基因工程中限制酶的选择及的筛选方法
新人教《生物技术与工程》高考总复习：第7讲 重点研究“基因工程操作中限制酶的选择和PCR技术”
解析：(1)根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的酶EcoR Ⅰ是一 种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之 间的磷酸二酯键断开。(2)步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的 作用是催化相邻核苷酸之间的3′羟基和5′磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中， 升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作 用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3′端，合成DNA子链。(3)引物的作用是使 DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子 链的5′端向3′端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为④ 和②。(4)分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoR Ⅰ切割后产生的黏性末端，因 此其5′端序列应为AATT，3′端序列应为TTAA，B正确。
答案：(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ (2)磷酸二 酯键 (3)自我复制 一个至多个限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养 宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 (4)位于基因首端的一段特 殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
1．(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出 更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性 内切核酸酶的切割位点如图所示。
考点加强课5 基因表达载体构建中限制酶的选择原则
限制酶选择的三大依据
1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
图1
（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ（目的基因两端均具PstⅠ）。
（2）不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
（2）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
（1）所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
（2）质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该
质粒上唯一的标记基因而不宜选择。
（3）所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点（如图2中KpnⅠ）。如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
（4）所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中Hin dⅢ会破坏启动子，Eco RⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。（分析如下）
基因工程中限制酶的选择及的筛选方法
基因工程中限制酶的选择及的筛选方法
摘要:基因工程是现代生物科技专题的重要内容,基因工程四部曲中的核心内容是基因表达载体的构建，在构建表达载体过程涉及的限制酶的种类以及筛选方法成为考试的热点内容。本文结合三道例题将限制酶的选择和筛选方法结合在一起进行比较分析.
关键词：限制酶筛选
1 单酶切及筛选
若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端，因而可能出现多种连接方式如①质粒和质粒②目的基因和目的基因③质粒的自身环化，目的基因的自身连接④质粒与目的基因的连接。质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种。若启动子在质粒上，目的基因与质粒的反向连接则导致三联体密码顺序改变,起始密码子和终止密码子位置改变,使得翻译不能正常进行而无法得到正常的表达产物。
例1：（2012江苏生物高考33题部分)图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为
C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题
若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒,那么应选用的限制酶是。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌,一般需要用添
加的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是。答案: BamH I 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向链接
笔者认为可通过免疫学方法检测目的基因的表达产物排除反向连接的重组质粒，或分别在质粒和目的基因上设计相同的限制酶识别位点，然后用该酶去切割重组质粒，正向连接和反向连接便会得到不同长度的DNA片段，再根据已知的限制酶在目的基因的位置进行比对，找到正确连接的重组质粒。
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作
基因工程的基本操作包括以下几个步骤：
1. 取得目标基因：首先需要获得目标基因的DNA序列。这可以通过多种方法实现，如克隆、PCR扩增、合成等。
2. DNA切割：将目标基因从DNA样本中分离出来，通常需要用到一种特殊的酶——限制性内切酶。这些酶可以在DNA的特定序列处切割，从而得到目标基因的DNA片段。
3. DNA连接：将目标基因的DNA片段与载体DNA连接在一起。载体DNA是一种能够自复制的DNA分子，可以在细胞中稳定存在。连接的过程通常需要使用DNA连接酶。
4. 转化：将连接好的DNA载体导入宿主细胞中。这可以通过多种方法实现，如电穿孔、热激击等。
5. 克隆和筛选：选择合适的宿主细胞，并用培养基培养细胞，使其增殖。通过筛选方法，如抗生素筛选、荧光检测等，筛选出带有目标基因的克隆。
6. 验证：对获得的克隆进行验证，确认目标基因已经成功导入宿主细胞，并且在细胞中表达。
7. 基因表达和应用：利用已经导入细胞中的目标基因进行进一步的研究。可以通过控制基因的表达水平，探究基因的功能和
调控机制。同时，还可以利用基因工程技术将目标基因导入其他生物体，实现特定性状的改良和应用。
基因工程所需要的酶
基因工程所需要的酶
引言
基因工程是一项重要的生物技术，它利用酶的特殊功能来改变生物体的遗传信息。酶在基因工程中起着关键作用，它们能够催化特定的化学反应，使得基因组中的DNA序列发生改变。本文将介绍基因工程中常用的酶以及它们在不同的应用领域中
的作用。
常用酶及其功能
1. 限制性内切酶
