胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析_俞思明
胶乳微球吸附原理
胶乳微球物理吸附
反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。
带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。
反应步骤：
1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml；
2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%；
3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。室温搅拌孵育2hr；
4. 离心或超滤，除去未结合蛋白；
5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。
注意事项：
1. 最优蛋白标记量影响因素
1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加；
2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用；
3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。
2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白，
荧光微球与抗体偶联机理
荧光微球与抗体偶联机理
荧光微球是一种具有荧光性质的微小颗粒，通常由聚合物或玻璃等材料制成。荧光微球具有较强的荧光信号，可以用于生物医学研究、生物分析和生物检测等领域。而荧光微球与抗体的偶联则是将荧光微球与特定的抗体结合，以实现对特定生物分子的检测和定量分析。
荧光微球与抗体偶联的机理主要包括两个方面：荧光微球的表面修饰和抗体的偶联。
荧光微球的表面修饰
荧光微球的表面修饰是将荧光微球表面的官能团与化学试剂反应，引入特定的官能团，以便与抗体进行偶联。常用的表面修饰方法包括羧基化、氨基化、硫酸化等。
羧基化是将荧光微球表面的羟基官能团与羧酸化试剂反应，引入羧基官能团。羧基官能团可以与氨基化试剂反应，引入氨基官能团，也可以与硫酸化试剂反应，引入硫酸基官能团。
氨基化是将荧光微球表面的羟基官能团与氨基化试剂反应，引入氨基官能团。氨基官能团可以与羧基化试剂反应，引入羧基官能团，也可以与硫酸化试剂反应，引入硫酸基官能团。
硫酸化是将荧光微球表面的羟基官能团与硫酸化试剂反应，引入硫
酸基官能团。硫酸基官能团可以与氨基化试剂反应，引入氨基官能团，也可以与羧基化试剂反应，引入羧基官能团。
表面修饰后的荧光微球表面具有特定的官能团，可以与抗体进行偶联。
抗体的偶联
抗体是一种特异性很强的蛋白质，可以与特定的抗原结合。抗体的偶联是将抗体与荧光微球表面的官能团进行化学反应，实现抗体与荧光微球的结合。
常用的抗体偶联方法包括生物素-亲和素系统、氨基酸偶联、交联剂偶联等。
生物素-亲和素系统是将荧光微球表面的生物素与抗体偶联。生物素是一种小分子，可以与亲和素结合，形成稳定的生物素-亲和素复合物。抗体可以与生物素-亲和素复合物结合，实现抗体与荧光微球的结合。
胶乳增强免疫比浊反应原理
胶乳增强免疫比浊反应原理：
免疫比浊反应原理：
当样本中的待测抗原与试剂中的特异性多克隆抗体相遇后，即可发生特异性的结合反应（一个抗原具有多个不同的抗原决定簇（反应位点），可以连接多个不同的对应位点抗体；而抗体具有两个相同的抗原结合位点，可以同时结合两个待测抗原；），从而形成网状的抗原-抗体分子复合物，引起溶液中浊度的变化，通过测试溶液中透射或散射的吸光度变化，从而确定样本中待测抗原的浓度；
胶乳增强免疫反应比浊原理：
基于免疫反应原理，和纳米颗粒的特殊效应（表面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应），不只可以检测样本中的完全抗原，也可以检测样本中的半抗原、抗体，从而引起浊度变化，此时浊度与空白样本的不同作为待测物浓度的检测依据。
免疫透射比浊法
原理：
可溶性抗原与相应抗体反应后形成的免疫复物，使介质浊度发生改变，光线通过抗原抗体反应后的溶液时，被其中的免疫复合物微粒吸收，在保持抗体过量的情况下，吸光度（A 值）与免疫复合物量呈正相关。透射光强度和形成的免疫复合物呈反比。
优点：透射比浊法灵敏度比单扩高5-10倍，重复性好，结果准确，操作简便，且能用全自动或半全自动生化分析仪进行检测。
不足：
①抗体用量较大；
②溶液中存在的抗原-抗体复合物分子应足够大（35-100nm)，分子太小则阻挡不了光线的通过；数量要足够多，如果数量太少，则溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。灵敏度较散射比浊法低；
③透射比浊测定在抗原-抗体反应的第二阶段，需在抗原抗体反应达到平衡后进行检测，耗时较长。
胶乳增强免疫比浊法
免疫比浊分析
第一节 免疫浊度分析原理
在抗体稍微过量且固定的情况下，形成的免疫复合 物量随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之增 大，即待测抗原量与反应溶液的浊度呈正相关。
免疫比浊技术分类：
透射免疫比浊法
（turbidimetric immunoassay）
散射免疫比浊法
（nephelometry immunoassay）
