荧光显微镜

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荧光显微镜简单操作流程

荧光显微镜简单操作流程

荧光显微镜简单操作流程

1.打开荧光显微镜的电源,等待其预热。

Turn on the power of the fluorescence microscope and wait for it to warm up.

2.调节显微镜的放大倍数,使样本清晰可见。

Adjust the magnification of the microscope to make the sample clearly visible.

3.将待观察的样本放置在显微镜的载物台上。

Place the sample to be observed on the stage of the microscope.

4.调节载物台的高度,使样本处于合适的焦距。

Adjust the height of the stage to bring the sample into focus.

5.打开荧光灯,并调节其亮度,使样本发出荧光。

Turn on the fluorescence lamp and adjust its brightness to make the sample emit fluorescence.

6.通过目镜观察样本的荧光表现。

Observe the fluorescence of the sample through the eyepieces.

7.如果需要,可以使用滤光片来调节荧光显微镜的观察条件。

If necessary, use the filters to adjust the observation conditions of the fluorescence microscope.

荧光显微镜名词解释

荧光显微镜名词解释

荧光显微镜名词解释

荧光显微镜是一种利用荧光现象观察样品的显微镜。它通过激发样品中的荧光标记物,然后观察并记录产生的荧光信号。荧光显微镜相比普通显微镜具有更高的分辨率和增强对细胞和分子结构的观察能力。

在荧光显微镜中,样品通常被标记上荧光染料或与荧光特性的抗体结合,使得样品在受到特定波长的激发光照射后,能够发出特定波长范围的荧光信号。这些信号通过荧光滤光片和物镜进入显微镜系统,然后被放大和记录。

荧光显微镜常用于细胞生物学、免疫学、神经科学等领域的研究。它可以用于观察生物样品中的细胞器、蛋白质、核酸等分子结构的位置、表达水平和相互作用关系。同时,荧光显微镜还广泛应用于医学诊断和药物研发等实际应用中。

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜是一种广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域

的高级显微镜。它通过激发样品中的荧光染料,使其发出可见光,

从而观察和分析样品的细胞结构、蛋白质分布和荧光标记等信息。

本文将介绍荧光显微镜的使用方法,希望能够帮助您更好地进行实

验和研究。

1. 样品准备。

在使用荧光显微镜之前,首先需要准备样品。样品的准备工作

包括固定、染色和装片等步骤。在固定样品时,需要选择合适的固

定液和固定时间,以保持样品的形态和结构。染色是为了使样品中

的特定成分能够发出荧光,常用的染色剂包括DAPI、FITC和TRITC 等。在装片时,需要将样品放置在载玻片上,并加入适量的缓冲液,然后覆盖一张封片玻片。

2. 仪器准备。

在进行荧光显微镜观察之前,需要对显微镜进行适当的准备工作。首先需要打开显微镜的电源,并调节亮度和对比度,使样品能

够清晰可见。然后需要选择合适的物镜和滤光片,以获得所需的放

大倍数和荧光波长。在使用荧光显微镜时,需要注意避免光源直射

样品,以免损坏荧光染料和样品。

3. 观察操作。

在进行荧光显微镜观察时,需要注意以下几点操作。首先,需

要将装有样品的载玻片放置在显微镜的载物台上,并通过调节焦距

和聚焦,使样品清晰可见。然后需要选择合适的荧光滤光片,以滤

除非荧光信号,并选择合适的荧光波长,以激发样品中的荧光染料。在观察过程中,需要避免长时间曝光样品,以免造成荧光淬灭和伤

害样品。

4. 数据分析。

在观察完样品后,需要对所获得的荧光图像进行数据分析。首

先需要对荧光图像进行采集和保存,并根据实验需要进行图像处理

荧光显微镜使用说明书

荧光显微镜使用说明书

荧光显微镜使用说明书

1. 引言

荧光显微镜是一种高级显微镜,它通过荧光染料和荧光体来观察

生物样本。本说明书将向用户介绍荧光显微镜的基本操作和注意事项。

2. 设备使用前的准备

在开始使用荧光显微镜之前,请确保以下准备工作已经完成:

