荧光显微镜

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荧光介绍及荧光显微镜的使用

01.
添加标题
二、可见光显微镜的使用
光源在显微镜下方，不需要开汞灯
02.
添加标题
可以观察载玻片上的任何物质
三、成象系统
一．照相机
二．图象采集软件
○ Leica100图象分析软件，把显微镜下看到的图象拍摄下来，保存成图片文件，再进行相关分析。
使用要点
标本制作正确选择滤色镜 200W的超高压汞灯作光源，需预热15
• （五）镜油
• 使用特一制般的暗无视荧野光荧镜光油显，微也镜可和用用上油述镜甘观油察代标替本。时，必须使用镜油，最好
单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）
电泳
01
制胶片
单细胞悬液制备
02
细胞裂解
染色与观察
03
DNA碱解旋
中和
对照组与实验组中肺泡巨噬细胞DNA迁移的实验图象
DAPI+FITC+Texas Red
（二）盖玻片
•
盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。
• （三）标本
• 部影，响而判组物断织镜。切直片接或观其察他到标的本上不部能不太充厚分，激如发太。厚另激外发，光细大胞部重分迭消或耗杂在质标掩本盖下，
• （四）封裱剂
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01. 单击添加标题
02. 单击添加标题
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。
即：物质吸收短波光，发射出的长波光。一种光化荧光
荧光的种类

荧光显微镜的基本原理及应用PPT课件

个性化定制
未来荧光显微镜的发展将更加注重个性化定制，根据不同领域和不同需求，定制特定的光学系统和成像方案，以满足不同用户的需求。
06 参考文献
参考文献
参考文献1
介绍荧光显微镜的基本原理，包括激发光、发射光和滤色片的原理和作用。
参考文献2
介绍荧光显微镜的应用，包括生物学、医学、化学等领域的应用案例和效果。
荧光显微镜的基本原理及应用ppt课件
目录
CONTENTS
• 荧光显微镜简介 • 荧光显微镜的基本原理 • 荧光显微镜的应用 • 荧光显微镜的优缺点 • 荧光显微镜的发展趋势与未来展望 • 参考文献
01 荧光显微镜简介
荧光显微镜的发展历程
01
02
03
荧光显微镜的起源
19世纪末，科学家开始研究荧光现象，并尝试将其应用于显微镜中。
多色观察
荧光显微镜可以同时观察多个荧光标记物的表达，通过不同的荧光颜色来区分不同的标记物。
非破坏性
荧光显微镜观察样本时不会对样本造成破坏，因此可以观察
同一样本的不同层面。
缺点
01
02
03
04
光毒性
荧光显微镜需要使用高强度光源来激发荧光，长时间观察会
对样本造成光毒性损伤。
光漂白
荧光标记物在受到高强度激发光照射时容易发生光漂白，导
环境化学
荧光显微镜用于检测环境中的有害物质和污染物。例如，利用荧光标记的探针检测水体中的重金属离子或有机污染物。
04 荧光显微镜的优缺点
优点
高灵敏度
荧光显微镜能够检测到非常微弱的荧光信号，因此可以用于
观察低浓度的荧光标记物。
高对比度
荧光显微镜能够通过选择合适的激发和发射波长，获得高对比度的荧光图像。

