慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
慢病毒包装和滴度检测方案流程
慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。
该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。
培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。
3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。
四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。
2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。
（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。
3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒包装简要步骤
慢病毒包装简要步骤：
以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×10∧6个293FT细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清Opti MEM。
轻柔混匀，室温孵育5min。
2、取1.5ml灭菌EP管，取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清Opti-MEM I培养基中。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min
4、用胰酶消化并记数293FT细胞。
用含血清的DMEM培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293FT细胞（1×10∧6个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除，代之以DMEM（含丙酮酸钠和非必须氨基酸）。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
慢病毒包装操作方案
v1.0 可编辑可修改慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM InvitrogenDMSO（冻存用）10%2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenOpti-MEM基础培养基InvitrogenPEG6000溶液50%WakoNaCl溶液40 mMHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。
在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。
4)在室温条件下，250 g离心4分钟。
5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。
（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。
）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。
1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。
将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。
慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。
尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。
耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。
仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。
第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。
细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。
放置培养箱中培养48h。
插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。
慢病毒包装步骤
慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。
用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。
质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。
慢病毒纯化
慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。
这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。
2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。
3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。
然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。
4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。
可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。
5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。
这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。
6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。
使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。
7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。
在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。
每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。
慢病毒载体构建及包装操作手册
慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3)操作病毒时特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。
接触过病毒的枪头，离心管，培养板，培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。
4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
6)实验完毕用香皂清洗双手。
➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后在短期内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。
注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。
b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。
2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。
一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。
该细胞系为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。
