的生理特点
1）动物细胞的分裂周期长 动物细胞分裂周期一般为12～48小时，它不仅随
细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部 位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、 pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。
2）接触抑制(contact inhibition)现象 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需
永久细胞系有如下特征：
细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的 核质比；
生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；
贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接 种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规 模化培养的前体。
4）动物细胞的环境敏感性
动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些， 其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。
“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年 龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚 成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则 不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维 细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。
大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超 过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是 发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久 细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细 胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。
用特点及组织成分不同适当选用 （4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。
2、组织消化操作方法(tissue digestion method of operation)
（1）胰蛋白酶消化(trypsin digestion)
①将剪碎的组织块放入有玻璃珠的三角烧瓶中，加入30~50倍体积的0.25%胰 蛋白酶； ②37℃水浴内消化30~60min，每5~10min摇动一次。根据效果可中间更换消 化液。（静止10min，吸去2/3上清液，补加新鲜胰蛋白酶） ③Hanks液漂洗两次，每次2~3min； ④800r/min离心5min，弃上清液，加入营养液。如有大块，可用纱网过滤。 如消化传代细胞，可与EDTA混用。
动
物
细
胞
培 养 基
第 二
本章
技
术
与
原
理
细胞与组织培养（体外培养）(cell and tissue culture)： 从机体中取出组织或细胞，模拟体内生理条件在体外进行培
养，使之生存和生长。
包括三个层面：器官培养、组织培养、细胞培养 分别代表细胞水平、组织水平或器官水平的培养
主要讲3方面问题：
动物细胞培养的主要领域及意义 动物细胞的培养特性 动物细胞培养的生存条件
白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰 素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、β-细胞生长因子
4.动物克隆技术有益应用
动物克隆技术的应用前景：
（1）保存优良的动物品种 （2）拯救濒临灭绝的珍惜动物 （3）利用克隆动物工厂生产蛋白质药物 （4）利用克隆技术生产人体器官
二、动物细胞特性
要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围 的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加， 这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。
3）有限细胞系和永久细胞系
动物细胞离体培养起始物--原代培养（primary culture） 经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。有 限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在 有限的时间内生存，一般经过30~50世代后细胞将逐渐死亡。
杂交瘤细胞(hybridoma cell)。
杂交瘤细胞的特性：*
既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生 特异性抗体的能力。
单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology)。
单克隆抗体的特性：* 具有高度的特异性、灵敏性与准确性
应用：临床医学的疾病诊断。 生产各种免疫疫苗。 用于某些肿瘤的治疗。 用于各种基础医学研究。
激素
免疫调节因 子
动物细胞培养的产物
治疗性抗体
小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗原、疱疹、某些 癌症 口蹄疫、鸡瘟病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血 病 尿激酶、细胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶 原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶
促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒毛膜促性腺激素、促黄 体激素、促滤泡激素、生长激素
一、基本概念（general concept）：
细胞培养（cell culture）：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模
拟机体内的生长源自文库境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程。
原代（初代）培养：指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。原 代培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞。
传代（继代）培养：从原代培养的细胞继续转接培养，称为传代培养。传 代培养的细胞称为传代细胞。
（二）组织消化(tissue digestion)
用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。 1、常用消化液适用范围 （1）胰蛋白酶：适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、
上皮、肝、肾、传代细胞等。 （2）胶原酶：适用于纤维组织、上皮组织、癌组织等。 （3）其他酶：链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等，根据酶的作