荧光显微镜注意事项

荧光显微镜注意事项荧光显微镜是一种利用荧光性物质发出荧光来观察样品的显微镜。

它在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用。

在使用荧光显微镜时，我们需要注意以下几点：1. 样品的选择：荧光显微镜通常用于观察荧光探针标记的样品。

因此，在选择样品时，需要确保样品中含有与荧光显微镜兼容的荧光探针。

同时，样品的制备也需要注意，避免对荧光性物质的破坏。

2. 荧光探针的选择：不同的荧光探针对应不同的激发波长和发射波长。

在使用荧光显微镜时，需要根据样品和实验需要选择合适的荧光探针。

此外，还需要注意探针的浓度和标记效率，以保证观察到清晰的荧光信号。

3. 激发光源的选择：荧光显微镜的激发光源通常有汞灯、氙灯、LED等。

不同的激发光源具有不同的特点，如波长范围、亮度、稳定性等。

在选择激发光源时，需要根据样品的特性和实验要求进行合理选择。

4. 荧光滤光片的选择：荧光滤光片能够选择性地透过或阻挡特定波长的光。

在使用荧光显微镜时，需要根据荧光探针的激发波长和发射波长选择合适的荧光滤光片，以提高图像的对比度和清晰度。

5. 曝光时间的控制：荧光显微镜在观察样品时，需要适当控制曝光时间。

曝光时间过长会导致荧光信号饱和，而曝光时间过短则会导致荧光信号过弱。

因此，在观察样品时，需要根据样品的荧光强度和背景信号的情况，调整合适的曝光时间。

6. 环境的控制：在使用荧光显微镜观察样品时，需要注意环境的控制。

荧光显微镜对温度、湿度和振动等因素都比较敏感。

因此，在观察样品前，需要确保实验环境的稳定性，避免外界因素对实验结果的影响。

7. 数据分析与图像处理：观察样品后，我们需要对得到的图像进行分析和处理。

这包括荧光信号的定量分析、图像的增强和合成等。

在进行数据分析和图像处理时，需要使用专业的软件，并遵循科学的方法和流程，以确保结果的准确性和可靠性。

荧光显微镜在生物学和材料科学研究中扮演着重要的角色。

在使用荧光显微镜时，我们需要注意样品的选择、荧光探针的选择、激发光源的选择、荧光滤光片的选择、曝光时间的控制、环境的控制以及数据分析与图像处理等方面。

荧光显微镜名词解释

荧光显微镜名词解释
荧光显微镜是一种利用荧光现象观察样品的显微镜。

它通过激发样品中的荧光标记物，然后观察并记录产生的荧光信号。

荧光显微镜相比普通显微镜具有更高的分辨率和增强对细胞和分子结构的观察能力。

在荧光显微镜中，样品通常被标记上荧光染料或与荧光特性的抗体结合，使得样品在受到特定波长的激发光照射后，能够发出特定波长范围的荧光信号。

这些信号通过荧光滤光片和物镜进入显微镜系统，然后被放大和记录。

荧光显微镜常用于细胞生物学、免疫学、神经科学等领域的研究。

它可以用于观察生物样品中的细胞器、蛋白质、核酸等分子结构的位置、表达水平和相互作用关系。

同时，荧光显微镜还广泛应用于医学诊断和药物研发等实际应用中。

荧光显微镜的原理和使用方法

• 细胞内大部分物质经短光波照射后，可发出较弱旳自发性荧光。有些细胞成份与能发出荧光旳有机化合物——荧光染料结合。激发后呈现一定颜色旳荧光，借以对组织进行细胞化学旳观察和研究。
• 2.1 荧光显微镜旳基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号旳不同，构造
各异，但主要构件，基本相同。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小旳表面发出最大数量旳紫外光和蓝光，且光亮度大，光
度稳定。汞灯旳构件，中间为一球形石英玻璃管，有两个钨电极，内充汞滴和少许氩氖混合气体。汞灯装在牢固旳灯室中，有调中、聚焦和集光装置。使用中禁止频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭后，不能立即点亮，经5～10min，汞灯冷却后再通电点亮。
•
HBO200Ｗ汞灯旳发射光谱为200～600nm，
• 视场光阑旳调整使用：视场光阑位于孔径光阑之后，亦由外露手杆操纵。视场光阑用于限定样品表面旳照明区域，其开度一般应与孔径光阑旳开孔相当。
• 辅助激发滤色镜滑动阀旳使用:滑动阀位于镜臂专用槽中，可拉出或推入。有三个挡位供不同使用。全拉出位：供常规使用；中间位：用于Ｂ激发法，辅助滤色镜进入光路；全推入位：用作光阀，阻断全光线．
• 某些物质经波长较短旳光线照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长旳光能形式辐射出来，这种波长长于激发光旳可见光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后可直接发出旳荧光，称为自发荧光（如叶绿体中旳叶绿素分子受激发所发出旳火红色旳荧光）；本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出旳荧光称为次生荧光。常用旳荧光染料涉及丫啶橙、荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。

荧光显微镜原理及应用实验原理及步骤

实验三荧光显微镜原理及应用
一、实验原理：1852年 Stokens发现当以短波光照射某些物质时，这些物质就会发出较长的光波，称之为荧光。

当某一物质的外层电子接收到能量相当时的光量子后，这个电子就会从能级较低的电子层跃迁到能级较高的电子层（激发态），但激发态是不稳定的，大约经过10ˉ8秒，电子就会以辐射光量子的形式释放能量而回到原来的稳定状态，辐射的光量子就是光（如图），因为能量还有一部分是以热能的形式散发的，所以荧光光波比激发的光波长。

动物细胞内的大部分成分经激发光波激发后，可以发出淡蓝色的荧光，植物叶绿素等经激发光照射后发出血红色荧光。

这种现象称为自发式荧光，或直接荧光。

有些细胞成分与发荧光的有机物——荧光染料结合后，而具有发荧光发能力，这种荧光成为间接荧光或次生荧光。

除少数物质具有较强的自发荧光外，大多数细胞的自发荧光否很弱，不能满足实际工作的要求，现在比较广泛利用的是间接荧光，获得间接荧光的方法有两种：
[1].荧光染色法：利用荧光染料使细胞或组织着色，它和细胞内不同成分结合后可发出一定波长的荧光。

对于不同的组织或细胞组分，目前已成立了一些有效的荧光染色方法，如显示粘蛋白成分的荧光RAS反应显示类脂质磷化氢3R荧光染色法，显示染色体分带的Q带技术等，可选用不同的方法研究不同的细胞成分。

荧光显微镜的分类

荧光显微镜是一种使用荧光物质和特定波长的光源来观察样本的显微镜。

荧光显微镜可以分为以下几类：1. 荧光透射显微镜（Fluorescence Transmission Microscope）：这是最常见的荧光显微镜类型，它使用荧光染料标记样本，然后通过照射特定波长的光源来激发荧光染料，并通过透射光来观察样本。

2. 荧光反射显微镜（Fluorescence Reflection Microscope）：在这种类型的显微镜中，光源从上方照射样本，而观察是通过检测反射光中的荧光信号来进行的。