慢病毒包装步骤
慢病毒包装步骤慢病毒包装步骤慢病毒包装简要步骤：以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。
1、取1.5ml灭菌EP管，加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。
轻柔混匀，室温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。
室温孵育20min4、用胰酶消化并记数293T细胞。
用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。
37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。
3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。
质粒转染的步骤1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~32、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例1、转染前一天细胞换新的培养基2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。
慢病毒实验方法
慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、试剂、耗材及仪器1.1试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Line clontech632180 DMEM Gibco C11995500BTFetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin LifeTechnologies10099-141Lipofectamine™LTX & Plus Reagent invitrogen15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20℃保存。
b. LB液体培养基实用文档称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。
d. 50%PEG6000溶液称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
e. 4M NaCl溶液称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
f. PBS缓冲液称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
实用文档1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flasks corning430639 75cm2细胞培养瓶corning430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning430293 6孔细胞培养板corning3516外旋盖冻存管corning430659 15ml尖底离心管corning430790 50ml尖底离心管corning4558 3毫升吸管Biologix30-0138A1 1.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo371生物安全柜Thermo Forma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUS IX71实用文档台式高速冷冻离心机Thermo LEGND MACH 1.6R小型高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYO MDF-U73V冰箱Haier BCD-290W二、方法2.1．包装细胞准备2.1.1.细胞复苏a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；实用文档c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。
慢病毒包装实验流程介绍
慢病毒包装实验流程介绍
慢病毒包装流程：
1、载体质粒与系统质粒共转染293T细胞。
2、收集48~72h的细胞上清液。
3、超速离心纯化浓缩。
4、纯化分装。
5、滴度检测。
慢病毒包装具体实验步骤如下：
一、质粒转染
1、转染前，依次准备好转染试剂、Opti-MEM培养基、目的质粒、骨架质粒、EP管。
2、然后，配置质粒和OMEM的混合液。
3、配置转染试剂和OMEM的混合液。
4、轻轻混匀，静置5min。
5、将配好的质粒与转染试剂混合后形成转染体系。
6、轻轻混匀，静置20min。
7、从培养箱中取出10cm培养皿，弃去培养液，更换为OMEM 培养液。
8、转染，轻轻混匀。
9、在培养皿盖上做好标记，放回培养箱继续培养。
10、转染后6-8h，更换为新鲜的DMEM培养基。
11、转染后次日，显微镜下观察转染效率。
12、转染后48h，收集上清液于干净的50ml离心管中。
13、加入新鲜的DMEM培养基，继续培养。
14、转染后72h，再次收集上清液。
二、浓缩纯化
1、将收集好的上清液离心，弃去细胞碎片。
2、用0.22μm滤膜过滤，分装到超速离心管中。
3、超速离心。
4、离心结束后，将所收获的病毒颗粒重新悬浮，于4℃冰箱中溶解，过夜。
5、次日，再次将溶解后的病毒过滤、分装、入库。
慢病毒实验方法
慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、试剂、耗材及仪器1.1试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Line clontech 632180 DMEM Gibco C11995500BT Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin Life Technologies 10099-141 Lipofectamine™LTX & Plus Reagent invitrogen 15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25) QIAGEN 121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20℃保存。
b. LB液体培养基称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。
d. 50%PEG6000溶液称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
e. 4M NaCl溶液称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
f. PBS缓冲液称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flasks corning 430639 75cm2细胞培养瓶corning 430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning 430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning 430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning 430293 6孔细胞培养板corning 3516 外旋盖冻存管corning 430659 15ml尖底离心管corning 430790 50ml尖底离心管corning 4558 3毫升吸管Biologix 30-0138A11.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo 371生物安全柜Thermo Forma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUS IX71台式高速冷冻离心机Thermo LEGND MACH 1.6R小型高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYO MDF-U73V冰箱Haier BCD-290W二、方法2.1．包装细胞准备2.1.1.细胞复苏a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒的浓缩与纯化PEG浓缩法
