基于新型量子点多功能探针的电化学传感器

第二章基于新型量子点多功能探针的电化学传感器1引言在过去的十年，量子点由于其独特的性质和在生物医学的应用而引起人们越来越高的研究兴趣[1]。

自从硅量子点的电致化学发光（ECL）被Bard[2]首次发现后，半导体纳米材料的ECL得到了很大的关注[3,4,5]，基于QD的ECL分析技术已经迅速发展到许多领域[6,7,8]。

在众多的DNA检测技术中，电致化学发光技术具有很多优势，如成本低廉，分析范围广，背景信号低，灵敏度高等，已经广泛应用于生物传感器[9,10,11]。

而且，适体作为单链核酸可以与蛋白质分子或靶细胞特异性结合，近几年，量子点ECL也应用于目标适体检测[12-16]。

然而，基于量子点的ECL信号还不高，迫切需要探索新技术增强量子点的ECL信号。

Dendrimers是高度分支的树枝状大分子，末端具有很多官能团，容易功能化[17,18]。

据报道，树枝状聚合物纳米簇已经合成，并应用于肿瘤细胞的活体检测[19]。

而且，树枝状高分子/ CdSe-ZnS量子点纳米结构也被应用于癌细胞的ECL检测中[20]。

DNA杂交检测在分子生物学、疾病诊断、基因表达研究等领域非常重要[21]。

而且，癌症是当今最紧迫的影响健康的问题。

根据报道，对癌细胞的灵敏监测能提供一种监控疾病发展的简单和有效的方法[22-24]。

因此，研究对癌细胞精确和灵敏的识别和检测对癌症的诊断和治疗具有非常重要的作用。

值得注意的是，近几年基于适体对肿瘤细胞的特异性识别和检测技术已经成为热点研究领域[25-27]。

因此，我们提出了用树枝状量子点纳米簇作为多功能探针，通过电化学和电致化学发光技术检测DNA和癌细胞。

CNTs/ 金纳米粒子以其表面积大、稳定性高、生物活性好等优势成为了固定生物分子的一种可靠的放大平台。

特别是dendrimer/QDs 纳米簇作为信号放大探针应用于电致化学发光和电化学检测DNA和细胞的方法中。

而且，利用磁性纳米粒子固定细胞适体，极大简化了分离过程。

本文提供了一种高灵敏度，高选择性，简便、低损耗的精确检测DNA 和癌细胞的方法和技术。

2实验部分2.1 材料和仪器2.1.1材料所有合成的寡核苷酸均从上海生工生物工程技术服务有限公司（中国）购买。

寡核苷酸的序列如下：表2-1 方案1的DNA序列Table 2-1 The Sequences of the DNA in Scheme 1氧化镉(CdO, 99.99%),醋酸镉(99.9%, powder),硒粉(99.9%, powder), 硫磺(99.9%, powder), 三辛基磷(TOP, 90%), 油酸(OA, 90%), 1-十八烯(ODE, 90%),巯基丙酸(MPA, 99.8%) 和6-巯基-1-己醇(MCH) 是从Aldrich公司购买的。

第五代树枝状高分子聚合物(ethylenediamine core, generation 5)溶剂从Sigma-Aldrich (上海) 贸易有限公司购买的。

乙基-（3-二甲基丙基）碳二亚胺盐酸（EDC）从Sigma购买的。

Fe3O4-Au核壳磁性纳米粒子(MNPs，Fe3O4@Au) (~50 nm)从陕西Lifegen有限公司购买的。

羧基修饰的磁性纳米粒子(~500 nm, 10 mg/mL)和磁力架从天津市倍思乐色谱技术开发中心购买的。

多壁碳纳米管(CNTs, CVD method, purity >95%, diameter 30–60 nm, length 0.5–15 μm)从国药化学试剂公司购买的。

氯金酸(HAuCl4)和柠檬酸三钠从上海试剂公司购买的。

所有的其他试剂均为分析纯。

所有实验均用二次水。

多种pH值的磷酸盐缓冲溶液(PBS, 0.1 M)通过混合不同量的NaH2PO4 and Na2HPO4原液。

细胞：Ramos 细胞和CEM细胞都是从中国医学科学院购买。

细胞是在补充了10 ％胎牛血清（FBS）和100 IU/mL青霉素- 链霉素的RPMI 1640培养基中进行培养。

在每次实验前，用细胞计数器对细胞密度进行测定。

之后，大约一百万细胞分散到RPMI 1640细胞培养基缓冲液中，在3000 rpm下离心5分钟, 三次分散到培养基后，分散到1 mL的细胞缓冲液中。

整个过程，细胞保持在冰浴4 ºC.2.1.2实验装置电化学和电致化学发光信号是用MPI-A电致化学发光分析仪（西安瑞迈电子科技公司），采用三电极系统测得的。

金电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，Pt电极为对电极。

检测过程中，光电倍增管（PMT）的光波长为200-800V，光电倍增管电压为500–800V。

电化学阻抗谱（EIS）用CHI 660C电化学工作站（上海辰华仪器公司，中国），使用与ECL检测相同的三电极系统。

透射电子显微镜图（TEM）是用JEOL JSM-6700F型仪器（日立）记录的。

光致发光谱（PL）是用RF-540型分光光度计（岛津）测得。

场发射扫描电子显微镜（FE- SEM）用JEOL JSM-6700F。

2.2 CdSe-CdS量子点的合成根据文献[28-29]，0.0514 g of CdO，1.066 g 的醋酸镉, 17.6 mmol 油酸和20 mL 十八烯放入到250 ml的圆底烧瓶中。

将混合物加热到150 °C，通氮气除气，进一步加热到300 °C。

在这个温度下，将事先准备好的溶液迅速注射到反应的烧瓶中。

溶液是将0.0315 g 硒粉和0.128 g 硫粉溶解到3mL的三辛基磷中。

注射后，反应烧瓶的温度控制在300 °C保持4~5分钟，然后冷却到室温。

合成的量子点加入20 mL氯仿和过量的丙酮纯化3次，最终重新溶解到甲苯溶液中。

2.3可溶于水的量子点的制备根据文献[30]用巯基丙酸(MPA)替换附着在量子点表面油酸的方法如下：取10 mL分散在氯仿中的量子点加入到100 mL的圆底烧瓶中，向溶液中加入2 mL巯基丙酸。