这种方法适用于厚样本或需要从不同角度观察的样本。

3. 荧光共聚焦显微镜（Fluorescence Confocal Microscope）：共聚焦显微镜使用一个或多个pinholes（小孔）来聚焦样品的光线，并只允许来自特定平面的光通过，这样可以获得清晰的、无层叠的图像。

这种显微镜非常适合观察厚样本或想要获取深层结构的样本。

4. 荧光扫描显微镜（Fluorescence Scanning Microscope）：这种显微镜通过扫描光源和探测器在样本上移动，以获取整个样本区域的荧光信息。

这种方法可以用于获取高分辨率的图像，但可能需要较长的成像时间。

5. 荧光点扫描显微镜（Fluorescence Point Scanning Microscope）：这种显微镜通过逐点扫描样本来获取图像，每个点的光源和探测器都非常接近，因此可以获得高分辨率的图像。

这种方法通常用于成像较小的样本或特定区域。

6. 实时荧光显微镜（Real-time Fluorescence Microscope）：这种显微镜可以实时观察样本的荧光变化，非常适合观察动态过程，如细胞呼吸、细胞通信等。

每种类型的荧光显微镜都有其特定的应用和优势，选择合适的荧光显微镜取决于研究的需求和样本的特性。

荧光显微成像系统的原理及构成

荧光显微成像系统的原理及构成1.荧光染料：荧光显微成像系统通过荧光染料标记目标物体，使其发出荧光信号。

荧光染料通常是天然或合成的荧光性物质，其分子结构含有色团和荧光基团。

当荧光染料被激发光波长的光线照射后，其激发态电子跃迁至激发态，并在短时间内回到基态，释放出发射光子，形成荧光信号。

2.荧光显微镜：荧光显微成像系统使用荧光显微镜进行成像，荧光显微镜由光源、物镜、筛片轮、探测器等组成。

光源通常是弧光灯或LED，用于产生激发荧光染料所需的光的波长。

物镜具有高放大倍数和数值孔径，用于聚焦和收集荧光信号。

筛片轮可根据荧光染料的激发光波长进行选择，以过滤非目标光。

探测器可以收集和记录荧光信号，并进行图像处理与分析。

3.激发光源：激发光源是荧光显微成像系统的重要组成部分，用于产生适当波长的激发光，激发荧光染料发出荧光信号。

常见的激发光源包括白炽灯、汞灯、激光器和LED等。

不同的激发光源具有不同的波长和强度，可根据需要进行选择。

4.探测器：探测器用于收集和记录荧光信号，常见的荧光显微成像系统探测器包括光电倍增管、CCD相机和CMOS相机等。

其中，光电倍增管用于接收低强度的荧光信号，并通过电子放大将其转换为电信号；CCD相机和CMOS相机具有高灵敏度和分辨率，能够实时采集图像并记录。

1.样品台：样品台是放置生物样品的平台，通常由固定夹持装置和控制台组成。

固定夹持装置用于固定样品的位置，确保样品在成像过程中不移动或晃动。

控制台用于调节样品台的位置和倾角，以便选取最佳的成像角度。

2.激发系统：激发系统包括激发光源和筛片轮等组件，用于产生适当波长的激发光。

激发光源通常位于显微镜的下方或侧面，经由物镜进入样品。

筛片轮可根据需要选择不同的激发光波长，以过滤非目标光。

3.探测系统：探测系统包括物镜、滤光片和探测器等组件，用于收集和记录荧光信号。

物镜通过调节焦距和数值孔径，在样品上聚焦并收集荧光信号。

滤光片用于过滤非目标光，减少背景干扰。

荧光显微镜使用方法说明书

荧光显微镜使用方法说明书一、概述荧光显微镜是一种用于观察和研究荧光材料的显微镜，其原理是通过荧光标记技术使样品发出特定波长的荧光，以增强对样品的观察和分析能力。

本使用说明书将详细介绍荧光显微镜的使用方法，帮助用户正确操作和维护仪器。

二、仪器配置与组装1. 基本配置荧光显微镜主体部分包括显微镜主体、荧光照明系统、像差校正系统等。

除此之外，还需要配备适当的滤光片、显微镜物镜、光源等附件。

2. 组装步骤a) 将荧光显微镜主体放置于平稳的工作台上，确保镜筒与显微镜架正常插入。

b) 连接荧光照明系统，确保光源与显微镜主体之间的连接牢固。

c) 安装所需滤光片和物镜，注意正确对准并轻轻旋固定。

三、荧光显微镜的使用方法1. 准备样品根据实验需求，准备好要观察的荧光标记样品。

样品应进行适当的处理和固定，以确保观察结果的准确性。

2. 调节光源与荧光照明a) 打开荧光照明系统，并调节合适的光源亮度和荧光照射时间。

b) 使用滤光片，选择合适的荧光激发波长，避免背景干扰。

3. 调节对焦与镜头切换a) 通过转动焦距调节手轮，将样品调至清晰可见。

b) 利用显微镜附件，如镜筒切换器、滤光片切换器等，按需切换并调整观察条件。

4. 图像采集与分析a) 连接相应采集设备，如相机、计算机等。