慢病毒的浓缩与纯化P E G浓缩法
公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
实验试剂
1. NaCl
2. PEG8000
实验设备
1. 高压灭菌锅
2. μm滤头
3. 高速离心机
4. 低温冰箱
实验步骤
1. 5X PEG8000 NaCl配制称取NaCl g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q 纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。
2. 使用μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液 ml；
4. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；
5. 4度放置过夜；
6. 4度，4000 g，离心 20min；
7. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。
最新慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。
尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。
耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。
仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。
第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。
细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。
放置培养箱中培养48h。
插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。
慢病毒包装试剂盒说明书(5个10cm皿)-精简版
YRGene慢病毒包装试剂盒（精简版）说明书产品编号：产品规格： 个 皿产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（ ）优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。
（ ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。
产品组成：慢病毒包装步骤：转染前，传代 细胞于 培养皿中（例如，接种 × 细胞于 培养皿中，使用完全培养基 培养），当细胞密度能够达到 即可进行转染。
：培养基里面不要添加抗生素。
转染前 小时，更换培养基，加入 新鲜的完全培养基（ ），注意不要添加抗生素。
准备转染。
在 离心管中，分别配制 管与 管试剂（ ）配好后，放置 ，然后将 管缓慢加入 管，混合均匀。
室温放置 ，使得脂质体 混合物形成。
：混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。
然后将混合液逐滴均匀加入 培养皿，轻微混匀。
置于 ， 培养箱中培养过夜。
第三天，更换培养基，加入 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。
转染后 后收取上清，转移至 离心管。
：上清里面含有病毒，请小心操作。
在 ℃离心 ，去除沉淀。
上清液用 μ 滤器过滤后转移到新的离心管中。
慢病毒浓缩：每 过滤后的病毒初始液，加入 ，每 混合一次，共进行 次。
℃放置过夜。
℃， ，离心 。
去掉上清，静置管子 ，吸走残余液体。
加入无血清 充分溶解慢病毒沉淀。
病毒悬液分装成 μ 每份 保存在离心管中，速冻后储存在 ℃。
慢病毒滴度测定：进行慢病毒感染实验之前，我们强烈建议您进行慢病毒滴度检测。
在滴定测定的前一天取 孔板，每孔接种 × 细胞。
加 到新鲜的完全培养基中，使其终浓度为 μ 。
加含有 的完全培养基 倍稀释病毒。
具体操作如下：取一个 离心管（或 孔板），加入 μ 培养基和 μ 待测病毒原液，混合均与后吸取 μ 病毒混合液至第二个离心管（或 孔板第二个孔），混合时尽量不要产生气泡，如此稀释至第八个孔（即稀释 倍）。
慢病毒包装的方法、步骤详细教程分享
慢病毒包装的⽅法、步骤详细教程分享本⽂梳理了慢病毒包装的全部流程，并结合具体实例介绍了慢病毒包装的⽅法、步骤，并对包装过程中的关键点进⾏了细致的分析。
使初学者也能握毫⽆障碍地⾃主完成病毒包装、纯化、滴度测定等实验。
以293T细胞为例：慢病毒感染293T细胞 - 合肥知恩⽣物慢病毒感染293T细胞1.293T细胞分盘转染前⼀天，将已经长好的细胞以合适的⽐例传代到10cm培养⽫中，当细胞长到80%时准备转染，步骤如下：1）弃去培养液，加⼊5 mL 灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞⽣长⾯，然后弃去 PBS 溶液。
2）⽤2 mL 胰蛋⽩酶消化对数⽣长期的293T细胞。
3）以含10%⾎清的培养基调整细胞密度为5 ×106个/10 mL，重新接种于10cm细胞培养⽫中，37 ℃，5% CO2 培养箱继续培养，转染前细胞密度80%左右。
注意：293T细胞的状态⾮常重要，⼀般建议购买新的细胞株后分批多次冻存，以保证每次包装病毒时细胞的代数不会超过10代。
同时尽量不要使⽤国产⾎清。
复苏后的细胞需要传2代后才能进⾏病毒的包装，并且传达后18-24h 需要密度达到80%左右。
2.转染前换液转染前1~2h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基，8mL/10cm⽫。
注意：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应⼩⼼滴加尽量避免冲起细胞。
3.转染（1）以⼀个10cm平⽫为例，取2个EP管，分别加⼊500 µl⽣理盐⽔，标记为A、B；（2）A管加⼊60µg PEI，并充分涡旋混匀，B管加⼊过表达质粒和两个辅助质粒pSPAX2、pMD2.G，三质粒⽐例为4：3：1，共24µg；（3）将A管PEI加⼊到B管中,轻轻混匀，静置20min；将混合液加⼊细胞中，过夜培养。
注意：质粒提取的质量，包括浓度和纯度。
浓度⾄少要超过500ng/ul，因为浓度低，加⼊的体积就会相应增⼤，会增加细胞污染的风险。
纯度可以使⽤核酸测定仪进⾏检测，260/280在1.8-2.0之间。
如何包装慢病毒
如何包装慢病毒如何包装慢病毒⼀、整体实验流程⼆、实验材料（⼀）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采⽤293T作为慢病毒的包装细胞。
该细胞系为贴壁依赖型成上⽪样细胞，⽣长培养基为DMEM+10% FBS+双抗。
贴壁细胞经培养⽣长增殖形成单层细胞。
3、菌株：⼤肠杆菌菌株DH5α⽤于扩增辅助包装载体质粒；Stbl3⽤于扩增pHBLV TM 系列质粒，防⽌病毒载体重组。
三、慢病毒包装和浓缩(⼀)质粒扩增构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过⼤量抽提，浓度⼤于1 µg/µl，A260/280在1.7-1.8间⽅可⽤以病毒包装。
推荐使⽤Qiagen⼤抽试剂盒进⾏质粒的⼤量去内毒素抽提（质粒质量会极⼤影响后续转染效率和病毒的滴度）。
(⼆)做脂质体转染转染前⼀天，按照5?106/T75的密度铺下293T细胞。
24h后转染。
转染前请把DMEM和转染试剂LipoFiter TM恢复⾄室温，使⽤前需摇匀。
转染每瓶T75的质粒成分如下：psPAX2 10 µgPMD2.G 10 µgpHBLV TM系列载体10 µg请参考LipoFiter TM转染试剂说明书进⾏转染操作。
转染后6 h换新鲜培养基。
注：LipoFiter TM转染试剂为汉恒⽣物研制的DNA转染试剂产品，使⽤说明请参考LipoFiter TM说明书。
(三)病毒收集和离⼼转染后48h和72h分别两次收集病毒上清(48h收集后置换新鲜培液)，收集后以0.45 µm滤器过滤,于40 ml超速离⼼管中，4℃，72000?g离⼼120 min。