限制性内切酶是一类能够识别DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶。它们广泛应用于基因工程中的DNA重组、克隆和测序等领域。限制性内切酶根据其识别位点和切割模式被分类为不同类型，如EcoRI、BamHI等。这些酶可以将DNA分子切割成
片段，并产生粘性或平滑末端，为后续操作提供方便。
2. DNA连接酶
DNA连接酶是一种能够将两个单链DNA或RNA分子连接成一个完整双链分子的酶。
它们在基因工程中常被用于连接DNA片段，构建重组DNA分子。T4 DNA连接酶是
常用的DNA连接酶之一，它能够将DNA片段连接成环状或线性结构。
3. 核酸聚合酶
核酸聚合酶是一类能够催化DNA或RNA的合成的酶。在基因工程中，核酸聚合酶被广泛应用于PCR（聚合酶链式反应）和基因克隆等领域。其中，Taq DNA聚合酶是PCR反应中最常用的核酸聚合酶之一，它能够耐高温，并具有高度特异性和高效率。
4. 核酸修复酶
核酸修复酶是一类能够修复DNA损伤和错误的酶。在基因工程中，核酸修复酶被用于修复突变的DNA序列，纠正基因组中的错误。CRISPR-Cas9系统利用Cas9核酸
修复酶来导向性地切割和编辑目标DNA序列。
5. 核苷三磷脂转移ase
核苷三磷脂转移ase（NTPase）是一类能够催化核苷三磷酸与核苷二磷酸之间的磷
高考生物二轮复习专题专练(31) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
高考生物二轮复习专题专练
(31) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建从“高度”上研究高考
[典例](2021·福建高考)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类
广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因
导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(图1甲)，通过PCR扩增MT基因。
已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应
为__________。
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有
能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的
酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用____________酶将载体P切开，再用__________(填“T4 DNA”或“E.coli DNA”)连接酶
将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的____________和______________。选用____________酶组
合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DNA连接酶进行连接，将
得到的混合物导入到用________离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构
建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是_____________
____________________________________________________________。
专题9 现代生物科技专题 精研重难点(2) 基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建
(2)①为得到平末端，可用EcoRⅤ或SmaⅠ切割载体P，但后续需进一步将重组 载体P′中的MT基因接入载体E，此时需将MT基因插入XhoⅠ和PstⅠ两个酶切 位点之间，故选EcoRⅤ将载入体P切开；由于E.coli DNA连接酶只能连接黏性 末端，而T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端，结合题意可知， MT基因的末端为平末端，故需要用T4 DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构 成重组载体P′。②由图1可知，载体P′不含有表达MT基因的启动子和终止子； 为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图1可知，载体 P′和载体E均含有Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点，故可选用Xho Ⅰ和Pst Ⅰ酶进行酶 切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是感受态细胞法，需用钙离子处理大肠杆 菌。(3)由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定， 故即使MT工程菌的MT蛋白相对表达量较高，也无法说明已经成功构建能较强 吸附废水中重金属的MT工程菌。
B．NdeⅠ和XbaⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
解析：构建重组质粒时，要将目的基因插入到启动子和终止子之间，而且不能 破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位。故只能选用Nde Ⅰ 和BamH Ⅰ切割质粒，因此在PCR扩增的该基因的两端需分别引入Nde Ⅰ和 BamH Ⅰ两种限制酶的识别序列。 答案：A
第5章基因工程基本流程-筛选与鉴定
3
4
pBR322抗生素标记选择 （1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 （2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮 酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Ampicillin） （蓝灰色）褪色。
（3）环丝氨酸： 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。
5
选择过程
13
4. 噬菌斑筛选法 原理 以λ-DNA为载体的重组DNA分子经体外包装后转染受 体，转化子在培养板上形成噬菌斑。 取代型载体，噬菌斑即为重组子； 插入型载体需进行二次选择
14
选择过程
15
基于克隆片段序列的筛选与鉴定
1. PCR鉴定法 原理： 针对已知目的片段特异性扩增。包括：区分重组 子与非重组子、期望重组子与非期望重组子、目 的片段是否整合在受体基因组上。 PCR鉴定法不适用于大规模转化子的鉴定。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位 溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
42
②酶联免疫吸附测定（ELISA） 原理： 一抗（primary antibody）：与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linked）二抗： 携带能催化无色底物转变为有色物质（或发光）的酶， 再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推 测目标分子的含量。
[2020高考生物复习江苏]考点加强课6 限制酶的选择与目的基因的检测与鉴定
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1.限制酶的选择原则
（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图甲可选择PstⅠ.