三、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
用抗体致敏的大小适中、均匀一致的胶乳颗粒 （一般为0.2 μm），在遇到相应抗原时，胶乳颗 粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚 ， 使透射光和散射光即出现显著变化。
三、免疫胶乳比浊法
（一）原理：
第二节 自动化免疫比浊分析
一、主流免疫比浊设备概况
（一）BN特种蛋白分析测定系统
❖ 免疫比浊分析是将液相内的沉淀反应 与现代光学仪器和自动分析技术相结合的 一项分析技术。
第一节 免疫比浊的原理 一、透射免疫比浊法 二、散射免疫比浊法 三、免疫胶乳比浊法 四、免疫比浊分析的影响因素和临床应用
第二节 自动化免疫比浊分析
第一节 免疫浊度分析原理
抗原、抗体在特定的电解质溶液中反应，形成小分 子免疫复合物（<19S），在增浊剂（如PEG、NaF等） 的作用下，迅速形成免疫复合物微粒（>19S），使反 应液出现浊度。这种浊度可用仪器检测，用吸光度表 示。
荧光微球标记抗体制备的详细步骤及问题分析
荧光微球标记抗体方法及问题分析
很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。本人总结了部分胶乳微球标记技术相关主题帖，并加以分类，以便朋友们查阅，希望朋友们继续完善或分享经验。
1. 胶乳大小选择
【求助】免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径
免疫胶乳或免疫颗粒（聚苯乙烯）的粒径- 丁香园论坛
【求助】乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体
乳胶免疫比浊中的乳胶颗粒大小与抗体- 丁香园论坛
2. 胶乳标记方法
【交流】蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上
蛋白如何偶联到聚苯乙烯乳胶颗粒上- 丁香园论坛
（求助）胶乳标记
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【求助】抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值
抗原或抗体致敏胶乳的缓冲液和pH值- 丁香园论坛
3. 胶乳标记过程问题
【求助】胶乳偶联出现絮凝
胶乳增强免疫比浊试剂稳定性问题- 丁香园论坛
【求助】胶乳增强免疫比浊中抗体交联的问题
胶乳微球物理吸附
反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。
带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。醛
类风湿因子
免疫乳胶比浊法
载体胶乳免疫比浊原理 （a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；
（b）结合后，则形成光线衰减
浊度测定亦有其弱点（一）
抗原或抗体量大大过剩时易出现可溶性复 合物，造成测定误差，测定单克隆蛋白时 这种更易出现。
浊度测定亦有其弱点（二）
反应管中抗体蛋白量始终过剩，这个值要 预先测定，使仪器定的测范围在低于生理 范围到高于正常范围之间
类风湿因子的生理作用
调节体内免疫反应； 加强加强IgG抗体清除微生物的作用; 清除免疫复合物使机体免受循环免疫复合
物损伤。
类风湿因子的病理作用（一）
类风湿性血管炎，在外周血液循环中，类 风湿性关节炎特异性RF与自身IgG分子结 合形成稳定的免疫复合物，部分被单核-吞 噬细胞系统清除，部分沉积于血管壁，激 活补体导致血管炎。
硬皮病与皮肌炎阳性率为10%—24%，滴定 度较低。
类风湿因子的临床意义（三）
高效价的RF存在并伴有严重的关节功能受 限时，常提示预后不良。在非类风湿患者 中，RF的阳性率随年龄的增加而增加，但 这些人以后发生RA者极少。
谢谢！
类风湿因子
类风湿因子（RF）：是在类风湿性关节炎 （RA）病人血清中发现的，以变性IgG为 靶抗原的自身抗体，
主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和 关节液中，是一种抗变性IgG的抗体。
类风湿因子的类型
提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球、制备方法及应用[发明专利]
![提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球、制备方法及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/08ca89ddafaad1f34693daef5ef7ba0d4a736d1c.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010644645.4(22)申请日 2020.07.07
(71)申请人 武汉生之源生物科技股份有限公司
地址 430000 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新大道818号高科医疗器械园B11号1楼、2楼、3楼(72)发明人 伍卫姣 赵愿安 赵畅 黄爱 陈婷 刘道锦 张雪娇 舒芹 (74)专利代理机构 武汉智嘉联合知识产权代理
事务所(普通合伙) 42231
代理人 丁倩(51)Int.Cl.