2.1 样本准备

- 准备待观察的生物样本,并进行适当的固定和染色处理。

- 使用适当的荧光染料标记待观察的目标结构,比如细胞核或细胞器。

- 确保样本处于干燥且无尘的环境中,以免影响显微镜观察效果。

2.2 显微镜设置

- 将荧光显微镜放置在水平且稳定的台面上,避免震动。

- 连接电源线并确保电源稳定。

- 打开显微镜主机,并调节照明系统到适当的亮度。

- 确保镜头已正确安装并调节到焦点位置。

3. 操作步骤

3.1 调节荧光滤光片

- 根据所使用的荧光染料种类,选择相应的滤光片组合。请参考荧光染料厂家提供的荧光光谱信息。

- 将滤光片安装到显微镜的滤光器单元上,确保滤光片与光源相匹配。

3.2 焦距调整

- 放置已准备好的样本到显微镜的载物台上,并使用载物台调节样本水平位置。

- 通过调节镜头的焦距轮和对焦杆,使样本逐渐变得清晰可见。

3.3 荧光成像

- 使用显微镜的放大倍率调节旋钮,逐渐增加放大倍率以观察细节。

- 通过调节显微镜的聚光镜或荧光照明系统,确保样本受到均匀且适当的荧光照明。

- 使用取景器或相机从目镜观察孔观察并记录样本图像。

4. 注意事项

- 在操作显微镜时,请务必小心轻放,避免撞击或其他损坏。

- 建议在室温下使用荧光显微镜,避免极端温度或湿度对设备造成不利影响。

- 使用前请确保手部清洁,避免在样本处理过程中引入杂质。

荧光共聚焦显微镜原理

荧光共聚焦显微镜原理

荧光共聚焦显微镜原理

荧光共聚焦显微镜(Confocal Microscope)的原理基于光学聚焦和计算机图像处理技术。其工作原理主要包括以下几个方面:

1. 光学聚焦:共聚焦显微镜使用高数值孔径的物镜将激发光聚焦在样品上,形成非常小的光斑。这样可以在焦平面上获得较高的图像分辨率。

2. 针孔滤波:在共聚焦显微镜中,通常在物镜的后焦平面设置一个小孔(即针孔),只允许经过聚焦的光斑通过。这样可以有效地消除杂散光和背景光,提高图像的对比度和信噪比。

3. 光学切片:通过计算机控制扫描器,使激光束在样品上做平面扫描,同时检测器接收经过针孔滤波的荧光信号。这样就可以获取一系列二维图像,再通过计算机将这些图像叠加起来,形成一个三维的图像。通过光学切片的原理,可以实现对样品的逐层扫描,获得不同深度的图像。

4. 计算机图像处理:共聚焦显微镜采集到的图像数据需要经过计算机的图像处理和分析,包括对图像进行增强、伪彩色编码、三维重建等操作,以便更好地展示样品的结构和功能。

总的来说,荧光共聚焦显微镜的原理是将激光光源聚焦在样品上,通过针孔滤波和光学切片技术获取高分辨率的三维图像,再通过计算机进行图像处理

和分析。这种技术广泛应用于生物学、医学、材料科学等领域,用于观察和分析细胞、组织、蛋白质等微观结构。

荧光显微镜的分类

荧光显微镜的分类

荧光显微镜是一种使用荧光物质和特定波长的光源来观察样本的显微镜。荧光显微镜可以分为以下几类:

1. 荧光透射显微镜(Fluorescence Transmission Microscope):

这是最常见的荧光显微镜类型,它使用荧光染料标记样本,然后通过照射特定波长的光源来激发荧光染料,并通过透射光来观察样本。

2. 荧光反射显微镜(Fluorescence Reflection Microscope):

在这种类型的显微镜中,光源从上方照射样本,而观察是通过检测反射光中的荧光信号来进行的。这种方法适用于厚样本或需要从不同角度观察的样本。

3. 荧光共聚焦显微镜(Fluorescence Confocal Microscope):

共聚焦显微镜使用一个或多个pinholes(小孔)来聚焦样品的光线,并只允许来自特定平面的光通过,这样可以获得清晰的、无层叠的图像。这种显微镜非常适合观察厚样本或想要获取深层结构的样本。

4. 荧光扫描显微镜(Fluorescence Scanning Microscope):

这种显微镜通过扫描光源和探测器在样本上移动,以获取整个样本区域的荧光信息。这种方法可以用于获取高分辨率的图像,但可能需要较长的成像时间。

5. 荧光点扫描显微镜(Fluorescence Point Scanning Microscope):