获得的反应混合物加热到60 o C 1小时，冷却至室温。

用离心机6000 rpm 将包裹巯基丙酸的量子点离心分离出来，用氯仿纯化两次，最终溶解到10 mL pH= 8的二次水中，这样就获得了可溶于水的量子点。

2.4制备PAMAM dendrimer NCs/CdSe-CdS QD-DNA探针根据文献[31]将树枝状纳米簇准备好。

取200μL 2mg/ml 的PAMAM 大分子，通过加入200 μL NHS-PEG-NHS (250 mM 溶解于DMSO)交联6个小时，未交联上的聚合物通过多次洗涤清除。

然后，向100 μL 量子点溶液(pH=7.4 PBS)中加入0.1 M EDC (50 μL) 和0.025 M NHS (50 μL)，对量子点活化1小时。

活化好的量子点溶液与树枝状纳米簇溶液按照3:1的比例进行混合，反应至少2小时后，用离心机4000 rpm离心5分钟。

移去上清液，沉淀再次溶解到200 μL PBS 中。

接着，将200 μL 1.0 × 10-6 M 生物条码DNA (bbc)-DNA和20 μL 1.0 × 10-6 M 探针DNA加入到混合溶液中，温和的搅拌，在37 o C下孵育过夜。

2.5制备可溶性PDDA-CNTs碳纳米管(CNTs)采用在硫酸和硝酸3:1的混合物中超声搅拌3小时的化学方法制得。

获得的CNTs通过离心分离，用蒸馏水反复洗涤，直到pH值为7。

将0.5 mg/mL CNTs 溶解于含0.5 M NaCl 的0.25% PDDA 水溶液中，超声30分钟进行分散，最终获得均匀的黑色悬浊液。

2.6制备用于DNA检测的ECL传感器用于ECL检测DNA和细胞的dendrimer NCs/CdSe-CdS QD探针的制备原理和步骤如下图:图2-1 dendrimer NCs/CdSe-CdS QD探针的制备示意图Figure 2-1 Schematic fabrication procedure of the dendrimer NCs/CdSe-CdS QD probe在砂纸上将金电极（直径为4 mm）用1.0-, 0.3- 和0.05-μm的α-Al2O3抛光粉抛光，用二次蒸馏水冲洗后，进行超声处理。

在电极修饰之前，将裸金电极在0.5 M的硫酸溶液中，在电压–0.2 至 1.5 V之间进行扫描，直到出现稳定的、可重复的循环伏安峰为止。

然后依次用无水乙醇、二次水彻底冲洗电极表面，并用氮气吹干。

接着，将电极沉浸于GNPs溶液中30分钟。

用氮气吹干后，将电极沉浸在1.0× 10-6 M 巯基修饰的cDNA溶液中，室温下过夜，然后在1 mM MCH 溶液中沉浸1.5小时，来封住未被覆盖的金电极表面，从而避免可能发生的非特异性结合。

三明治式的杂交按照以下两步进行操作：首先，修饰了cDNA-的金电极在适当浓度的tDNA溶液中37 °C孵育1.5小时，用0.1 M PBS作为缓冲溶液。

然后，将修饰了tDNA/cDNA/Au的电极拿出来，沉浸在包含有dendrimer NCs-QDs探针的0.1 M PBS缓冲液中，37 °C孵育1小时，这样就得到了用tDNA 制备的三明治结构。

在每一次杂交步骤后，电极都要用0.1 M PBS缓冲溶液进行冲洗，除去非特异性吸附的序列，然后进行ECL测量，检测DNA的浓度。

2.7 ECL 检测将修饰好的电极放入到0.1 M K2S2O8和0.1 M KCl溶液的0.1 M PBS (pH 7.4)中，在0-1.5 V的电压范围内进行扫描。

测量ECL信号与DNA浓度的关系。

2.8 MNPs-probe 生物复合物的制备首先，取20 μL 的Fe3O4@Au MNPs加入到1.5 mL微量离心管中，用500 μL PBS缓冲溶液冲洗三次。

第二，将MNPs分散到pH 为7.4的PBS缓冲溶液中，取50 μL of 1.0 × 10-6 M巯基修饰的适体加入其中。

巯基修饰的适体在加入到Fe3O4@Au之前用TCEP (10 mM)活化1小时。

在室温下轻轻震荡16小时后，适体-Fe3O4@Au共轭物再在溶液(0.3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.2)中老化24小时。

多余的试剂用磁力架清除，接下来加入100 μL dendrimers-QDs-DNA 探针溶液，37o C下孵育2小时即可得到MNPs-探针生物复合物。

2.9细胞的电化学实验MNPs-探针生物复合物放到100 μL含有不同数量细胞的PBS溶液中，室温下孵育50分钟。

接着，从MNPs-探针生物复合物上解除的dendrimer NCs/QDs-探针通过磁力架从溶液中分离出来，用电化学的方法进行检测。