G01N 33/543(2006.01)G01N 33/68(2006.01)
(54)发明名称
提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球、制备方法及应用(57)摘要
本发明涉及高分子微球材料技术领域，
具体公开了一种提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球的制备方法，包括将含有氯氧基的对4‑氯甲氧基苯乙烯作为原料混合，通入氮气搅拌预乳化后，加入过硫酸钾，升温，继续搅拌反应，得到所述胶乳微球的悬浮液；滴加氯化锂水溶液破乳，减压抽滤，洗涤，离心得到胶乳微球。在聚合原料选择中添加带有氯甲氧基的苯乙烯衍生物能够提高其聚合转化率，降低胶乳微球的水化直径和表明负电荷，从而提高微球的稳定性。本发明提供的胶乳微球制备的胶乳试剂，在免疫比浊检测时的效果更佳，
稳定性更优。
权利要求书1页 说明书8页 附图2页
CN 111929435 A 2020.11.13
C N 111929435
A
1.一种提高胶乳免疫比浊法稳定性的胶乳微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析
球的相互作用总会存在 ， 而这些相互作用会 对 固定 于胶 乳微
球表面抗体蛋 白的功能特性 、空间结构 、生物 活性及其 在生 物诊断 中的应用产 生一定 的影 响，所以研 究它们之 问相互作 用 的机理 以及这些 相互作 用对胶 乳一 抗体蛋 白复合 物 中抗体
摘
要
利用共价偶联的方法制备 了胶 乳一 抗体 蛋 白复合 物 ，并采用 荧光 光谱 法对复合 物 的性质进 行 了研
究， 以揭示胶乳微球 与抗体蛋 白之 间的相互作用机理 。内源荧 光光谱分 析结果表 明 ， 共价偶联后 ，抗体蛋 白 的最大 发射峰发生显著蓝移 ， 大发射峰强 度显著 降低 ，抗体蛋 白的三级结 构发生了一定的变化 ， 最 胶乳微球 与抗体蛋 白之 间的相互作用对抗体蛋 白的内源荧光 有显著 的猝灭作 用 ， 灭效果 随着偶联体 系 ｐ 猝 Ｈ值 以及 胶乳浓度 的增加 而增强 ， 灭机制为静态猝灭 。 猝 外源荧光光谱分析结果表明 ， 共价偶联后抗体蛋 白的最大发
蛋 白性质 的影 响显得 意义重 大。近年 来 ，常用于研 究微球与
收 稿 日期 ：２ １—２２ ， 订 日期 ：２ １—６１ ０ ２０— ３ 修 ０ ２０ —０
基金项 目：国家科技部 （６ ８ ３计划） 目（ ０ ０ 项 ２ １ ＡＡ０ ２０ ） Ｎ ２ ８ ２￣ Ｎ家 自然科学基金项 目（ １ ７ ５４ 资助 ３ ０ １６ ） 作者简 介：俞思明 ，１８ ９ ５年生 ， 华南理工大学轻工与食品学院硕 士研究生
氟氧化物纳米相玻璃陶瓷Tb(0.7)Yb(5)∶FOV的合作下转换发光
氟氧化物纳米相玻璃陶瓷Tb(0.7)Yb(5)∶FOV的合作下转换
发光
陈晓波;杨国建;丁卉芬;于春雷;胡丽丽;王水锋;李崧
【摘要】报道了氟氧化物纳米相玻璃陶瓷Tb(0.7)Yb(5)∶FOV的红外量子剪裁研究,测量了从可见到红外的荧光发光光谱、激发谱、和荧光寿命,分析了{1([5 D4→7 F6](Tb3+),2([2 F7/2→2 F5/2] (Yb3+)}的红外量子剪裁现象,发现了487.0nm光激发5 D4能级和378.0nm光激发(5 D3,5 G6)能级的理论量子剪裁效率ηx％Yb 依次分别为121.35％和136.27％.首次发现了一种新颖的合作(共协)下转换发光现象{2([(5 D3,5 G6)→5 D4](Tb3+),1([2 F7/2→2 F/2](Yb+)},即首次发现施主Tb3+离子释放两个小能量光子[(5 D3,5 G6)→5 D4]的能量,导致出现一个受主Yb3+的[2 F5/2→2 F7/2]的中等能量的光子.%The present article reports the infrared quantum cutting study of the nanophase oxyfluoride vitroceramics Tb(0.