这种显微镜通过逐点扫描样本来获取图像,每个点的光源和探测器都非常接近,因此可以获得高分辨率的图像。这种方法通常用于成像较小的样本或特定区域。

6. 实时荧光显微镜(Real-time Fluorescence Microscope):

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜是一种先进的显微镜,它可以使被观察的样本能够发出荧光,从而看到更细胞更宏观的结构。下面我们一起来了解一下荧光显微镜的使用方法。

1、准备工作

首先,在使用荧光显微镜之前,需要先将镜头清洗干净,以免影响成像效果。同时,还需要将待观察的样品取出,进行样品的准备工作,例如培养细胞、切片等等。

2、调节镜头

将样品放入显微镜之后,要调节镜头,以获得最佳的成像效果。首先要将物镜与样品对焦,然后调节荧光滤光片、激发滤光片和物镜的焦距,直到获得最佳的观察效果。

3、拍摄图像

在调节好镜头后,可以使用荧光显微镜来观察和拍摄图像。观察荧光发射时要避免光线过强,否则会造成图像发虚。此时需要适当地调节荧光滤光片的重叠程度来获得最佳的成像效果。

4、对图像进行处理

荧光显微镜所拍摄的图像可以根据需要进行处理。可以使用图像软件来调整图像的对比度、亮度等参数,以产生更清晰、更鲜艳的图

像效果。同时,可以通过颜色调整功能根据需要来调整图像颜色,如将荧光标记变成不同颜色的。

荧光显微镜在生命科学研究中有着广泛的应用,通过使用荧光标记技术,可以观察细胞内某些分子的转运、相互作用行为等生物学现象。但荧光显微镜的使用需要非常谨慎,因为光线过强会对样品造成伤害,影响样品的生长和繁殖。因此,在使用荧光显微镜之前,必须详细阅读说明书,了解荧光显微镜的使用要点,严格遵守操作规程,以确保实验的成功。

荧光显微镜的用途

荧光显微镜的用途

荧光显微镜的用途

荧光显微镜是一种能够发射和感测荧光光的显微镜,它的用途广泛。以下是一些主要的用途:

1. 细胞和组织显微分析:荧光显微镜能够标记特定的细胞结构、蛋白质、核酸和其他分子,使其在显微镜下可见。这对于观察细胞和组织的结构和功能非常有用,例如研究细胞分裂、细胞信号传导和细胞死亡等过程。

2. 生物医学研究:荧光显微镜广泛应用于生物医学研究领域,如药物发现、癌症研究和神经科学。通过使用特定的荧光染料或标记物,研究人员能够观察和测量细胞和分子的活动,从而了解疾病的发生和发展机制,并开发新的治疗方法。

3. 生物工程和遗传学:荧光显微镜可以用于研究基因表达、蛋白质合成和代谢通路。通过标记特定的基因或蛋白质,研究人员可以确定其在细胞和组织中的位置和表达水平,从而了解生物体的功能和调控机制。

4. 材料科学和纳米技术:荧光显微镜可以用于研究纳米材料和纳米器件。通过标记纳米粒子或分子,研究人员可以观察和分析其在材料中的分布和行为,从而优化材料的性能和应用。

总的来说,荧光显微镜是一种非常有用的工具,可以帮助研究人员观察和探究微观世界中的细胞和分子结构、功能和相互作用。它在生命科学、材料科学和纳米技术等领域起着重要作用。