b) 在合适的荧光激发条件下，采集样品图像，并进行相关的分析和处理。

四、维护与保养1. 日常维护a) 避免直接日光照射，保持仪器干燥清洁。

b) 注意使用时避免碰撞以及接触腐蚀性物质。

c) 定期清理镜头、滤光片等附件，并保持其表面光洁度。

2. 镜头保养a) 使用专用镜头纸轻轻擦拭，避免使用过于湿润或有腐蚀性的物质。

b) 镜头不使用时，应盖上防尘罩，并存放在干燥通风的地方。

3. 故障排除在使用过程中，如发现显微镜工作异常或出现故障，请参照用户手册进行故障排除或联系售后服务人员。

充分了解荧光显微镜的使用方法，能够帮助您更好地进行荧光标记实验，提高实验效果和研究成果的可靠性。

荧光显微镜详解

荧光显微镜的使用
森林生物工程黄雅婷
目录
一、荧光显微镜成像原理二、荧光显微镜的优点及应用三、荧光显微镜的基本构造四、荧光显微镜的使用五、使用荧光显微镜注意事项六、荧光镜检样品的制作注意事项七、荧光强度计算
2020/9/23
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一、荧光显微镜成像原理
某些物质在一定短波长的光(如紫外光等)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时, 就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(可见光)，这种光就称为荧光。
荧光显微镜是利用一个高发光效
率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。
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二、荧光显微镜的优点及应用
优点：
1.检出能力高，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高（放大作用） 2.对细胞的刺激小（可以活体染色） 3.能进行多重染色等
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六、荧光镜检样品的制作注意事项
1. 不能使用本身能产生荧光的药剂 2. 切片标本不能太厚 3. 因石蜡可产生青色荧光，采用石蜡制片时，脱蜡必须彻底。切片进入水后，应充分水洗，再经荧光染料处理。 4. 最好采用萤石玻璃制成的载玻片、盖玻片。 5. 封片时可采用甘油等无荧光的封固剂。
３、检测时间每次以1h为宜，超过90min，高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本经激发15min后，荧光亦明显减弱。标本染色后立刻观察，因存放时间太久，荧光会逐渐猝灭。可将染好色的标本用黑纸包好，存放在聚乙烯塑料袋中，4℃ 保存，可延缓荧光的猝灭时间。
4、荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命有限，标本应集中检查，节省时间

荧光显微镜基本构造

荧光显微镜基本构造
荧光显微镜是一种特殊的显微镜，它利用物质在受到紫外光的激发后发出荧光的特性来观察样品。

其基本构造包括以下部分：
1. 光源：荧光显微镜一般使用高压水银灯或氙灯作为光源，它们能够产生波长在紫外光范围的光线，激发样品发出荧光。

2. 过滤器：荧光显微镜内置多个滤光片或滤光器，用于选择性地通过或阻挡不同波长的光线。

常用的滤光片有激发滤光片和荧光滤光片。

3. 物镜：荧光显微镜的物镜是专门设计的，能够对激发和荧光光线进行聚焦和收集，以提高图像的亮度和清晰度。

4. 激发系统：激发系统是荧光显微镜的一个重要组成部分，它包括聚光镜、凸透镜和反射镜等，用于将光源发出的紫外光线聚焦在样品上。

5. 荧光滤镜轮：荧光显微镜通常配备一个荧光滤镜轮，用于在不同的观察中选择合适的激发光和荧光光线的滤镜。

6. 荧光检测器：荧光显微镜的荧光检测器能够接收样品发出的荧光信号，并将其转化为电信号。

7. 显示器和图像采集系统：荧光显微镜通常配备显示器和图像采集系统，用于显示和记录荧光显微镜观察到的图像。

以上是荧光显微镜的基本构造，不同型号和用途的荧光显微镜可能会有一些差异。

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜使用方法荧光显微镜是一种用于观察荧光物质的显微镜，它利用物质受激发后发出的荧光来进行观察和分析。

荧光显微镜在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用，下面我们来详细了解一下荧光显微镜的使用方法。