7)Yb (5. 0) : FOV. The visible to infrared fluorescence emission spectra, excitation spectra and fluorescence lifetime were measured carefully. The infrared quantum cutting phenomenon {l([5D4 →7F6](Tb3+), 2([zF7/2
JSR胶乳微球
通常使用超声波
温度控制对抗体的 避免变性很重要
均值器孔管
抗体和EDC引起软粒子的聚合。因为zate颗粒改变了他们的潜力
声波降解法能驱散聚集的粒子。饱和的吸光度是声波降解法的时间完成
分散的声波降解法是非常重要的。如果不使用声波降解法,空白校准曲线变得很高
制作胶乳试剂过程中，PH、温度、EDC用量和超声是非常重要的
最初残留物
水溶性低聚物
表面活性剂
没有净化
表面活性剂等阻碍抗体的标记
净化后
抗体和微粒很容易结合
免疫自动化仪器分析
辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫测定示意图
Vitros ECi全自动增强化学发光酶免分析仪
㈡ 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析仪
该仪器是以碱性磷酸酶标记抗原或抗体，以 顺磁性微粒子为固相载体，用AMPPD作为化学发 光剂进行测定的自动化仪器。
AMPPD发光反应原理示意图
一、吖啶酯标记化学发光免疫分析仪
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顺磁性微粒示意图
磁微粒技术
磁微粒在 电磁场中分离
磁微粒标记抗体
发光
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磁微粒
被测抗原
+
抗体
+
带丫啶酯标记物抗体
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冲洗后
双抗体夹心法
直接化学发光的机理
（1） 加入酸性H2O2 （pH<10）
IMMAGE全自动特定蛋白分析仪
(三)方法评价
国家重大科学研究计划2012年立项项目清单
国家重大科学研究计划2012年立项项目清单
项目编号项目名称项目首席
2012CB910100 代谢相关蛋白质修饰在肿瘤发生发展过程中的作用及机制赵世民复旦大学教育部上海市科学技术委员会
2012CB910200 天然免疫应答相关蛋白的鉴定、结构与功能舒红兵武汉大学教育部湖北省科学技术厅
2012CB910300 泛素－蛋白酶体：系统性发现其底物、发掘新作用机制及其生物学意义秦钧军事医学科学院放射与辐射医学研究
2012CB910400 重要G蛋白偶联受体的结构与功能研究及配体发现刘明耀华东师范大学教育部上海市科学技术委员会
2012CB910500 植物表观遗传机制与重要调控蛋白质的功能和结构研究沈文辉复旦大学教育部上海市科学技术委员会
2012CB910600 蛋白质定量新方法及相关技术研究张丽华中国科学院大连化学物理研究所中国科学院
2012CB910700 肿瘤发生发展中关键蛋白的功能与调控肖智雄四川大学教育部四川省科学技术厅
2012CB910800 炎症诱导肿瘤的分子调控网络研究林安宁中国科学院上海生命科学研究院上海市科学技术委员会中国科学院2012CB910900 植物表观遗传调控及其在重要发育过程中的作用机制及结构基础研究邓兴旺北京大学教育部
2012CB911000 蛋白质的生成、修饰与质量控制 Sarah Perrett 中国科学院生物物理研究所中国科学院
2012CB911100 病毒与宿主细胞相互作用分子机制的研究于晓方吉林大学教育部
2012CB911200 端粒相关蛋白对人类重大疾病作用机制的研究刘俊平杭州师范大学浙江省科学技术厅
胶乳免疫比浊法
胶乳免疫比浊法
胶乳免疫比浊法（immunoelectrophoresis,IPE）是一种用于测
定机体内抗原、抗体和其他物质浓度的快速、准确的分析技术，它被广泛应用于临床医疗、疾病研究、环境检测、食品安全等领域。
这种免疫比浊法是由美国科学家史蒂夫布赖斯特（Steve Briese）于1959年发明的，它利用了免疫学联合电泳来检测和定量抗体和抗原。该方法主要由以下几步组成：1）抗体样本和抗原样本混合，使
双方发生交联反应；2）将反应液置于一特定的电泳板上，使用电流
将未发生免疫反应的抗原和抗体分别迁移到不同的比浊带内；3）用