荧光显微镜操作流程

荧光显微镜操作流程

荧光显微镜操作流程

荧光显微镜是一种重要的实验设备,常被用于生物学、医学、生物化学等领域的研究。本文将介绍荧光显微镜的操作流程,帮助读者正确使用这一仪器。

一、准备工作

在使用荧光显微镜之前,我们需要进行一些准备工作,以保证实验的顺利进行。

1. 准备显微镜和镜片

确保荧光显微镜处于正常工作状态,检查镜片是否清洁无尘。如有需要,使用镜头纸轻轻擦拭镜片表面,保持其清洁。

2. 准备标本与荧光染料

根据实验需要,准备好待观察的标本,并选择适当的荧光染料。荧光染料的选择应与标本的特性相匹配,以确保在显微镜下能有效产生荧光。

二、调整参数

在开始观察之前,我们需要调整荧光显微镜的参数,以获得清晰的图像。

1. 调节照明系统

根据所选择的荧光染料的激发波长,选择适当的光源和滤光器。将滤光器安装在照明系统中,并调节至合适的位置。

2. 调节聚焦与放大

通过调节聚焦手轮,将显微镜镜头调整至适当的位置。使用目镜观察标本,通过微调手轮进行细微的调整,直到获得清晰的图像。

3. 调节曝光时间

根据实验需求和标本的亮度,调节显微镜的曝光时间。适当的曝光时间可以减少噪音,提高图像的质量。

三、观察标本

当荧光显微镜的参数调整完成后,我们可以开始观察标本并获取图像了。

1. 将标本放置在载玻片上

将准备好的标本放置在载玻片上,并加入适量的显微镜盖玻片。确保标本均匀分布,避免气泡的产生。

2. 定位标本

将载玻片放入荧光显微镜的标本台上,用载物台上的操作手轮将标本移动至兴趣区域。通过目镜观察标本位置,确保兴趣区域位于视野范围内。

3. 开始观察

逐渐调节显微镜的聚焦手轮,观察标本的荧光信号。通过目镜观察和图像显示屏,可以实时监控并调整显微镜的聚焦和曝光参数,以获得最佳的图像质量。

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜使用方法

荧光显微镜是一种常用的显微镜,用于观察样品中的荧光发射。下面是荧光显微镜的使用方法:

1. 准备样品:将待观察的样品制备好,例如细胞、组织切片等。

2. 准备溶液:根据样品的要求,准备好适当的荧光染料或荧光探针溶液。

3. 调整显微镜:将荧光显微镜调整到合适的工作状态。首先打开显微镜的光源,调节亮度和对比度,确保适当的照明条件。然后根据荧光染料的激发波长,选择合适的滤光片安装在光源和物镜之间。

4. 定位样品:将样品放置在显微镜的样品台上,并使用样品台上的移动装置将样品调整到适当的位置。

5. 调节对焦:使用显微镜的焦距调节旋钮或移动装置,将样品调焦到清晰的图像。可以使用目镜调焦,然后再使用物镜调焦,以获得更高的放大倍数。

6. 切换到荧光模式:调整显微镜的光源切换到荧光模式。根据需要,在荧光探针激发波长的范围内选择合适的激发滤光片和荧光滤光片,并将它们安装在光源和物镜之间。

7. 观察和记录图像:通过目镜观察到样品中的荧光发射,并使用显微镜配备的相机或摄像设备拍摄或记录图像。

8. 清洁和存储:使用完毕后,关闭显微镜的光源,将样品从样品台上取下,并清洁显微镜的镜头和样品台。然后,将显微镜保存在干燥、清洁的地方,以防止灰尘和污染。

以上是荧光显微镜的基本使用方法,根据不同的实验要求和样品特性,可能还需要进行其他调整和操作。

荧光显微镜操作规程

荧光显微镜操作规程

荧光显微镜操作规程

荧光显微镜是一种非常重要的显微镜种类,它能够在光学显微镜的基础上使用荧光染料来标记样本中的特定结构或分子,从而使它们在显微镜下呈现出明亮的荧光信号。荧光显微镜常用于生物医学、生命科学等领域的研究与应用。为了正确、安全地操作荧光显微镜,下面就是一份荧光显微镜操作规程供参考。

