TLC法测定虎杖中白藜芦醇的含量_周国海

收稿日期 : 2005 —01 —15 修订日期 : 2005 —04 —20
中白藜芦醇尚未见报道 ,为此本文对薄层扫描法测定虎杖中 白藜芦醇含量的方法进行了研究 。
1Leabharlann Baidu 实验
1. 1 材料 、仪器与试剂 材料 : 虎杖 ,采于张家界市三角坪吉首大学校园内 ,阴
干粉碎 。 试剂 : 白藜芦醇标准品 (购于 Sigma 公司) , 其它所用试
10 ml 容量瓶 ,分别用甲酸定容至 10 ml ,在同一薄层层析板上
分别点系列浓度标准品溶液 5 ul ,按上述方法层析展开 、扫
描 。以白藜芦醇浓度为横坐标 ,斑点峰面积积分值为纵坐标
绘制标准曲线 。得线性方程 :
Y = 13. 826 S ×10 - 6 - 0. 869 8
(1)
式中 Y 为白藜芦醇浓度 (μg/ mL) , S 为峰面积 (mm2) 。
11
氯仿∶丙酮∶乙醇∶水
1. 2. 2 薄层扫描条件 扫描方式 : 反射法单波长锯齿扫描 ,
波长 : 306 nm ,狭缝 : 1. 25 ×1. 25 ,线性化系数 sx = 1 ,背景校
正 : ON。
1. 2. 3 标准曲线绘制 精密称取白藜芦醇对照品 7. 8 mg ,
用甲醇定容至 10 ml ,从中分别吸取 0. 5 、1 、1. 5 、2 、2. 5 ml ,置
表 2 虎杖样品含量测定
样品名称
鲜茎 鲜根茎 鲜叶 虎杖粉
样品重 样品含水量 峰面积
(g)
( %)
(mm2)
25
44. 0
476 537
25
46. 6
774 836
25
46. 8
41 541
10
10
86 608
样品中 Resv 百分 含量 ( %)
0. 033 7 0. 548 0 0. 030 5 0. 061 3
(1. Key Lab. of Hunan Forest Products & Chemical Industry Engineering , Zhangjiajie 427000 , China ; 2. Hunan Agricultural Univ. , Changsha 410128 , China ; 3. Zhangjiajie Forestry Science Institute ,Zhangjiajie 427000 , China)
不同浓度 (40～800 ug/ ml) 的白藜芦醇标样 ,通过 TLC 法 检测 ,得到浓度与 TLC 法扫描峰面积的线性关系方程见式
(1) , r = 0. 998 5 2. 3 稳定性测定
虎杖提取液利用最佳展开剂 ,经硅胶板薄层分离后 ,利 用薄层扫描仪对其进行白藜芦醇含量测定 ,可以得到较精确
is 0. 548 % .
Key Words : TLC ; Polygonum cuspidatum ; resveratrol ; content test
虎杖 ( Polygonum Cuspidatum Sieb et Zucc) 为蓼科蓼属小灌 木 ,广泛分布于华东 、中南 、陕西 、甘肃 、四川等地区 ,为我国 传统中 药[1] 。其 根 茎 具 有 活 血 、清 热 利 湿 、止 咳 化 痰 等 作 用[2] 。现代药学研究证明其具有多种药理作用 ,发现其所含 主要活性成分白藜芦醇 ( Resveratrol) ,其化学名称为反式 3 , 5 ,4 ′—三羟基 1 ,2 —二苯乙烯 (trans —3 ,5 ,4 ′—trihydroxystilbene) , 具有抗癌[3] 、抗高血压和冠状动脉血管扩展活性 ,可以降低 大鼠的血清中总胆固醇 ,还有降血脂等作用 ,可有效地抑制 血管细胞中组织因子 TF 和细胞质的异常表达 ,防止心血管 疾病发生等方面的功能[4] 。目前至少已在 21 个科 ,31 个属 的多种植物中发现了白藜芦醇 ,在这些植物中 ,虎杖 ( Poly2 gonum cuspidatum Sieb et Zucc) 白藜芦醇的含量是最高的[5] 。 目前国内主要采用 HPLC 法进行白藜芦醇含量测定 ,没有统 一测定标准[6] 。而薄层扫描法 ( TLC 法) 广泛用于中药检测 中 ,具有精度高 、速度快 、成本低等特点 。而 TLC 法测定虎杖