后胶乳法对免疫比浊带进行处理，使抗体和抗原相应的结合；4）在363nm波长下记录比浊带的位置，以测定抗体的浓度。
由于胶乳免疫比浊法抗体定量分析的准确性、灵敏性和特异性比其他检测方法要强，因此，该方法已经被广泛用于定量检测机体内抗体类分子与抗原之间的相互作用。
在临床医疗中，胶乳免疫比浊法常用于检测抗球蛋白（IgG）、抗体调节蛋白（IgA）、抗体结合蛋白（IgM）、抗原抗体复合物等，也可以用于检测肿瘤标志物和糖皮质激素（ACTH）等激素。此外，这种技术还被用于研究疾病的免疫学机制，检测血清中的抗原和抗体，以及免疫诊断某些疾病。
此外，由于胶乳免疫比浊法可以快速、准确的检测抗体，因此也被广泛用于食品安全检测中。例如，它可以用来检测食品中的抗生素残留、致敏物质、化学污染物等，以保证食品安全。
通过胶乳免疫比浊法可以快速准确地测量抗原和抗体的浓度，该方法在临床医学、疾病研究、环境检测和食品安全等领域具有重要的应用价值。然而，胶乳免疫比浊法也存在一些不足，例如，由于测量物质的相互作用太多，检测结果容易受干扰。此外，某些抗体、抗原和其他物质在复杂体系中可能会发生复合反应，从而使得结果不准确。
盐酸克伦特罗快速检测方法的研究进展
盐酸克伦特罗快速检测方法的研究进展
程 政
（河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳４７１０００）
中图分类号：Ｓ８１６．７９ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００５－７３０７（２０２３）０４－００１１－００４
盐酸克伦特罗（ＣＬＢ）作为一种β受体激动剂类药物，多用于临床，又因其具有促进畜禽生长、提高畜禽瘦肉率等作用而用于畜禽养殖。人食用后易造成心悸、心慌、胸闷、心律失常等并发症，因此国内外多数国家已严禁使用，我国也明令禁止在饲料中添加。
盐酸克伦特罗作为一种能在短期内迅速提升畜禽瘦肉率的肾上腺素类药物，其有效快速的检测手段一直被学者广为研究。吕睿研究出利用混合铱／硅纳米线基质，可将质谱信号提高１０倍，灵敏检测克伦特罗和其他小分子。刘文光建立了包括克伦特罗在内的１６种β 受体激动剂类药物在猪、牛、羊毛发及尿液中的超高效液相色谱串联质谱的多残留检测方法。周珊珊通过ＥＬＩＳＡ方法检测猪尿中克伦特罗残留量，分析此方法定性检出限为０．１４７μｇ／Ｌ，定量检出限为０．４９０μｇ／Ｌ。马璐瑶开发了一种基于微流纸的酶联免疫吸附测定牛奶中的盐酸克伦特罗含量，检测极限为０．２μｇ／Ｌ。张雪娇则研究了山羊体内盐酸克伦特罗的检测靶标，结果表明肝脏和尿液更为适合作残留检测靶标。而近期更有研究发现使用硼碳氧氮化物（ＢＣＮＯ）纳米片作为传感介质用于电化学检测猪血清和药片中盐酸克伦特罗有良好的稳定性和分析性，该传感器有１７ｎｇ的低检测限，为盐酸克伦特罗的检测提供了新策略。结合近年来相关的快速检测方法，如色谱法、传感器分析法、免疫分析法为盐酸克伦特罗新型检测技术提供新的思路和参考，将检测条件优化、检测效率提高，为食品及其他类别中盐酸克伦特罗残留量做出更精准的测定。
乳化交联法制备明胶微球实验报告
乳化交联法制备明胶微球实验报告
实验目的：
本实验旨在通过乳化交联法制备明胶微球，并对其形貌结构以及药物释放性能进行研究，为进一步应用明胶微球于药物载体等方面提供理论和实验基础。
实验原理：
乳化交联法是一种常用的微球制备方法，通过在水溶液中加入明胶溶液和交联剂，形成乳液，再通过撤去水相溶剂来得到明胶微球。在交联过程中，交联剂与明胶发生反应，形成稳定性良好的明胶微球。且通过调节交联剂的种类和浓度，可以控制明胶微球的粒径大小。
实验步骤
1.溶液制备：将一定质量的明胶加入到水溶液中，调节pH值和温度使明胶完全溶解。
2.药物载荷：将需要包培的药物加入到明胶溶液中，并保持搅拌使其均匀分散。
3.乳化：将明胶溶液加入到有机相中，搅拌形成乳液。
4.交联：加入交联剂，使明胶微球形成。
5.分离：通过离心或过滤等方法将明胶微球分离并洗涤。
6.干燥：将洗涤后的明胶微球放入干燥箱中，去除余留水分。
实验结果
通过扫描电镜观察明胶微球的形貌结构，发现微球呈现圆形或椭圆形，表面光滑，粒径均匀。通过光谱分析样品中药物的释放性能，发现药物在明胶微球中释放速度较慢，符合长效释放的特点。
结论
通过乳化交联法制备的明胶微球具有良好的形貌结构和药物释放性能，可以作为药物载体用于长效控释制剂的研究与应用。
实验中遇到的问题及改进措施
在实验过程中，由于明胶微球粒径较小，分离和洗涤时易遭到损坏。为此，建议在分离洗涤过程中增加一定的冷却时间，使用超滤膜等新型材料进行分离，避免微球损坏。