一、准备工作

1. 在操作前,确保荧光显微镜及其附件都处于正常工作状态,如灯泡是否正常照明、荧光滤光片是否正确安装等。

2. 调节荧光显微镜镜头的焦距和对焦清晰,以获得高质量的显微观察效果。

3. 检查并清理镜头和样本台,确保表面干净且无灰尘或杂质。

4. 准备好所需的荧光染料、显微镜载玻片、盖玻片等实验器材。

二、荧光染料的选择与使用

1. 根据研究目的选择合适的荧光染料,确保其与样本中的目标结构或分子有良好的亲和性。

2. 注意荧光染料的使用浓度和标记方式,避免过高的浓度或不恰当的标记方法对样本造成伤害。

3. 在染色过程中,应根据荧光染料的特性和样本的需求进行优化,包括染色时间、温度、pH值等。

三、样本的准备与固定

1. 样本准备前,确保样本得到适当地取样,并尽量保持其原始形态和活性。

2. 对于生物样本的固定,可以选择适当的固定剂和固定时间,以保持样本形态的稳定且不破坏荧光信号。

四、显微观察与成像

1. 将准备好的样本放置在样本台上,并固定好,避免在观察过程中样本的移动或晃动。

2. 打开荧光显微镜的电源开关,调节亮度和荧光光源的功率,使样本得到适当的照明。

3. 通过目镜或光学镜头观察样本,调节对焦以获得清晰的图像。

操作手册荧光显微镜使用方法说明书

操作手册荧光显微镜使用方法说明书

操作手册荧光显微镜使用方法说明书

一、概述

荧光显微镜是一种高级显微镜,采用荧光技术来增强样本的分辨率

和对比度,广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。本操作手册

旨在为用户提供荧光显微镜的正确使用方法和注意事项。

二、准备工作

1. 确保荧光显微镜已经连接好电源并打开开关。

2. 检查样本是否准备完毕,确保样本已标记荧光染料。

3. 确认荧光显微镜的荧光滤光片组件已安装并与荧光染料相匹配。

4. 检查其它辅助设备,如计算机和相机连接线是否插入正确。

三、基本操作步骤

1. 调节镜筒高度,使样本平面与物镜焦平面相等,获得清晰的图像。

2. 选择适当的目镜和物镜,插入物镜并旋转使其锁定。

3. 调节瞳孔间距,将左眼和右眼的视觉合并为一个图像。

4. 调节荧光照明强度,选择适当的亮度以保证荧光信号的检测。

5. 观察样本,在目镜中寻找荧光信号,调节焦距和聚焦,以获得最

佳的视觉质量。

6. 调节荧光滤光片,根据染料的激发光和发射光波长选择相应的滤

光片。

四、注意事项

1. 使用前请确保已仔细阅读用户手册,并按照操作指南使用设备。

2. 避免荧光照明强度过高,以免损坏样本或减少荧光信号的可见性。

3. 定期清洁荧光显微镜的光学元件,以保持良好的成像质量。

4. 在操作过程中避免触摸镜片和荧光滤光片,以免污染或划伤。

5. 使用后,请关闭荧光显微镜并断开电源,以节约能源并延长设备

寿命。

五、故障排除

1. 如果荧光信号非常弱,请检查荧光滤光片是否正确安装并且与染

料匹配。

2. 如果图像模糊或不清晰,请确保样本调焦正确,并检查物镜是否

清洁。

荧光显微镜的使用步骤流程

荧光显微镜的使用步骤流程

荧光显微镜的使用步骤流程

1. 准备工作

在进行荧光显微镜观察之前,首先需要做一些准备工作。

•清洁工作台和镜头

清除工作台上的灰尘和杂物,并使用干净柔软的纸巾轻轻清洁镜头表面。

•准备样本

准备待观察的荧光标记的生物样本,并确保样本处理和标记的质量良好。

•开启荧光源

开启荧光灯源,确保荧光显微镜有足够的光源。

2. 调节荧光显微镜

•调节亮度和对比度

使用亮度和对比度调节器,调节显微镜的亮度和对比度,以获得清晰的图像。

•调节目镜

调节目镜的光圈和焦点,以获得清晰的样本图像。根据需要,使用目镜的放大倍数切换器来放大或缩小图像。

3. 观察样本

•放置样本

使用载玻片将待观察的样本放置在显微镜的样本台上。

•调节聚焦

使用显微镜的粗焦调节器将样本大致聚焦,然后使用细焦调节器进行微调,直到获得清晰的样本图像。

4. 切换到荧光模式

•调整滤光片

在荧光显微镜中,使用适当的滤光片来选择激发光和发射光的波长。根据标记的荧光染料,选择适当的滤光片。

•切换到荧光模式