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,以防破坏目的基因,如图甲不能选择SmaⅠ.
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和Eco R Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）,而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子.
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以确保具有相同的黏性末端.
②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结
构,应至少含有一个完好的标记基因,如图乙中限制酶pstⅠ因其会破坏标记基因而不宜选择.
③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点,如果所选酶的切点不止一个,则切割重组后可能会丢失某些片段,若丢失的片段含复制原点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制.
④所选限制酶,其切点应位于启动子与终止子之间,如图乙中Hin dⅢ会破坏启动子,Eco RⅠ会破坏终止子,而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间.
（3）参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T－DNA片段,则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中,从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上,如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA,获得含目的基因的片段.若利用该片段构建基因表达载体,则下图中甲、乙、丁,Ti质粒均不宜选择,而丙Ti质粒宜选取.（分析如下）
考点加强课5限制酶选择的三大依据
限制酶选择的三大依据
1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
图1
(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ(目的基因两端均具PstⅠ)。
(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。
(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图2中KpnⅠ)。如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
(4)所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中Hin dⅢ会破坏启动子，Eco RⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。(分析如下)
第5章 基因工程基本流程-筛选与鉴定.
表型筛选加酶切筛选
T A A T
33
8. DNA序列测定
原理：
通过对插入片段序列的测定确定是否是所需的重组子
34
选择过程 双脱氧末端终止法 化学降解法 焦磷酸降解法 高通量Solexa测序
……
35
36
基于外源基因表达产物的筛选与鉴定
针对表达载体的检测方法
1. 蛋白质功能检测
原理： 外源基因编码具有特殊功能的酶或活性蛋白，根 据抗原抗体反应原理，针对该表达产物设计相应
25
选择过程 Northern blot流程
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6. 直接电泳检测
原理： 有插入片段的重组载体分子量比野生型载体分子量大
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选择过程
从转化后的 菌体克隆中 分离质粒， 电泳、比较 其分子量。
分子量 Marker
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重组 克隆
载体
7. 限制性酶切图谱法 限制性酶切图谱：核酸经限制性内切酶消化成片段，用 电泳方法分离，不同的核酸形成的各自独特的条带图谱。
6
无环丝氨酸培养基
7
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉 素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
8
2. -半乳糖苷酶显色反应筛选法
乳糖
X-gal
-半乳糖苷酶
半乳糖
热点专题09基因工程中限制酶的选择-2023年高考生物临考热点梳理解读精讲课件
2021年山东卷25题
人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋
白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表的抑制，可对
某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片
【典型例题】
例1. 研究者欲将某改良基因导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基 因及一些酶切位点，结构如图乙。为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶 XmaI而不选用限 制酶 Sma Ⅰ的原因是_S_m__a_l的___酶__切__末__端__为__平__末__端__，__无__法__与__改__良__基__因__上__的__黏__性__末__端__连__接__。为将改良基 因构建在质粒上，还需要_B__g_lⅡ__、__D_N__A_连__接__酶______等酶。（2022淄博一模节选）
（4）还要注意转录方向。如图C不能选择EcoR Ⅰ和HindⅢ。
五、比较单酶切和双酶切
①单酶切和双酶分别切割法（用两种能产生相同末端的限制酶切割）
缺点:
A. 质粒重新环化 B. 目的基因自身环化 C. 质粒与目的基因反向连接
优点:
A. 防止质粒重新环化 B. 防止质粒与目的基因反向连接 C. 防止目的基因自身环化
基因工程常见限制酶识别虚列
基因工程常见限制酶识别虚列
基因工程中常见的限制酶有很多种，它们是一类能够识别特定DNA序列并在该序列上切割的酶。这些限制酶在基因工程中起着至关重要的作用，可以用于DNA片段的定向切割、连接和修饰，从而实现对基因组的改造和重组。常见的限制酶包括EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等。
EcoRI是一种由大肠杆菌产生的限制酶，它能够识别并切割DNA 序列GAATTC，产生粘性末端。BamHI也是一种常用的限制酶，它识别并切割DNA序列GGATCC，同样产生粘性末端。HindIII则识别并切割AAGCTT序列，同样产生粘性末端。XhoI则识别CTCGAG序列并切割DNA，同样产生粘性末端。
这些限制酶的识别序列和切割方式各不相同，因此在基因工程中可以根据需要选择合适的限制酶来进行DNA片段的定向切割和连接。同时，这些限制酶也可以用于构建重组DNA、载体的构建以及基因的插入和删除等操作。
除了上述常见的限制酶外，还有许多其他限制酶，它们各自具有特定的识别序列和切割方式，为基因工程提供了丰富的工具和手
段。在实际操作中，科研工作者可以根据实验需求选择合适的限制酶，从而实现对DNA序列的精确操作和改造。总之，限制酶在基因工程中发挥着重要作用，为基因组编辑和重组提供了有力的技术支持。
如何选择限制酶、重组DNA的筛选等
如何选择限制酶、重组DNA的筛选等
1．（2023江苏高三统考）基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失，从而使部分功能被屏蔽的技术。来源于λ噬菌体的Red同源重组系统由λ噬菌体的exo、bet、gam3个基因组成，分别编码EXO、BET、GAM3种蛋白质，可用于大肠杆菌等一系列工程菌的基因敲除。Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失；由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖诱导表达。λ-Red系统介导的基因敲除过程如下图所示。请回答下列问题：
（1）EXO为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，从5′向3′降解DNA单链，产生_____（选填“3′或5′”）黏性末端；BET结合在EXO外切产生的末端单链上，促进其与受体细胞的靶序列进行同源重组，替换靶基因；GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，进而_____（选填“抑制”或“促进”）受体细胞对外源DNA的降解。（2）要将pKD46导入大肠杆菌，首先需用Ca2+处理大肠杆菌，目的是
_________________________。为使pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必需满足的培养条件是___________________。过程I是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，说明_____________________。
（3）用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因时，同时需考虑将大肠杆菌基因组DNA上特定靶基因敲除。图中含HAⅠ的引物由两部分组成，其中HAⅠ的碱基序列应该与
例析基因工程中限制酶的选择及相应的筛选方法
了筛 选出含重组质粒 的大肠杆菌 ．一般需 要 用添加 的培养基进行培养 经检测 ． 部分 含有 重组质粒 的大 肠杆菌菌株 中 目的基 因 Ｄ
培 养基除 了含有细菌生 长繁殖必需 的成 分外． 培养基 Ａ和培养基 Ｂ分别 还含有 ．
一
单酶切及筛选
盎
一
若用同一种限制酶切 割质粒和 目的基因 形成相同的 四个黏性末 端 ．因而可能 出现多
位点 分别为Ｇ Ａ Ａ Ｔ ｌ Ｔ Ａ Ａ Ｔ Ｆ Ｃ ， Ｇ ｌ Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ ， Ｃ 』
Ｔ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ 请 回答下列问题 ： （ １ ） 在用 图中的质粒和外源 Ｄ Ｎ Ａ构 建重 组质粒时 ． 需要对 质粒改造 ． 构建新 的限制酶 切位点 试写 出构建 需要的限制酶切位 点的
（ 一） 插入失活筛选法 例２ ： （ 苏锡 常镇 ２ ０ １ ２ 届高三教 学调研测 试） Ｍ ｓ ｅ Ｉ ． Ｅ ｃ ｏ Ｒ Ｉ ． Ｐ ｓ ｔ Ｉ 识 别 的碱基 序列 和切 割
根据插 人失活原理设计 的筛选重组体 分
子的方法 ． 需要进行菌 落平 板的影印复制 ， 才 能识别 出由此而丧失的表 型特征 ． 这会给重组 Ｂ 一 半乳糖苷酶显色反应选择法。
学 羁 ２ ０ １ ３ 年 第 １ ２ 期
陈佳 昕 ｆ 江 苏省 常 州北郊 高级 中学 ２ １ ３ ０ ３ １ ）
高中生物高考专题13 基因工程(原卷版)
2020届高考生物难点及易错题精讲精练
专题13 基因工程
【难点精讲】
一、限制酶的选择
例题：（2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了Eco RⅠ、Bam H Ⅰ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经Bam HⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接，理由是_______________________________________________________________________________。（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA 分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有，不能表达的原因是
______________________________________________________________。
图（c）
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有和，其
中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_________。