致谢
感谢实验室所有成员的辛勤劳动和支持，感谢指导老师的指导和帮助，使本次实验取得了圆满成功。
一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法
一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法
引言：
羧基乳胶微球是一种常用的载体材料，在生物技术、生物医学研究等领域有着广泛的应用。将羧基乳胶微球与抗体偶联可以实现抗体的定向、高效地与靶分子结合，从而用于生物分析、诊断和治疗等应用。本文将介绍一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法，以及该方法的优势和应用前景。方法：
1.材料准备：
- 羧基乳胶微球：可通过合适的乳化聚合方法制备，其粒径一般控制在100-1000 nm之间。
-交联剂：羧基乳胶微球一般表面具有丰富的羧基官能团，可通过与交联剂反应实现微球的交联，增强抗体的稳定性。
-免疫活性分子：选择与目标抗体匹配的免疫活性分子，如胺基酸、蛋白质等。
2.羧基乳胶微球表面修饰：
使用化学方法将胺基酸、蛋白质等与羧基乳胶微球反应，实现羧基乳胶微球表面的修饰和激活，增加偶联反应的效率和稳定性。
3.抗体偶联：
将修饰后的羧基乳胶微球与目标抗体进行偶联，可采用传统的化学偶联方法，如活化的EDC/NHS法、硫酸亚铁/亚砜法等。将抗体与羧基乳胶微球充分混合，在适当的反应条件下（pH、温度等），进行偶联反应。
4.反应后的处理：
偶联反应后，通过洗涤等方法去除未偶联的抗体和副产物，得到羧基乳胶微球与抗体稳定结合的产物。
优势和应用前景：
-选择合适的乳化聚合方法和交联剂，可控制羧基乳胶微球的粒径和形貌，使其具有较大比表面积和较好的稳定性。
-通过表面修饰，增加羧基乳胶微球与抗体之间的亲和力和稳定性，提高偶联效率。
-该方法操作简单、成本较低，适用于大规模生产。
-偶联的羧基乳胶微球具有良好的生物相容性和稳定性，可用于体内外生物学研究、诊断和治疗等领域。
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第３ ２卷，第８期 光谱学与光谱分析Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．８，ｐｐ
２１６６－２１７０２ ０ １ ２年８月 Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ａｕｇ
ｕｓｔ，２０１２ 胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析
俞思明１，彭运平１，２＊，于淑娟１，吕 欢１，郭 丞１
１．华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 ５１０６４０２．广州万孚生物技术有限公司，广东广州 ５１０６４０
摘 要 利用共价偶联的方法制备了胶乳－抗体蛋白复合物，并采用荧光光谱法对复合物的性质进行了研究，以揭示胶乳微球与抗体蛋白之间的相互作用机理。内源荧光光谱分析结果表明，共价偶联后，抗体蛋白的最大发射峰发生显著蓝移，最大发射峰强度显著降低，抗体蛋白的三级结构发生了一定的变化，胶乳微球与抗体蛋白之间的相互作用对抗体蛋白的内源荧光有显著的猝灭作用，猝灭效果随着偶联体系ｐＨ值以及胶乳浓度的增加而增强，猝灭机制为静态猝灭。外源荧光光谱分析结果表明，共价偶联后抗体蛋白的最大发射峰强度显著增强，且随着偶联体系ｐＨ值的升高，抗体蛋白的疏水性显著降低，随着胶乳浓度的增加，疏水性逐渐升高。
关键词 胶乳－抗体蛋白复合物；抗体蛋白；荧光光谱
中图分类号：Ｑ７１ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ
．ｉｓｓｎ．１０００－０５９３（２０１２）０８－２１６６－０５ 收稿日期：２０１２－０２－２３，修订日期：２０１２－０６－
１０ 基金项目：国家科技部（
８６３计划）项目（２０１０ＡＡ０２２８０２）和国家自然科学基金项目（３１０７１５６４）资助 作者简介：俞思明，１９８５年生，华南理工大学轻工与食品学院硕士研究生 ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｙｉｙ
ａ＠１２６．ｃｏｍ＊通讯联系人 ｅ－ｍａｉｌ：ｐｙｐ
＠ｗｏｎｄｆｏ．ｃｏｍ．ｃｎ引 言