切换显微镜到荧光模式,确保荧光源充分照射样本。

5. 观察荧光图像

•调节荧光镜头

使用显微镜的放大倍数调节器,调节荧光镜头的放大倍数,以获得所需的图像尺寸。

•观察荧光图像

通过目镜观察荧光图像,注意图像的对比度和清晰度。根据需要,使用涂片夹调节荧光图像的对比度和曝光时间。

6. 影像记录和分析

•拍摄荧光图像

如果需要记录荧光图像,可以使用相机或荧光显微镜自带的图像记录功能进行拍摄。

•图像分析

使用图像处理软件,对荧光图像进行分析和处理,提取所需的数据和信息。

7. 关闭荧光显微镜

•关闭荧光源

荧光显微镜的使用流程讲解

荧光显微镜的使用流程讲解

荧光显微镜的使用流程讲解

一、准备工作

1.确保荧光显微镜的正常运行状态,检查是否已安装好所需荧光滤光片和目标物镜。

2.打开显微镜电源,待灯泡亮起后,调节亮度到合适的水平。

3.确保使用的载玻片或培养皿已清洁干净,无污垢和杂质。

二、样品处理

1.取出要观察的样品,并根据实验要求进行处理,如染色、固定等。注意,使用荧光染料时应避免暴露在光线下和其他自然光源。

2.在滴液架上滴上适量的液体样品,覆盖胶片或盖玻片。

三、调节显微镜

1.将样品载玻片放在显微镜的载物台上,将载物台垫片固定好。

2.调节照明光源,将光线调至适合观察的强度,并使用亮度调节旋钮获得清晰的视野。

3.转动物镜转盘,选择合适的目标物镜。一般来说,低倍(如4倍或

10倍)用于整体观察,高倍(如40倍或100倍)用于观察细胞结构等。

四、对焦和观察

1.初步对焦:通过调节焦距手轮,将物镜移到与载玻片非常接近的位置,并微调焦距观察样品的大致轮廓。

2.高倍对焦:使用粗调焦距手轮将物镜缓慢下移,直到目标物体的轮廓清晰可见。然后使用细调焦距手轮进行最后的微调,以获得清晰的焦点。

3.观察:使用目镜观察并调整试镜筒高度,使样品的细节清晰可见。如果需要,可以调节对比度、色彩和亮度来优化观察效果。

五、荧光成像

1.切换到荧光模式:根据所用荧光染料选择合适的荧光滤光片,并将其插入滤光片插槽中。

2.调整曝光时间:通过设置合适的曝光时间,确保获得适当的荧光强度,并避免过曝或欠曝。

3.观察和记录:通过目镜观察荧光信号,并使用相机或图像捕捉软件记录所得图像。

六、保存和分析

光学显微镜的荧光成像与荧光定量分析

光学显微镜的荧光成像与荧光定量分析

光学显微镜的荧光成像与荧光定量分析

荧光显微镜技术作为现代生物成像的重要手段,已经广泛应用于生

物学、医学、化学等多个领域。荧光显微镜技术不仅能够提供细胞和

组织的形态信息,而且能够通过荧光定量分析,得到生物分子和细胞

功能的精确数据。

一、荧光显微镜的成像原理

荧光显微镜是利用荧光物质对特定波长光的吸收和发射特性,来观

察和分析样品的一种显微镜。其基本原理是:样品中的荧光物质在受

到激发光(如紫外光或蓝光)的作用下,会吸收光能并跃迁到激发态;激发态的荧光物质经过一定时间后,会释放出光能并返回基态,这个

过程称为荧光发射。

荧光显微镜通常由光源、激发光滤光片、物镜、荧光物质、发射光

滤光片和检测器等组成。光源发出的光通过激发光滤光片后,只允许

特定波长的光透过,照射到样品上的荧光物质;荧光物质吸收光能后,发射出特定波长的光,通过发射光滤光片后,只允许特定波长的光透过,最后由检测器(如光电倍增管或电荷耦合器件(CCD))接收,

并转换为电信号,经过放大和处理后,就可以在屏幕上看到荧光图像。

二、荧光定量分析

荧光定量分析是利用荧光物质的荧光强度与样品中分析物浓度之间

的关系,来定量分析样品中某种物质的含量。荧光强度与分析物浓度

之间的关系通常呈线性关系,通过标准曲线的制备,可以确定样品中

分析物的浓度。

荧光定量分析的步骤通常包括:

1.制备标准溶液:已知浓度的标准溶液,用于制备标准曲线。

2.样品处理:将样品中的分析物提取、纯化,并添加适量的

荧光标记物。

3.荧光显微镜成像:使用荧光显微镜,在适当的激发光和发

射光滤光片下,获取样品的荧光图像。

荧光显微镜的使用方法

荧光显微镜的使用方法

荧光显微镜的使用方法

荧光显微镜是一种能够使样品在荧光条件下显示出不同颜色和亮度的显微镜。以下是荧光显微镜的使用方法:

1. 准备样品:样品需要被标记上荧光染料或具有天然荧光性质。

2. 确定荧光滤镜:根据染料或荧光物质的发射光波长选择相应的荧光滤镜。

3. 安装荧光滤镜:打开显微镜,拧下目镜,在显微镜镜头接口安装荧光滤镜。

4. 调节荧光显微镜光源:调节荧光显微镜光源,使其亮度适宜。

5. 放置样品:放置样品到荧光显微镜的工作台上,并用试样夹固定住。

6. 调节荧光显微镜成像:轻轻旋转或移动样品,调节显微镜成像,以获得清晰的图像。

7. 拍照或记录:用数字相机或视频设备记录图像,或记录图像和数据。

使用荧光显微镜需要注意的是,荧光显微镜是一个高灵敏度的仪器,需要避开明亮的光源和强烈的震动来保持相对稳定的成像。此外,荧光染料需要被正确的选

用和标记,以保证成像的质量和可靠性。

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荧光显微镜讲授流程:

1、构造

2、原理

3、发展史

荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具,它是光学显微镜的一种。它除了具有光学显微镜的基本结构

和光学放大作用外,基于荧光的特性,还具备以下独特的功能要求:

(1)提供足够能量的能激发出荧光的光源。

(2)有着适应不同物质所需的激发光谱一组滤色片,从光源中选择合适的激发光谱,使析出的光谱与

该物质的吸收光谱重合,以期望获得最大的荧光。

(3)为获得较弱的荧光图像,还要建立一套截止滤色片,它使所需观察的荧光进入系统成像,而将其余

的光波,包括发射光阻挡在外,用来提高图像的衬度。

(4)放大的光学系统应适应荧光的特性,最终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨力的良好衬度

的荧光图像。

(5)仪器的安全性。应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸,保证电器安全。

滤色片初期用贮放玻璃盒中的有色液体,后改用带色胶质片,由于易变色和使用不方便已被淘汰。现

在经常使用的为色玻璃和干涉滤色片,色玻璃大都属宽波带滤色片,透过波段宽,透过率随厚度而降低,价

格相对低廉。由于色玻璃与空气的界面上,约有4%光线被反射掉,玻片愈多,光能损失愈大,限制了它的

使用性能。干涉滤色片的出现,可按需要制成能透过或截止一定波段的滤色片,从而促使荧光显微术的进

展,现代技术上已能对某波段的透射率或反射率进行控制。

荧光显微镜的应用

1.在环境中检测已知微生物,制作相应的带有荧光素的抗体,进行标记、定位(免疫荧

光技术)对病原微生物的检测有意义--- 梅毒密螺旋体

2.荧光显微镜下的细胞增殖(超链接--视频)

3.选用不适合同的荧光染色剂,对同一视野下的样品进行染色(复杂环境下)

4. 荧光显微镜在各领域中的应用都非常广泛,在植物细胞的观察研究中,通过染色可以更清晰地观测到细胞的形态及结构。在实验中发现,荧光显微镜还可以直接(不做任何处理)观察植物叶的气孔器,而且能观察到气孔的变化情况,为荧光显微镜找到了一种新用途。

5. 20世纪30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维

等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助人们在痰中找到结核杆菌。40年代创

造了荧光染料标记蛋白质的技术,这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中,可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体,可用以探讨病因及发病机理,如肾小球疾病的分类及诊断,乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等

6.在植物细胞凋亡机理的研究中对线粒体进行染色后,用荧光显微镜能够很清晰地观察到活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细

胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。利用荧光标记技术显示微管,可以在多种植物生殖细胞内清楚地看到微管骨架的存在

7.在紫外光激发下,叶绿体发出火红色荧光,气孔发绿色荧光,保卫细胞呈黄色或黄绿色,且形

状大小非常清晰,两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少,所以在荧光显微镜下看不到表皮细胞。通过大量试验证明,单子叶,