1. 样品准备。

在使用荧光显微镜之前，首先需要准备好待观察的样品。

样品的准备包括固定、染色等步骤，确保样品的完整性和清晰度。

在进行染色时，需要选择适合的荧光染料，以便观察到清晰的荧光信号。

2. 调节荧光显微镜。

接下来是调节荧光显微镜的步骤。

首先要打开显微镜的电源，然后调节照明系统，确保样品能够受到足够的激发光。

接着调节物镜和目镜，使其对焦并调整放大倍数，以获得清晰的观察效果。

3. 观察样品。

当荧光显微镜调节好后，就可以开始观察样品了。

在观察过程中，要注意调节荧光滤光片，以选择合适的激发光和荧光信号的观察。

观察时要避免光线干扰，保持观察环境的暗度，以获得清晰的荧光图像。

4. 图像记录与分析。

观察到感兴趣的荧光信号后，可以进行图像记录与分析。

使用相机或者荧光成像系统，记录下清晰的荧光图像。

接着可以利用图像分析软件进行图像处理和分析，以获取更多的信息和数据。

5. 仪器保养。

在使用完荧光显微镜后，要进行仪器的保养工作。

包括清洁镜头、调整光路、关闭电源等步骤，确保仪器的正常运行和延长使用寿命。

总结。

荧光显微镜的使用方法并不复杂，但需要注意细节和步骤的顺序。

正确的使用方法可以帮助我们获得清晰的荧光图像，从而更好地进行观察和分析。

希望本文对您在使用荧光显微镜时有所帮助，谢谢阅读！。

荧光显微镜的原理和使用方法

详细描述
激光共聚焦扫描显微镜采用激光作为激发光源，具有高分辨率和高灵敏度，能够观察细胞内细微结构和动态过程。它通过逐点扫描样品，获得高清晰度的图像，特别适合观察细胞骨架、线粒体和内质网等结构。
多光子荧光显微镜
总结词
一种非线性光学成像技术，适用于观察活体动物和组织。
详细描述
多光子荧光显微镜采用多光子激发技术，能够在不损伤样品的情况下获得高分辨率和高对比度的图像。它通过使用脉冲激光和光子计数检测器，能够观察活体动物和组织中的荧光标记物，特别适合用于神经科学和生物学等领域的研究。
Hale Waihona Puke 谢谢观看光源提供特定波长的激发光，通常为紫外光或蓝光。
样品
放置待观察的荧光样品。
目镜或摄像系统
观察或记录荧光图像。
荧光物质和激发光
荧光物质
某些物质在吸收激发光后，会发出特定波长的荧光。
激发光
用于激发荧光物质的特定波长光线。
荧光产生的原理
01
当荧光物质吸收激发光时，电子从基态跃迁至激发态。
02
激发态的电子不稳定，会释放能量并返回到基态，同时发出荧光。
03
荧光显微镜的使用方法
荧光显微镜的安装和调试
安装
荧光显微镜应放置在平稳的工作台上，确保电源和光源的连接稳定。
调试
调整显微镜的焦距和光源亮度，确保图像清晰可见。
荧光样品的制备
荧光染料选择
根据观察目标选择合适的荧光染料，如FITC、TRITC等。
样品处理
将荧光染料与样品混合，进行染色处理，然后洗涤和干燥。
，进行相应的调整。
使用注意事项
01 使用前先了解操作规程，遵循操作步骤，避免因误操作导致仪器损坏。

荧光显微镜的基本原理及应用

2 荧光淬灭(光漂白)：激发光长时间照射会发生荧光
减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射标本。 3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（最好不要短时间内反复开关，标本应集中观察。）
2.药物筛选
荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针
八、使用注意事项
1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。
A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2)
三、荧光显微镜的操作
(1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点击数码成像系统软件，采集数码图像。
四、荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍需要的分光镜组件：“O”为观察透射光时用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如 DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如 FITC)；“WG"为观察红色荧光时用(如 TRITC)。
(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)。

荧光显微镜

光源
滤光片
• 激发滤光片：紧靠光源 UV:340-380nm 色玻璃 V:390-460nm 种类： B:460-500nm 干涉滤色片 G:500-570nm • 截止滤光片：物镜与目镜间
阻断(或压制)滤光片：
• 吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛。 • 选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。
组成
• 光源：高压汞灯或卤素灯。 • 聚光镜：因为物镜作为聚光镜，所以不需要聚光镜。 • 物镜：所用的物镜必须能透过足够的紫外光，而且本身不产生荧光，对数值孔径没有限制。 • 标本：厚的标本或不透明的标本都能观察。
• • • •
汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜
荧光显微镜下的丝状细菌
•
在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。
•
荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，不是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。
• 荧光显微镜的基本构造：
•
•
•
４．检查时间每次以1h为宜，超过90min，高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本经激发15min后，荧光亦明显减弱。
５．荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命有限，标本应集中检查，节省时间；汞灯应避免多次开启，最好避免在半小时内开关。
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６．标本染色后立刻观察，因存放时间太久，荧光会逐渐猝灭。可将染好色的标本用黑纸包好，存放在聚乙烯塑料袋中，4℃保存，可延缓荧光的猝灭时间。
反射荧光显微镜原理

荧光显微镜的分类

荧光显微镜的分类全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：荧光显微镜是一种利用荧光现象观察样品的显微镜。