近年来，包被有抗体／抗原的胶乳微球已被广泛应用于
免疫诊断中［
１，２］
。免疫诊断的理论基础是抗原与抗体间的特异性反应［
３］
，当抗原／抗体连接在胶乳微球表面时，一旦抗原／抗体与胶乳微球上的抗体／抗原发生特异性结合，由于胶乳的凝聚作用，免疫反应从宏观上被放大了。所以将不同的抗原／抗体连接在胶乳微球表面，通过免疫检测，可将一些常见疾病，如肝炎、流感等快速检测出来。
常用的制备胶乳－抗体蛋白复合物的方法有两种：物理吸附法和共价偶联法。由于吸附会引起固定于胶乳微球表面蛋白的部分解吸及结构的变化，所以用物理吸附法制备的胶乳－抗体蛋白复合物特异性低，在生物诊断中的应用受到限
制［
４－６］。共价偶联法能在最大限度上控制吸附法中出现的问题，成为目前制备胶乳－抗体蛋白复合物的主要方法。
在胶乳－抗体蛋白复合物的制备过程中，蛋白与胶乳微球的相互作用总会存在，而这些相互作用会对固定于胶乳微球表面抗体蛋白的功能特性、空间结构、生物活性及其在生物诊断中的应用产生一定的影响，所以研究它们之间相互作用的机理以及这些相互作用对胶乳－抗体蛋白复合物中抗体蛋白性质的影响显得意义重大。近年来，常用于研究微球与
蛋白质之间相互作用的方法主要有：荧光光谱法、紫外－可见
光谱法（ＵＶ－Ｖｉｓ）、圆二色谱法（ＣＤ）
、傅里叶变换红外光谱法（ＦＴＩＲ）及核磁共振法（ＮＭＲ）
［７－
１０］。然而，在这些方法中，荧光光谱法被认为是一种最简单、最有效的研究微球与蛋白
质间相互作用的方法［
１１，１２］
。利用共价偶联法制备了胶乳－抗体蛋白复合物，并且采用荧光光谱法研究了胶乳微球与抗体蛋白间的相互作用以及相互作用对抗体蛋白结构性质的影响，以期为胶乳－抗体蛋白复合物在生物诊断中的应用提供理论基础。
１ 实验部分
１．１ 材料与试剂
胶乳微球（粒径２２０ｎｍ），德国莫克公司；ＨＣＧ－α单克隆抗体，美国Ｓｉｇｍａ公司；１－乙基碳酰二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ），Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨ
Ｓ），均为美国赛默飞世尔科技公司；１－苯胺基萘－８－硝基苯甲酸盐（ＡＮＳ），美国Ｓｉｇｍａ公司；其余化学试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。１．２ 主要仪器
超声波细胞粉碎机（ＪＹ－９２ＩＩ型），宁波新芝生物科技股份公司；荧光光谱仪（Ｆ－４５００），日本Ｈｉｔａｃｈｉ Ｋｏｋｉ公司。１．３ 胶乳－抗体蛋白复合物的制备
取０．１ｍＬ红色胶乳微球，加入０．９ｍＬ，０．１ｍｏｌ·Ｌ－１，ｐＨ ６．０的乙磺酸缓冲液（ＭＥＳ）均匀混合后加入ＥＤＣ和Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ各５ｍｇ活化，室温下温和搅拌１５ｍｉｎ，１０ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸缓冲液（ＰＢＳ）重复清洗沉淀三遍，去上清，沉淀经０．１ｍｏｌ·Ｌ－１ ＰＢＳ重悬、振荡、超声处理后即得到活化的胶乳微球。
取４０μＬ ＨＣＧ抗体（１０ｍｇ·ｍＬ－１）加入到１ｍＬ经过活化的胶乳微球溶液中，室温下温和搅拌４ｈ，１０ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，沉淀用含０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０的ＰＢＳ（０．１ｍｏｌ·Ｌ－１）重复清洗三遍，然后用０．１ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸缓冲液（ＰＢＳ）复溶，即得到胶乳－抗体蛋白复合物溶液。
１．４ 内源荧光光谱分析
荧光光谱的测定参照文献［１３］完成。在激发波长为２９５ｎｍ（狭缝５ｎｍ）进行发射波长扫描（３２０～４００ｎｍ），每次测量前，扣除空白缓冲液背景并校正。用０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ ＰＢＳ将抗体胶乳微球浓度调整为２×１０－５～１．０×１０－４ ｍｏｌ·Ｌ－１，体系的ｐＨ值为３．０～９．０。
１．５ 外源荧光光谱分析
将１０μＬ ＡＮＳ加入到２ｍＬ样品溶液中，振荡，避光静置１５ｍｉｎ，然后在激发波长λｅｘ＝３９０ｎｍ，发射波长λｅｍ＝４７０ｎｍ条件下测定样品的荧光强度，发射波长的范围为４００～６００ｎｍ。每次测量前，用空白缓冲液扣除背景并校正。１．６ 表面疏水指数（Ｓ０）的测定