(四)病毒重悬和保存500 l 新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80℃甚⾄液氮保存。
附1：汉恒⽣物慢病毒质粒列表（质粒图谱请登陆汉恒官⽹/doc/dd95f5e0b8d528ea81c758f5f61fb7360a4c2b13.html 查询）载体名称⽤途启动⼦容量抗药标记荧光标记pHBLv-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-puro过表达CMV 2.5kb Puromycin RFP pHBLv-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-puro过表达CMV 2.5kb Puromycin ZsGreen pHBLV-CMV-MCS-EF1-Luc-T2A-Puro过表达CMV 2.0kb Puromycin Luc pHBLV-CMV-MCS-EF1-Puro 过表达CMV 3.0kb Puromycin ⽆pHBLV-CMV-MCS-T2A-Puro 过表达CMV 3.0kb Puromycin ⽆pHBLV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen过表达CMV 3.0kb ⽆ZsGreen pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP-T2A-Puro过表达CMV 3.0kb Puromycin RFP pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro过表达CMV 2.5kb Puromycin GFPpHBLV-Tet-on-SV40-puroTet-on过表达TRE3G1.5kb Puromycin ⽆pHBLV-CMV-crRNA-EF1-GFP-T2A-puro 环状RNA过表达CMV 2.5kb ⽆GFPpHBLV-U6-MCS-EF1-mCherry-T2A-puro ⼲扰U6shRNAPuromycin mCherrypHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-Puro ⼲扰U6shRNAPuromycin ZsGreenpHBLV-U6-MCS-EF1-Luc-T2A-Puro ⼲扰U6shRNAPuromycin LucpHBLV-U6-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-Luc ⼲扰U6shRNA⽆ZsGreen/LucpHBLV-U6-MCS-EF1-RFP-T2A-Luc ⼲扰U6shRNA⽆RFP/LucpHBLV-U6-MCS-EF1-Luc-T2A-Bla ⼲扰U6shRNABlasticidin LucpHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen ⼲扰U6shRNA⽆ZsGreen pHBLV-U6-MCS-PGK-puro ⼲扰U6shRNAPuromycin ⽆pHBLV-EF1α-cas9-U6-gRNA-puro Cas9/gRNAEF1α/U6Cas9/gRNAPuromycin ⽆pHBLV-EF1α-cas9-CMV-puro cas9 EF1αCas9 Puromycin ⽆pHBLV-U6-gRNA-EF1a-puro gRNA U6 gRNA Puromycin ⽆。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞的培养之袁州冬雪创作一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等.所以要在细胞购进时就停止冻存.2. 在细胞对数生长期停止冻存，增加细胞复苏成活率.3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基.4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去.5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀.6. 细胞计数.7.将细胞离心，1000rpm，2min.8. 根据计数成果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml.10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录.二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞停止传代操纵，以扩展细胞数量，维持细胞杰出的生长状态.2. 消化细胞，方法同上.3. 细胞离心竣事后，加入完全培养基重悬.密度为3×105个/ml.4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿.三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超出50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开端冻存的细胞停止复苏.2. 打开水浴锅，设置温度为40℃.3. 检查细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并疾速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解.4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿.5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养.6. 第二天观察细胞存活率.倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基.二、慢病毒的包装、稀释和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必须选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边沿清晰，传代次数较低.任何时候细胞汇合率都不准达到100%.慢病毒的包装1. 预先准备3个T150瓶的293T细胞，培养基为DMEM + 10% FBS，1% Glutamax ，1% 青霉素-链霉素.2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是8×106个.3. 第二天，镜下检查细胞.细胞融合度应大致为30-40%，分布平均.4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入20ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱.5. 取两支无菌的50ml离心管，其中一支中加入252 μg pNL-EGFP/CMV/WPREDU3 载体质粒，168 μg pCD/NL-BH*DDD 包装质粒和84 μg pLTR-G质粒，用Opti-MEM培养基补齐到18ml.另外一支中加入500 μl Trans-EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM培养基，用电动移液器轻轻混匀.将Trans-EZ稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀.关键步调：推荐使用Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒.6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ充分连系形成转染复合体.7. 取1支5ml的移液管，将得到的DNA-Trans-EZ复合体平均滴加入到细胞培养板中，每板3ml.往返晃动培养板，混匀后放回到5%二氧化碳培养箱.每皿细胞培养盘不要超出6盘.8. 6小时后，移去细胞上清，更换为17ml的DMEM完全培养基.9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的而且密度接近60-80%.