摘 要 : 本文建立了虎杖白藜芦醇含量测定的薄层扫描分析方法 : 以硅胶 G为薄层吸附剂 ,氯仿∶丙酮∶乙酸∶水 (4∶4 ∶0. 5∶0. 2) 为展开剂 ,在紫外灯 (365 nm) 下观察荧光斑点 ,在 365 nm 处并进行扫描测定 ,线性方程为 : Y = (13. 826 S 3 10 - 6) - 0. 869 8 ( Y 为白藜芦醇浓度 ug/ ml , S 为峰面积) 。并对虎杖茎 、根 、叶进行了含量测定 。结果表明 : 用 TLC 法 测定虎杖中白藜芦醇含量方法简便 、快捷 、准确度高 、重复性好 。虎杖鲜根茎中含量达 0. 548 %。 关键词 : TLC 法 ; 虎杖 ; 白藜芦醇 ; 含量测定 中图分类号 : S 567. 1 + 9 文献标识码 : A 文章编号 : 1003 —5710 (2005) 03 —0011 —03
A ,减去已知样品的纯白藜芦醇量 B ,则剩余纯白藜芦醇量 A
- B (即测得的标样中纯白藜芦醇量) ,其回收率为 :
A
D
B
×100
%
2 结果
2. 1 展开剂条件的确定 从表 1 可以看出 ,在 11 种展开剂中 ,氯仿 —丙酮 —乙酸 —
水 (4∶4∶0. 5∶0. 2) 作为展开剂展开分层很好 、不拖尾 、均匀 ,故 以此为展开剂 。 2. 2 样品含量测定
从表 2 可以看出虎杖不同部位白藜芦醇的含量不同 ,其 白藜芦醇含量从高到低依次为 : 虎杖鲜根茎 > 虎杖干粉 > 鲜茎 > 鲜叶 ,其中虎杖鲜根茎的含量最高达 0. 548 % ,虎杖鲜 叶最低 ,仅为 0. 030 5 % ,含量相差达 18 倍 ,而同为虎杖根的 鲜根茎与虎杖干根粉 ,含量也相差 9 倍 。
表 1 虎杖中白藜芦醇在薄层层析中展开剂的选择
编号
展 开 剂
比 例
展开与分离效果
1
氯仿∶乙醇∶水
2
氯仿∶乙醇∶水
3
氯仿∶乙醇∶水
4
氯仿∶甲醇∶水
5
氯仿∶丙酮∶甲醇∶水
6
正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇
7
正丁烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶水
8
氯仿∶丙酮∶乙醇∶水
9
氯仿∶丙酮∶乙醇∶水
10
氯仿∶丙酮∶乙醇∶水
1. 2. 4 稳定性测定 取同一样品点于同一薄层板上 ,按上
述方法层析展开 、扫描 ,根据面积计算相对偏差 。
1. 2. 5 回收率测定 取一已测样品 (纯白藜芦醇量为 B ) 与
同体积标样 (纯白藜芦醇量为 D) 混合点于同一薄层板上 ,按
上述方法层析展开 、扫描 , 并计算出混合样中纯白藜芦醇量
2 2 2 2 2 2 2
扫描面积 (mm2) RSD( %)
98 567
30 109
31 400
29 031
4. 6
30 801
31 007
28 157. 9
表 4 TLC 法回收率测定
的虎杖白藜芦醇含量 (见表 3) 。 2. 4 回收率测定
从表 4 可以看出 ,采用 TLC 法测定虎杖中白藜芦醇回收 率较高 ,为 100. 6 %。
表 3 稳定性测定结果
样品
标样 (440 ul / ml) 鲜根茎 1 鲜根茎 1 鲜根茎 1 鲜根茎 1 鲜根茎 1 鲜根茎 1
点样量 (ul)
剂均为国产分析纯 。 仪器 : CS —9000 型薄层扫描仪 (日本岛津公司) ,硅胶 G
板 (日本) ,定量毛细管点样器 (DRUMMOND U. S. A) , RE540 薄膜 ,旋转蒸发仪 (日本大和公司) ,FD —230 红外水份测定仪 (日本大和公司) ,10 万分之一天平 (日本岛津) 。 1. 2 方法 1. 2. 1 薄层层析展开剂条件的摸索 首先采用纸层析做预 备实验 ,摸索层析展开剂条件 ,然后利用此展开条件在硅胶 G板上展开 ,具体做法为 : 取硅胶 G 板 ,于 105 ℃活化 0. 5 h 后点样 ,置于展开剂中直立上行展开 17 cm 取出 ,60 ℃烘干 ,