它通过激发荧光染料或标记的样品发出的荧光来实现对样品的观察和分析。

荧光显微镜在生物学、医学、生物化学、物理化学、材料科学等领域都有着广泛的应用。

根据不同的工作原理和结构特点，荧光显微镜可以分为不同的分类。

一、荧光显微镜的种类分类1. 常规荧光显微镜：常规荧光显微镜是最常见的一种荧光显微镜，它通常用于标记染色的生物样品的观察。

常规荧光显微镜具有高分辨率和灵敏度，能够观察到细胞和亚细胞结构的细节。

常规荧光显微镜通常配备有激光或LED光源、荧光滤光片和荧光探测器等部件。

2. 透射式荧光显微镜：透射式荧光显微镜是一种能够观察厚样品的荧光显微镜，适用于生物样品和材料样品的观察。

透射式荧光显微镜具有较大的工作距离和透射深度，能够观察到厚样品的整体结构和荧光信号分布。

3. 共焦荧光显微镜：共焦荧光显微镜是一种具有三维荧光成像能力的高级荧光显微镜，通常用于观察生物样品的三维结构和动态过程。

共焦荧光显微镜采用共焦成像技术，能够在不同深度对样品进行扫描成像，获得高分辨率的三维荧光图像。

4. 荧光瞬时成像显微镜：荧光瞬时成像显微镜是一种用于观察快速动态过程的荧光显微镜，通常用于观察细胞内信号传导、蛋白质交互作用等过程。

荧光瞬时成像显微镜具有高速成像和高灵敏度的特点，能够实时捕捉生物样品的瞬时变化。

5. 荧光共振能量转移显微镜：荧光共振能量转移显微镜是一种用于研究蛋白质相互作用和分子结构的荧光显微镜，通过荧光共振能量转移原理实现对分子间能量传递的观察。

荧光共振能量转移显微镜能够实现高分辨率的分子成像，为分子生物学研究提供重要工具。

1. 单光子激发荧光显微镜：单光子激发荧光显微镜是一种采用单个激光光子来激发荧光的显微镜，通过控制激光光子的能量和强度实现对样品的高分辨率成像。

单光子激发荧光显微镜具有高灵敏度和较小的光损伤，适用于对活细胞和生物标记的观察。

荧光显微镜放大倍数与标尺

荧光显微镜放大倍数与标尺荧光显微镜是一种利用荧光技术观察样品的显微镜。

它的放大倍数与仪器本身的设计有关，同时也与使用的镜头、物镜、目镜等有关。

标尺是用来测量显微镜观察到的物体的大小和距离的工具。

下面是荧光显微镜放大倍数与标尺相关的内容。

一、荧光显微镜放大倍数荧光显微镜的放大倍数是指物体在显微镜下观察到的图像相对于实际尺寸的放大倍数。

放大倍数一般可以分为两种：目镜放大倍数和物镜放大倍数。

1. 目镜放大倍数：目镜是位于显微镜顶部的镜筒，通常用来放大显微镜的视场。

目镜放大倍数通常为10倍、20倍或者40倍等。

目镜放大倍数越高，观察到的物体越大。

2. 物镜放大倍数：物镜是位于显微镜底部的镜筒，用于放大被观察样品的细胞和结构。

物镜放大倍数一般有4倍、10倍、40倍、60倍、100倍等。

物镜放大倍数越高，观察到的细胞和结构越清晰、更详细。

荧光显微镜的总放大倍数等于目镜放大倍数乘以物镜放大倍数。

例如，若目镜放大倍数为10倍，物镜放大倍数为40倍，则总放大倍数为400倍。

二、标尺标尺是一种用来测量长度、宽度和距离的工具。

在荧光显微镜中，标尺常用于测量样品观察图像上的物体大小或者样品中不同物体之间的距离。

1. 目测标尺：目测标尺是一种常见的标尺，它在显微镜的视场中提供了已知长度的刻度线。

通过目测标尺能够大致估计物体的大小和距离，但精度较低。

2. 单位标尺：单位标尺是一种精确的标尺，它在显微镜的视场中提供了已知长度的刻度线，并且将刻度单位明确指示。

例如，单位标尺可以是以毫米、微米或者纳米为单位的刻度线。

使用单位标尺时，可以通过计算已知刻度和样品图像上的刻度之间的比例关系来计算样品上物体的实际大小和距离。

在使用荧光显微镜进行观察时，我们可以通过测量标尺上的刻度与观察到的物体在显微镜视场中的刻度之间的比例关系来计算物体的实际大小和距离。

这样的测量方法可以在精确定量分析和实验数据记录中提供准确的参考。

综上所述，荧光显微镜的放大倍数与目镜放大倍数和物镜放大倍数相关。

荧光显微镜操作说明

荧光显微镜操作说明荧光显微镜（Fluorescence Microscope）是一种用于观察荧光标记生物分子的显微镜。

荧光显微镜具有高灵敏度和高分辨率的特点，适用于细胞生物学、分子生物学、微生物学、免疫学等领域的研究。

本操作说明将介绍荧光显微镜的基本结构、操作步骤以及一些常见的注意事项。

一、荧光显微镜的基本结构荧光显微镜主要由以下几个部分组成：1. 光源系统：荧光显微镜通常使用荧光灯作为光源，荧光灯发出的紫外光经过滤波器后被用于激发样品中的荧光发射。