如果所转染质粒带有GFP荧光，那末这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的.10. 将细胞送回培养箱继续培养2天（36-48小时）.在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁.11. 收集所有的上清，分装到50ml离心管中.12.4℃，500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片.13. 总的上清约为204 ml，用250-ml 0.45 μm PVDF过滤装置过滤.如果发现滤膜被堵住，表示为过滤速度变慢，更换新的滤器.慢病毒的稀释与纯化方法一超速离心沉淀法1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟.2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液.3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液.将移液管一直拔出到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml.同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中.另取一支干净的移液管，对剩下3管停止同样处理.4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超出0.1g.5. 顺次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中.7. 小心将管子从转头中取出.倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干.吸掉剩余的液滴.在管底应当有可见的沉淀.8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀.9. 将SW28超速离心管拔出到50ml锥底离心管中，盖上盖子.10.在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡.11.4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管底.12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬.防止发生泡沫.将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中.13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份，保管在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃.方法二 PEG-8000稀释法PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的间隔，使病毒与病毒可以很容易的聚合在一起，病毒的相对浓度提高，达到沉淀稀释的目标.5X PEG8000+NaCl配制称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭尽 30min；保管在4℃.1. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；3. 每20～30min混合一次，共停止3-5次；4. 4度放置过夜；5. 4度，4000 g，离心 20min；6. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残存液体；7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保管在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数.”TU”为”transducing units”的缩写，中文为“转导单位”，暗示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数.第一天细胞准备将生长状态杰出的293T细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，为每个病毒准备10个孔.放入37℃，5%CO2培养箱中培养.第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀释，持续10个稀释度.稀释方法如下：每种病毒准备10个1.5ml EP管，每管加入90μl 培养液，往第一个管中加入10μl病毒原液，混匀后，吸取10μl加入第二个管混匀.依此类推，做十个稀释度（10~10-8）.吸取96孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液.并做好标识表记标帜.第三天追加培养液在每个孔再加入100μl完全培养液，利于细胞的生长.第五天观察成果并计算滴度在荧光显微镜下观察成果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数.假设为X和Y，则滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（μl）.定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞.每孔细胞为5×104个.接种细胞24小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N.弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5μg/ml polybrene的新鲜培养基.将稀释病毒用培养基稀释200倍，也就是取1μl病毒加入到199μl的培养基中.在3个培养孔中分别加入0.5μl，5μl和50μl的稀释病毒.感染开端后20小时，除去培养上清，换为500μl含DNaseI (Takara Mirus Bio，终浓度为10 U/ml)的新鲜培养基.在37℃消化15分钟，这一步是要除去残存的质粒DNA.然后换为2ml正常的培养基，继续培养48小时.用0.5ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃放置1分钟.用培养基吹洗下，离心收集细胞.依照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA.每个样品管中加入200μl洗脱液洗下DNA.用DNA定量试剂盒定量（Bio-Rad）.基因组DNA可以稳定保管在-20℃至少2个月.准备PCR所需的试剂和样品.为病毒序列检测引物配总管Ⅰ：n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4μl forward primer，4μl reverse primer，4μl probe 和788μl H2O混和.震荡后放在冰上.为人基因组序列检测引物配总管Ⅱ：n = number of reactions. 例如：总反应数为40，将1ml 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100μl 10×RNaseP primer/probe mix和700μl H2O混和.震荡后放在冰上.在预冷的96孔PCR板上完成PCR体系建立.从总管Ⅰ中各取45μl加入到A-D各行的孔中，从总管Ⅱ中各取45μl 加入到E-G各行的孔中.分别取5μl质粒尺度品和待测样品基因组DNA加入到A-D行中，每个样品重复1次.另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-template control）.分别取5μl基因组尺度品和待测样品基因组DNA加入到E-G行中，每个样品重复1次.另留1个孔加入5μl的水做为无模板对照（no-template control）.所使用定量PCR仪为ABI PRISM 7000定量系统.循环条件设定为：50℃ 2分钟，95℃ 10分钟，然后是95℃ 15秒，60℃ 1分钟的40个循环.数据分析：测得的DNA样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数.