Abstract : A thin layer scanning method was established for the determination of resveratrol in Polygonum cuspidatum. Using silica gel as the layer plate and CHCl3 —CH3COCH3 —CH3COOH —H2O (4∶4∶0. 5∶0. 2) as the developing system , scanning by ultra2light (306 nm) . The linearity is Y = (13. 826 S 3 10 - 6) - 0. 869 8 ( Y : the content of reseveratrol ug / ml , S : area of the peak) . And determine content of resveratrol in rootstems、roots、leaves of Polygonum cuspidatum. The result shows that the content of resveratrol in fresh rootstems of Polygonum cuspidatum
展开不均匀 ,拖尾 展开不均匀 ,拖尾 展开为均匀 ,拖尾 分层不好 分层不好 拖尾 ,分层不好 拖尾 ,分层不好 拖尾 ,分层不好 分层较好 ,不够均匀 分层较好 ,不够均匀 分层很好 ,均匀
图 1 样品含量测流程
用定量毛细管点样器分别吸取系列白藜芦醇标准液各 5 ul ,样品液 5 ul ,点于同一薄板上 ,依上述实验条件展开 ,扫描 测定 ,测定结果见表 2 。
滤液在 45 ℃减压条件下分别浓缩去掉乙酸乙酯 ,用甲 醇溶解并定容至 10 ml 。作为样品溶液 (即待测液) 。以上操 作流程见图 1 :
8∶1∶1 8∶1∶2 4∶1∶2 8∶1∶1 4∶4∶0. 5∶0. 2 30∶10∶0. 5 4∶4∶0. 5∶0. 2 4∶4∶1∶0. 5 4∶4∶0. 3∶0. 2 4∶4∶0. 2∶0. 2 4∶4∶0. 5∶0. 2
·1 2 ·
在 365 nm 紫外灯下观察荧光斑点 。 取 20 cm ×20 cm 的新华层析纸 ,点上白藜芦醇标样与虎
杖白藜芦醇样品溶液 ,置于不同展开剂中 ,上行展开 17 cm ,
周国海 ,等 : TLC 法测定虎杖中白藜芦醇的含量
60 ℃烘干 ,在可见光及紫外光下观察斑点 ,其结果见表 1 。 从表 1 可以看出 ,以氯仿 —丙酮 —乙酸 —水 (4∶4∶0. 5∶0. 2) 作为 展开剂分离很好 、均匀 ,故以此为展开剂 。
称取虎杖鲜叶 、鲜茎 、鲜根茎各 25 g ,虎杖干粉 10 g ,用快 速水份测定仪测定样品含水量 ,分别加入适量的乙酸乙酯研 磨匀浆 。将鲜根茎 、鲜叶 、鲜茎乙酸乙酯提取液定容到 250 ml ,干根粉乙酸乙酯提取液定容至 100 ml ,放在 4 ℃冰箱中 , 静置浸泡 48 h 后用砂芯漏斗过滤 。
Detecting content of resveratrol in Polygonum cuspidatum by TLC
ZHOU Guo2hai1 , YU Hua2zhong1 , LI Guo2zhang1 , CAO Yong1 , RAO Li2qun2 , LONG Wei2zhen3 , TANG Zhong2hai2
湖南林业科技 2005 年第 32 卷第 3 期
研究报 告
TLC 法测定虎杖中白藜芦醇的含量
周国海1 , 于华忠1 , 李国章1 , 曹 庸1 , 饶力群2 , 龙维珍3 , 唐忠海2
(1. 湖南省林产化工工程重点实验室 , 湖南 张家界 427000 ; 2. 湖南农业大学 , 湖南 长沙 410128 ; 3. 张家界市林业科学研究所 , 湖南 张家界 427000)