2. 物镜系统：荧光显微镜使用高倍物镜进行观察，一般有10x、20x、40x、60x、100x等不同倍率的物镜，可以根据需要选择合适的物镜进行观察。

3. 荧光滤光片组：荧光滤光片组由激发滤光片、切分镜和发射滤光片组成，用于选择特定波长的激发光和荧光发射光，以增强信号和抑制背景噪音。

4. 检测系统：荧光显微镜的检测系统包括物镜、光学透镜、眼镜和CCD相机等，用于接收和记录荧光发射的图像。

二、荧光显微镜的操作步骤1. 准备样品：将待观察的样品制备好，可以是细胞、组织或标记了荧光染料的生物分子。

确保样品放置在适当的载玻片上，并加上合适的封片或封装剂。

2. 打开荧光显微镜：首先，确认荧光灯是否打开并运行正常。

然后，按下启动按钮，打开荧光显微镜的电源。

3. 调节照明：调节照明系统以获得适当的亮度和对比度。

根据样品的需要，可以调整照明强度和滤光片的位置。

4. 切换滤光片：根据样品的特点和所需的荧光发射波长，选择合适的激发滤光片、切分镜和发射滤光片。

确保滤光片的位置正确，以获得所需的荧光发射信号。

5. 调节焦距和倍率：使用适当倍率的物镜进行观察，并通过调节焦距和对焦机构以获得清晰的图像。

如果需要更高的放大倍率，可以更换为更高倍率的物镜。

6. 观察样品：将载玻片放置在显微镜的样品台上，并通过移动样品台和调整操纵旋钮来观察样品。

使用眼镜或连接到计算机的CCD相机来记录荧光发射的图像。

荧光显微镜工作原理

荧光显微镜工作原理
荧光显微镜是一种利用荧光现象观察样品结构和特性的显微镜。

其工作原理主要包括刺激和感应两个过程。

刺激过程：荧光显微镜通过激发样品中的荧光分子发射荧光。

刺激光源通常使用紫外线或蓝色光来激发样品中的荧光分子。

激发光束通过物镜系统和荧光过滤器到达样品，激发样品中的荧光分子产生激发态。

激发光束通过荧光筛选器选择性地激发特定波长范围内的荧光分子。

感应过程：感应过程是观察和记录荧光显微镜中样品发出的荧光。

样品中的激发态荧光分子会自发地回落到基态并发射出荧光。

这些荧光通过物镜系统的放大和聚焦，然后通过目镜或摄像机进行观察和记录。

在荧光显微镜中，还可以使用荧光探针来增强样品的荧光信号。

荧光探针是一种特殊的染料，可以与样品中的特定分子结合，通过改变荧光分子的环境来改变荧光信号的强度和颜色。

总的来说，荧光显微镜的工作原理是通过激发样品中的荧光分子发射荧光，并通过增强荧光信号的方式观察和记录样品的结构和特性。

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荧光显微镜讲授流程：1、构造2、原理3、发展史荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具,它是光学显微镜的一种。

它除了具有光学显微镜的基本结构和光学放大作用外,基于荧光的特性,还具备以下独特的功能要求:(1)提供足够能量的能激发出荧光的光源。

(2)有着适应不同物质所需的激发光谱一组滤色片,从光源中选择合适的激发光谱,使析出的光谱与该物质的吸收光谱重合,以期望获得最大的荧光。

(3)为获得较弱的荧光图像,还要建立一套截止滤色片,它使所需观察的荧光进入系统成像,而将其余的光波,包括发射光阻挡在外,用来提高图像的衬度。

(4)放大的光学系统应适应荧光的特性,最终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨力的良好衬度的荧光图像。

(5)仪器的安全性。

应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸,保证电器安全。

滤色片初期用贮放玻璃盒中的有色液体,后改用带色胶质片,由于易变色和使用不方便已被淘汰。

现在经常使用的为色玻璃和干涉滤色片,色玻璃大都属宽波带滤色片,透过波段宽,透过率随厚度而降低,价格相对低廉。

由于色玻璃与空气的界面上,约有4%光线被反射掉,玻片愈多,光能损失愈大,限制了它的使用性能。

干涉滤色片的出现,可按需要制成能透过或截止一定波段的滤色片,从而促使荧光显微术的进展,现代技术上已能对某波段的透射率或反射率进行控制。

荧光显微镜的应用1.在环境中检测已知微生物，制作相应的带有荧光素的抗体，进行标记、定位（免疫荧光技术）对病原微生物的检测有意义--- 梅毒密螺旋体2.荧光显微镜下的细胞增殖（超链接--视频）3.选用不适合同的荧光染色剂，对同一视野下的样品进行染色（复杂环境下）4. 荧光显微镜在各领域中的应用都非常广泛,在植物细胞的观察研究中,通过染色可以更清晰地观测到细胞的形态及结构。

在实验中发现,荧光显微镜还可以直接(不做任何处理)观察植物叶的气孔器,而且能观察到气孔的变化情况,为荧光显微镜找到了一种新用途。

5. 20世纪30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。

如用抗酸菌荧光染色法可帮助人们在痰中找到结核杆菌。

40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术,这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中,可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体,可用以探讨病因及发病机理,如肾小球疾病的分类及诊断,乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等6.在植物细胞凋亡机理的研究中对线粒体进行染色后,用荧光显微镜能够很清晰地观察到活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

利用荧光标记技术显示微管,可以在多种植物生殖细胞内清楚地看到微管骨架的存在7.在紫外光激发下,叶绿体发出火红色荧光,气孔发绿色荧光,保卫细胞呈黄色或黄绿色,且形状大小非常清晰,两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。

表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少,所以在荧光显微镜下看不到表皮细胞。

通过大量试验证明,单子叶,双子叶,裸子植物大都适用于这种方法而且效果较好。

荧光显微镜基本形式有两种:透射式和落射式。

透射式如图8所示,它由光源(HL)、激发滤色片(EF)和照明系统供给激发光。

图中用暗场聚光镜(DC)将光束会聚在切片(P)上,由物镜(OB)将荧光物成像于像面上,截止滤色片(SF)吸收被切片衍射的杂散激发光,仅透过荧光到目镜(OC)。

DC—暗场聚光镜; OB—物镜; SF—截止滤色片; OC—目镜。

图8透射荧光显微镜透射式备有明场聚光镜和暗场聚光镜。

明场聚光镜很少直接用于荧光检测中,常用来搜索目标,寻找或挑选切片需要的区域,这是费时的工作,不宜用强度极高的光去完成,否则会出现衰减甚至猝灭,当仪器配备高质量短波通干涉滤色片激发时,用明场聚光镜,在调节可变光适当时,也可获得满意的荧光图像。