活体内的动物细胞按照分裂能力可 以分为三大类：
第一类是能保持继续分裂能力的 细胞，可以继续不断地分裂，如 骨髓干细胞、各类前体细胞；
第二类细胞群是永久失去分裂能 力的细胞，如各类高度特化的细 胞；
第三类是静止细胞群，即所谓的 G0细胞，在正常情况下，它们 不分裂，也不合成DNA，但在 受到刺激后，则重新进入细胞分 裂。如人的肝脏细胞等。
成纤维细胞型
细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞内呈梭形或不规则 三角形，中央有园形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。 细胞群常连接成网，生长时呈放射状或火焰状。除真正的成纤维 细胞外，心肌、平滑肌、成骨细胞培养时均属这一类型。
游走细胞型 在支持物上分散生
长，不连接成片，细胞胞质常伸出 伪足或突起，呈活跃的游走和变 形运动，速度快而方向不规则。在 一定条件下，可转变为成纤维细胞 型。
二、取材、分离和组织消化 (to draw the materials from tissue，separation ，digestion )
（一）取材——获取组织
原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其 是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的 容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录；
动物细胞在活体内的特性 培养条件下动物细胞生长特性 培养条件下动物细胞生理特性
1. 动物细胞在活体内的特性
在活体内，动物细胞:
增殖 分化
分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有 明显的形态学特征。
如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能； 神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。
③计数：在显微镜下记录计数板四角四个大方格中的活细胞 （不染色细胞）总数。一团细胞按一个细胞计数。压线细胞， 数上不数下，数左不数右。
所用器皿用前严格消毒灭菌，取材时严格无菌操作。
取材方法:
处死动物 → 取出组织块，放入小烧杯中 → 用尖嘴眼科剪刀 将组织块剪碎（1mm3），用吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的碎 块，补加3~5ml Hanks液，用吸管轻轻吹打； →低速离心，弃去上 清液，留下组织块。（也可用手术刀片将组织块切碎，优点：对细 胞损伤较小，缺点是操作时间长，容易污染） → 对某些软组织碎 组织块，可放入注射器玻璃管中或1mm不锈钢/尼龙网筛挤压分离。
动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因 素都会影响动物细胞存活。
动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。
三、动物细胞的环境要求
1. 动物细胞培养的环境要求
1）无污染环境 2）温度
昆虫细胞培养温度一般是25～28℃ 哺乳动物细胞的培养温度一般是37℃。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力 强。如哺乳动物细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件 下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时 后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。
多形性细胞型 某些组织和细胞， 如神经细胞，难以确定它们的稳 定形态，可统归于多形细胞型。
nerve cell
2）非贴壁依赖型
也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液 中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞等均属 于此类，细胞一般呈圆形。
3）兼性贴壁细胞
动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也 可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。
一、动物细胞培养的主要领域及意义
单克隆抗体与现代医学 动物胚胎孵育与畜牧业 动物细胞培养与现代医药业 动物克隆的广泛应用
1.单克隆抗体技术与现代医学
单克隆抗体技术步骤：*
骨髓瘤细胞(myeloma cell)
特定抗原免疫刺激的B
淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合
（2）胶原酶消化(collagenase enzymatic digestion )
①培养瓶中放入1~5mm3大小的碎组织块，加5ml 2000 u/ml的胶原酶溶液，使 终浓度为200u/ml，pH6.5；
②36.5℃水浴24~48h，视情况可适当延长，无需摇动。期间可更换酶液一次； ③见组织块已变软，分散于瓶底时，轻微震荡使散成细胞团或单细胞。小心
第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体
2. 培养条件下动物细胞的生长特性
离体培养的动物细胞可分为：
贴壁依赖型(anchorage-dependent) 非贴壁依赖型(anchorage-independent) 兼性贴壁细胞
1）贴壁依赖型 简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细
胞型、多形性细胞型。
5）渗透压
动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：
培养基的渗透压维持 细胞体内的渗透压维持 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗 透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细 胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。
四、动物细胞培养
基本概念和基本步骤: 取材分离和组织消化 细胞计数 常用培养法 细胞的常规检查 细胞系与克隆 动物细胞的大规模培养 细胞的冻存与复苏
2.胚胎孵育与畜牧业
农畜动物胚胎移植：利用胚胎技术大批量生产优质胚胎，从而可以 降低胚胎成本，扩大移植胚的来源。 体外受精：加快农畜良种化。利用体外受精技术进行核移 植、性别控制和基因导入，工厂化生产遗传性状稳定、生 产性能优良的家畜。
3.动物细胞规模化培养与现代医药
类型 抗体药物 人疫苗 动物疫苗 酶
3）pH
动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8 或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死 亡。 培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一 般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强 的忍耐性。
4）气体环境及溶氧
一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生 长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将 导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外，还应注意培养基 的氧气和CO2的平衡。