滴度（integration units per ml，IU ml-1）的计算公式如下：IU ml-1 = (C ×N× D×1000)/V其中： C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数N = 感染时细胞的数目（约为1×105）D = 病毒载体的稀释倍数V = 加入的稀释病毒的体积数慢病毒的储存与稀释慢病毒的储存1. 病毒的运输采取干冰保温，收到病毒液后若几天内用于实验，可于4℃保管（于一周内用完）.2. 若病毒量较大，需长期保管.则根据每次实验用量分装后放于-80℃冰箱.一般病毒可以放于-80℃约12个月以上，但若超出6个月后使用，请重新检测病毒滴度.3. 防止反复冻融，否则会降低病毒滴度.每次冻融会降低病毒滴度10%.慢病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，用细胞培养用D-Hank's、PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保管，并尽快用于实验（于一周内用完）.慢病毒在细胞水平的使用什么是MOI？“MOI”为”multiplicity of infection”的缩写，中文为“感染复数”或“复感染指数”，含义为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（TU number /cell）.在实验中将某种细胞感染达到80%时的MOI定义为这种细胞的MOI.MOI与整合事件以及目标基因的表达相关.一定范围内，表达水平和MOI呈正相关.MOI取决于多种因素，如细胞状态，目标基因的大小与性质，细胞的感染效率等.所以，实验前需查阅相关文献，确定慢病毒对目标细胞的亲嗜性、MOI以及在体（in vivo）注射所需病毒量.若无文献支持，可以通过预实验得到合适的MOI.实际上，即使有文献支持，但由于所用细胞代数、细胞状态以及目标基因的差别，实际的MOI和文献报导也会分歧，所以要安插预实验以确定所需MOI以及病毒对细胞生长的影响.目标细胞感染预实验及实验体系的放大实验目标：确定细胞感染所需的MOI，以及是否需要添加感染增强剂Polybrene.实验资料：96孔板，1.5ml EP管，长势杰出的目标细胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene（10mg/ml），目标细胞培养基等.第一天：细胞准备将长势杰出的目标细胞接种到96板，消化好细胞（悬浮细胞不需要消化，直接离心收集细胞后加新鲜培养基重悬即可）后把浓度调为3×104~5×104个/ml，按90μl/孔加入.接种细胞数量因细胞的生长速度而略有分歧，一般是包管第二天停止病毒感染时细胞汇合率介于30~50%之间.第二天：病毒感染感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加Polybrene.病毒稀释方法同病毒滴度测定时方法，10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100，10和1（细胞颠末一天的生长数量约为1×104个/孔，对应的病毒数量为1×106TU、1×105TU和1×104TU）.每个MOI 值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，比例为1：2000，终浓度为5μg/ml.第二天：换液感染实验同一天，8-12小时后，弃去上清液，更换为新鲜培养基，100μl/孔.第五天：观察荧光表达情况在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计慢病毒感染目标细胞的效率.对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟观察的时间，中途可以传代和换液，以坚持细胞杰出的生长状态.通过细胞感染的效果，确认目标细胞的感染MOI以及是否需要添加Polybrene.对于因目标基因较大，载体无法携带标记基因的，可以通过定量PCR来检测目标基因的表达来评估感染效率.实验体系的放大正式实验时，由于细胞数量较大，所需的病毒用量也需相应增大.放大的原则是坚持细胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大.即使这样，正式实验时由于体系的改变，加上预实验的MOI 值设置跨度较大，可停止对MOI的再次优化.MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己设置合理的数值.*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数.*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布不均与，所以不做减半处理.。
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一、包装细胞293T 细胞的培养一、293T 细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T 细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为 3 X10 5个/ml。
4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。
三、293T 细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。
5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下只供学习与交流5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and 5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe) 2. TaqMan Un iversal PCR Master Mix (Applied Biosystems 4304437) 3. TaqMan DNA Template Reage nt Kit (Applied Biosystems 401970)4. TaqMa n RNaseP con trol reage nt (Applied Biosystems 用于包装的293T 细胞的培养用于包装的293T 细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
任何时候细胞汇合率都不准达 到 100%。
慢病毒的包装1. 预先准备3个T150 瓶的293T 细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS ，1% Glutamax ， 1% 青霉素-链霉素。
2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是 8 X 10 6个。
3. 第二天，镜下检查细胞。
细胞融合度应大致为30-40% ，分布均匀。
4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 20ml 的Opti-MEM 培养基，将细胞送回培养箱。
5. 取两支无菌的 50ml 离心管，其中一支中加入 252 卩g pNLEGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168卩g pCD/NL -BH*DDD 包装质粒和 84卩g pLTR -G 质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到 18ml 。
另一支中加入 500卩l Trans -EZ 溶液和17.5 ml Opti-MEM 培 养基，用电动移液器轻轻混匀。
将Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中，边加边轻轻晃匀。
cat. no.cat. no. cat. no. 4316844)in 帕*;Tri £luctionSunBio IV VectorPackaging Cell关键步骤：推荐使用 Qiagen 质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒。