双子叶,裸子植物大都适用于这种方法而且效果较好。

荧光显微镜基本形式有两种:透射式和落射式。

透射式如图8所示,它由光源(HL)、激发滤色片(EF)和照明系统供给激发光。图中用暗场聚光镜

(DC)将光束会聚在切片(P)上,由物镜(OB)将荧光物成像于像面上,截止滤色片(SF)吸收被

切片衍射的

杂散激发光,仅透过荧光到目镜(OC)。

DC—暗场聚光镜; OB—物镜; SF—截止滤色片; OC—目镜。

图8透射荧光显微镜

透射式备有明场聚光镜和暗场聚光镜。明场聚光镜很少直接用于荧光检测中,常用来搜索目标,寻找

或挑选切片需要的区域,这是费时的工作,不宜用强度极高的光去完成,否则会出现衰减甚

至猝灭,当仪器

配备高质量短波通干涉滤色片激发时,用明场聚光镜,在调节可变光适当时,也可获得满意

的荧光图像。

暗场聚光镜在透射荧光中是必备的,由于使用暗场聚光镜激发光不会进入物镜,背景呈“暗”色,使荧

光衬度大大提高。

荧光中应用的暗场聚光镜材料应选用自发荧光少的硝酸盐,并且能透过紫外线的材料。图9所示是一

种心形暗场聚光镜,它的心脏形反射面将光线高度会聚成一“点”,聚光镜的性能可用下式表征。

E=KõP(NA2max-NA2min)

K为透过率。可见其性能取决于聚光束最大数值孔径与最小数值孔径的平方差,差值愈大,性能愈优越。

暗场是用中空的光锥激发切片的荧光物,为得到稳定的荧光图像,聚光镜的调节机构(对中

和调焦)应

稳定可靠,可多次重复照明条件。

另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm~1mm之间才获得暗场效应,这是因为受

到暗场光

锥顶点深度的限制。好的暗场聚光镜,1.2mm的厚切片也能使用。

图9心形暗场聚光镜

落射式如图10所示。它将激发光由二向色分光镜(DM)反射通过物镜射至切片上激发荧光物。二向

色分光镜能通过物镜收集荧光。截止滤色片吸收激发光谱的反射光让荧光色透过从目镜中观察。

DM—二向色分光镜

图10落射荧光显微镜

二向色分光镜是落射式关键部件,它是多层膜干涉滤色片,与主光路呈45°安置,它的光谱特性如图

11所示。该曲线竖轴为透过率,横轴为波长,其反射率可用100%与透过率差值求得,从380nm~400nm

的波长(青色)约90%反射,520nm以上的光波从(黄至红色)透过。以50%的反射率时的波长作为表征,如

该曲线为500nm,记为DM-500。

图11二向色镜透射曲线

图12落射照明光路

各个分色镜还应建立相应的激发和截止滤色片,以满足不同的需要。

滤色片(包括二向色分镜)的设置与组合是荧光显微镜设计中一个重要的课题,它与荧光术的应用密

切相关。

落射式激发光通过物镜垂直自上而下照明切片上表面,故又称为垂直照明器,它采用柯勒照明系统。

光源经集光镜大致成平行光束,为利用光能,增大包容角,用隔热玻璃吸收热线,聚光镜使光源成像于孔径

光阑上,并使它与物镜后焦面重合,所以经物镜出射激发光束为平行光均匀投射到切片上。要注意的是仪

器配备的所有物镜均应达到此要求。

这两种基本形式,各有特点和使用价值。对于落射式:

(1)物镜兼作聚光镜,就没有聚光镜的定中与调焦问题,而且物镜的数值孔径随倍率而增大,荧光图像

亮度也随之提高;

(2)激发光不必透过载玻片,因而减少损失,而且激发光与荧光对物镜而言方向相反,分得很开不可能

产生互相干扰,就是有部分反射激发光进入物镜后也被二向色分光镜反射至光源,仅有极小部分透过,使

截止滤色片负担小,可制成较薄的片;

(3)用透射式激发时,大部分荧光产生于切片底部,必须透过切片射出,而且还会产生散射。而落射照

明和观察面在同一表面,荧光图象亮度毫无损耗,而且对象质也无影响,特别对厚的切片,如菌落和组织培

养等更具有独特的功能;

(4)落射荧光的物镜因要通过紫外区光谱,因此必须要考虑紫外段的透过率,为此专门研制UV-F透

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