利用ＡＮＳ作为荧光探针测定胶乳－抗体蛋白复合物中抗体蛋白的表面疏水指数（Ｓ０），在ｐＨ ３．０～９．０，胶乳浓度２×１０－５～１．０×１０－４ ｍｏｌ·Ｌ－１的条件下测定了胶乳－抗体蛋白复合物中抗体蛋白的表面疏水指数的变化情况。每个样品用０．０１ｍｏｌ·Ｌ－１ＰＢ（ｐＨ ７．０）缓冲液进行稀释，使得抗体蛋白的浓度范围在０．０１～０．４ｍｇ·ｍＬ－１。每个蛋白浓度下的荧光强度差减未添加ＡＮＳ空白样品的荧光强度得到蛋白的相对荧光强度。以荧光强度对蛋白质浓度作图，初始段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数Ｓ０。
１．７ 统计分析
所有实验均重复３次，每次实验计算出平均值和标准差。利用ＳＰＳＳ软件对所有实验结果进行方差分析以确定差异显著性（ｐ＜０．０５）。
２ 结果与讨论
２．１ 胶乳－抗体蛋白复合物的内源荧光光谱分析
荧光光谱能够提供蛋白质分子中荧光生色基团所处的微环境信息，进而得到蛋白质结构变化等有用信息［１４］。有研究表明，微粒与蛋白质分子中荧光基团之间的相互作用将会引起峰强度，峰位移等荧光参数的变化，通过分析这些荧光参数的变化能获得荧光基团所处的微环境及其与微球间相互作用的规律等信息［１５，１６］。色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸为蛋白质的三种内荧光基团，赋予了蛋白质的荧光特性，其中色氨酸被认为是对环境变化最为敏感的氨基酸［１７］，所以本研究通过测定胶乳－抗体蛋白复合物中抗体蛋白上色氨酸的荧光发射光谱，探索抗体蛋白结构性质的变化以及抗体蛋白与胶乳
微球间的相互作用。
图１给出了不同的ｐＨ值条件下，胶乳－抗体蛋白复合物的内源荧光光谱图。由图１可以发现，抗体蛋白的最大发射峰显著蓝移（约１５ｎｍ）；同时，抗体蛋白的最大发射峰强度也显著降低，且随着ｐＨ值的升高而逐渐降低。图２给出了不同胶乳微球浓度条件下，胶乳－抗体蛋白复合物的内源荧光光谱图，与图１的趋势类似，抗体蛋白的最大发射峰显著蓝移，且抗体蛋白的最大发射峰强度也显著降低，随着胶乳微球浓度的升高而逐渐降低。
研究结果表明［１８，１９］，最大发射峰位移的变化可以提供荧光基团所处微环境附近极性变化的重要信息，蓝移说明蛋白质的三级结构发生了一定的变化，其色氨酸残基处于一个更为疏水的微环境中；而红移意味着色氨酸残基更加暴露于周围溶剂中。抗体蛋白的最大发射峰显著蓝移，说明抗体蛋白的三级结构发生了一定变化，其分子上的氨基酸残基处于一种更为疏水的环境中，Ｍｏｎｉｃａ［２０］报道了类似的研究结果。
除了显著的蓝移，荧光猝灭作用也非常明显。有研究表明［２０，２１］纳米微球与蛋白间的相互作用对蛋白质的内源荧光有显著的猝灭作用，猝灭效果与纳米微球的大小和浓度有关。因此可以通过研究荧光猝灭作用来揭示纳米微球与蛋白质间的相互作用。荧光猝灭效果可以用Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ方程式来描述
Ｆ０
Ｆ
＝１＋Ｋｑτ０［Ｑ］＝ＫＳＶ［Ｑ］（１） 这里的Ｆ０和Ｆ分别是有、无猝灭剂时的荧光强度，Ｋｑ为生物分子的猝灭常数，τ０为无猝灭剂时荧光团的寿命值，ＫＳＶ为Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ荧光猝灭常数，Ｑ为猝灭剂浓度。表１的给出了不同胶乳浓度下测定的ＫＳＶ值。由表１可以发现，随着胶乳浓度的增大，ＫＳＶ值逐渐增大，表明猝灭效果随着胶乳浓度的增大增强。对于生物大分子，τ０值大约为５×１０９ ｓ，
根据式（１），计算出生物大分子的荧光猝灭常数Ｋ
ｑ
值的范围为１０１２～１０１３ Ｍ－１·Ｓ－１，远远大于由动态碰撞机制得到的τ０值（２．０×１０１０ Ｍ－１·Ｓ－１）。实验中的荧光猝灭并非由动态碰撞所引起，而是形成了基态荧光基团复合物（胶乳－抗体蛋白复合物）而产生的静态猝灭
。
Ｆｉｇ．１ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｌａｔｅｘ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅｓ．（ａ：ｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｂ～ｆ：
ｐＨ ｆｒｏｍ ３．０ｔｏ ９．０）
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