6. 室温孵育20分钟，使DNA 和Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。
7. 取1支5ml 的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板 中，每板3ml 。
来回晃动培养板，混匀后放回到 5%二氧化碳培养箱。
每一皿细胞培养 盘不要超过6盘。
8. 6小时后，移去细胞上清，更换为 17ml 的DMEM 完全培养基。
9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 60-80% 。
如果所转染质粒带有 GFP 荧光，那么这时候可以看到大于95%的细胞都是带有荧光的。
10. 将细胞送回培养箱继续培养 2天（36-48小时）。
在这个过程中，细胞会逐渐融合 形成多核体，大多数的细胞依然贴壁。
11. 收集所有的上清，分装到 50ml 离心管中。
12.4 C, 500g 离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片。
13.总的上清约为204 ml ，用250- ml 0.45 卩m PVD 过滤装置过滤。
如果发现滤膜 被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器。
慢病毒的浓缩与纯化 方法一超速离心沉淀法 1. 取 6 个 Ultra-clear SW28 外灯继续消毒30分钟。
2. 每个 Ultra-clear SW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。
离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫[IN A W .WTfflMfZ C JJ TO 祝3. 取一支10ml 的移液管，吸取12 ml 20% 的蔗糖溶液。
将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出 4 ml 。
同样地，将剩下8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。
另取一支干净的移液管，对剩下 3 管进行同样处理。
4. 用PBS 调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g 。
5. 按次序将所有6 个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
7. 小心将管子从转头中取出。
倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10 分钟使剩余的上清流干。
吸掉剩余的液滴。
在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS 洗下沉淀。
9. 将SW28 超速离心管插入到50ml 锥底离心管中，盖上盖子。
10. 在4 C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。
11.4 C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底。
12. 用200卩I移液器轻柔吹打使沉淀重悬。
避免产生泡沫。
将所有管中的液体集中到一个SW28 离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50卩I每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 C 。
方法二PEG-8000 浓缩法PEG （聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病毒之间的距离,使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉淀浓缩的目的。
5X PEG8000+NaCI 配制称取NaCI 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在200mI MiIIi-Q 纯水中；121 摄氏度30min 湿热灭绝30min ；保存在 4 C 。
1. 使用0.45 ym滤头过滤慢病毒上清液；3. 每20〜30min 混合一次，共进行3-5次；4. 4 度放置过夜；5. 4 度, 4000 g ,离心20min ；6. 吸弃上清,静置管子1 〜2 分钟,吸走残余液体；7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8. 集中后的病毒悬液分装成50卩每份，保存在成品管中。
用碎干冰速冻后储存在-80 C病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位：TU/ml ，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
”TU”为” transducing units ”的缩写，中文为“转导单位”，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1X 105/ml ,加入96孔板，100卩1/孔,为每个病毒准备10个孔。
放入37 C, 5%CO 2培养箱中培养。
第二天加病毒在EP 管中做10 倍梯度稀释，连续10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备10 个1.5ml EP 管，每管加入90卩1培养液，往第一个管中加入10卩1病毒原液，混匀后，吸取10^1加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10~10 -8）。
吸取96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入100卩1完全培养液，利于细胞的生长。
第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
假设为X 和Y，则滴度（TU/ml ）= （X+Y*10 ）*1000/2/X 孔的病毒液的含量（卩）。
定量PCR 法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞。
每孔细胞为5X 10 4个。
接种细胞24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N 。
弃去其他培养板中的培养基，更换为含有5卩g/ml polybrene 的新鲜培养基。
将浓缩病毒用培养基稀释200倍，也就是取1卩1病毒加入到199卩1的培养基中。
在3个培养孔中分别加入0.5卩1, 5^1和50 ^1的稀释病毒。
感染开始后20小时，除去培养上清，换为500^1含DNasel （Takara Mirus Bio ，终浓度为10 U/ml）的新鲜培养基。
在37 C 消化15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA 。
然后换为2ml 正常的培养基，继续培养48 小时。
用0.5ml 0.25% 胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37 C放置1分钟。
用培养基吹洗下，离心收集细胞。
按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组DNA。
每个样品管中加入200 ^1 洗脱液洗下DNA。
用DNA定量试剂盒定量(Bio-Rad )。
基因组DNA可以稳定保存在-20 C至少2个月。
准备PCR所需的试剂和样品。
为病毒序列检测引物配总管I :n = number of reactions. 例如：总反应数为40 ,将1ml 2 X TaqMan UniversalPCR Master Mix , 4 卩l forward primer , 4 卩l reverse primer , 4 卩l probe 和788 卩l H2O混和。
震荡后放在冰上。
为人基因组序列检测引物配总管n :n = number of reactions. 例如：总反应数为40 ,将1ml 2 X TaqMan UniversalPCR Master Mix , 100 卩l 10 X RNaseP primer/probe mix 和700 卩l H2O 混和。