暗场聚光镜在透射荧光中是必备的,由于使用暗场聚光镜激发光不会进入物镜,背景呈“暗”色,使荧光衬度大大提高。

荧光中应用的暗场聚光镜材料应选用自发荧光少的硝酸盐,并且能透过紫外线的材料。

图9所示是一种心形暗场聚光镜,它的心脏形反射面将光线高度会聚成一“点”,聚光镜的性能可用下式表征。

E=KõP(NA2max-NA2min)K为透过率。

可见其性能取决于聚光束最大数值孔径与最小数值孔径的平方差,差值愈大,性能愈优越。

暗场是用中空的光锥激发切片的荧光物,为得到稳定的荧光图像,聚光镜的调节机构(对中和调焦)应稳定可靠,可多次重复照明条件。

另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm～1mm之间才获得暗场效应,这是因为受到暗场光锥顶点深度的限制。

好的暗场聚光镜,1.2mm的厚切片也能使用。

图9心形暗场聚光镜落射式如图10所示。

它将激发光由二向色分光镜(DM)反射通过物镜射至切片上激发荧光物。

二向色分光镜能通过物镜收集荧光。

截止滤色片吸收激发光谱的反射光让荧光色透过从目镜中观察。

DM—二向色分光镜图10落射荧光显微镜二向色分光镜是落射式关键部件,它是多层膜干涉滤色片,与主光路呈45°安置,它的光谱特性如图11所示。

该曲线竖轴为透过率,横轴为波长,其反射率可用100%与透过率差值求得,从380nm～400nm的波长(青色)约90%反射,520nm以上的光波从(黄至红色)透过。

以50%的反射率时的波长作为表征,如该曲线为500nm,记为DM-500。

图11二向色镜透射曲线图12落射照明光路各个分色镜还应建立相应的激发和截止滤色片,以满足不同的需要。

滤色片(包括二向色分镜)的设置与组合是荧光显微镜设计中一个重要的课题,它与荧光术的应用密切相关。

落射式激发光通过物镜垂直自上而下照明切片上表面,故又称为垂直照明器,它采用柯勒照明系统。

光源经集光镜大致成平行光束,为利用光能,增大包容角,用隔热玻璃吸收热线,聚光镜使光源成像于孔径光阑上,并使它与物镜后焦面重合,所以经物镜出射激发光束为平行光均匀投射到切片上。

要注意的是仪器配备的所有物镜均应达到此要求。

这两种基本形式,各有特点和使用价值。

对于落射式:(1)物镜兼作聚光镜,就没有聚光镜的定中与调焦问题,而且物镜的数值孔径随倍率而增大,荧光图像亮度也随之提高;(2)激发光不必透过载玻片,因而减少损失,而且激发光与荧光对物镜而言方向相反,分得很开不可能产生互相干扰,就是有部分反射激发光进入物镜后也被二向色分光镜反射至光源,仅有极小部分透过,使截止滤色片负担小,可制成较薄的片;(3)用透射式激发时,大部分荧光产生于切片底部,必须透过切片射出,而且还会产生散射。

而落射照明和观察面在同一表面,荧光图象亮度毫无损耗,而且对象质也无影响,特别对厚的切片,如菌落和组织培养等更具有独特的功能;(4)落射荧光的物镜因要通过紫外区光谱,因此必须要考虑紫外段的透过率,为此专门研制UV-F透紫外区荧光物镜系列,而透射式则不必。

对于透射式,在UV,U激发时一般用优良的消色差物镜即可,在可见光B与G激发时,用半复消色差或复消色物镜最为合适,用齐明物镜也可以,虽然齐明物镜象场不平,然而高倍物镜用于对边缘分辨力要求不高的试样。

一般中等以下倍率,干物镜适用于暗场照明。

高倍率的浸液物镜不适合暗场照明,因为暗场聚光镜照明锥光束会进入物镜。

浸液式物镜比干镜头更适宜作落射照明,因为空气—玻璃界面反射光远比玻璃—浸液界面反射光多。

对于目镜没有特殊要求。

由两种基本形式组合,具有更大机动性,适应各种研究需要。

图13(a)(b)中透射(明场或暗场)用来搜索定位,也可以用来比较荧光部位和不发荧光部位的细微结构;(d)和(e)也有相同的功能。

(d)中使用相衬时,要用相衬物镜,交替进行荧光观察和相衬观察,进行比较;(e)中偏光观察适用于双折射物质,(c)中落射荧光和透射荧光的组合适用于双重染色,如同时进行FITC和TRITC双重染色,则可用落射观察TRITC,用透射观察FITC标识过的部位。

·28·光学仪器第23卷另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm～1mm之间才获得暗场效应,这是因为受到暗场光锥顶点深度的限制。