【难点突破】
（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco R Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。
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基因工程中限制酶的选择及的筛选方法
摘要:基因工程是现代生物科技专题的重要内容，基因工程四部曲中的核心内容是基因表达载体的构建，在构建表达载体过程涉及的限制酶的种类以及筛选方法成为考试的热点内容。本文结合三道例题将限制酶的选择和筛选方法结合在一起进行比较分析。
关键词:限制酶筛选
1 单酶切及筛选
若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端，因而可能出现多种连接方式如①质粒和质粒②目的基因和目的基因③质粒的自身环化，目的基因的自身连接④质粒与目的基因的连接。质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种。若启动子在质粒上，目的基因与质粒的反向连接则导致三联体密码顺序改变，起始密码子和终止密码子位置改变，使得翻译不能正常进行而无法得到正常的表达产物。
例1: (2012江苏生物高考33题部分)图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为
C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题
若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是。答案: BamH I 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向链接
笔者认为可通过免疫学方法检测目的基因的表达产物排除反向连接的重组质粒，或分别在质粒和目的基因上设计相同的限制酶识别位点，然后用该酶去切割重组质粒，正向连接和反向连接便会得到不同长度的DNA片段，再根据已知的限制酶在目的基因的位置进行比对，找到正确连接的重组质粒。
2 双酶切及筛选
因为用单酶切会出现质粒与目的基因的任意连接，所以在实际操作中多使用双酶切。双酶切可以避免质粒的自身环化，目的基因的自身连接和目的基因和质粒的反向连接，而目的基因与目的基因的连接因为没有抗生素抗性基因所以可以在含有该抗生素的培养基上去除，故只剩下质粒与质粒，以及质粒与目的基因的重组体。
2.1插入失活筛选法
例2：（苏锡常镇2012届高三教学调研测试）MseI，EcoRI，PstI识别的碱基序列和切割位点分别为GAAT↓TAATTC，G↓AATTC，C↓TGCAG。请回答下列问题：
1)在用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，需要对质粒改造，构建新的限制酶切位点。试写出构建需要的限制酶切位点的过程(提供构建需要的所有条件)：
①首先用酶处理质粒；
②然后用DNA聚合酶等处理质粒；
③再运用酶处理质粒，从而形成新的限制酶切位点，可被酶识别。
(2)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。下图表示运用影印培养法(使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入大肠杆菌。
图3
培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基A和培养基B分别还含有，。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是菌落中的细菌。答案：（1)EcoRI，DNA连接，MseI(2)四环素青霉素（四环素和青霉素）4和6
用限制酶MseI和PstI同时切割含目的基因的DNA和质粒，但原有质粒上无MseI识别位点，需利用EcoRI识别位点重新构建MseI识别位点。
在抗青霉素基因内部具有重新构建的MseI识别位点，当用MseI和Pst I同时切割含目的基因的外源DNA和质粒，由于目的基因的插入，导致抗青霉素基因出现功能性失活，于是所形成的重组质粒都将具有四环素抗性和对青霉素敏感。将转化的细菌接种在含四环素的培养基上，一段时间后可得到全部受体菌菌落，将灭菌的绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含青霉素的培养基上。含重组质粒的受体菌能在四环素培养基上生长却无法在青霉素培养基上上生长。上题实际是运用插入失活[1]效应检测外源DNA。
根据插入失活原理设计的筛选重组体分子的方法，需要进行菌落平板的影印复制，才能识别出由此而丧失的表型特征，这会给重组体的筛选工作增加不少麻烦，由此而发展出β-半乳糖苷酶显色反应选择法[1]。
2.2 β-半乳糖苷酶显色筛选法
例3:（盐城市2012届高三二模）大肠杆菌pUCl8质粒上的LacZ基囚可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落；反之，则形成白色菌落。由此推知，选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、
氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入物质。成功导人重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成色的菌落，原因是。
图四
选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入IPTG，X-gal和氨苄青霉素。只有导入质粒的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长繁殖，而重组质粒中的LacZ基囚因插入目的基因不能正常表达，所以无法表达β-半乳糖苷酶，培养基呈白色。答案：IPTG X-gal 氨苄青霉素：白色；重组质粒中的LacZ 基因因插入目的基因而不能表达
3平端位点问题
构建重组质粒时常会出现平端位点，平端DNA可用T4DNA连接酶连接，平端连接可使载体和外源DNA连接序列上的原有限制位点消失，而不含外源插入DNA的载体，经自连成环后仍保留原有的限制位点。基于这一特性，使用特定限制酶处理连接混合物将能专一性地使自连载体DNA线性化，能抗酶解的重组DNA则依然保持环状。
主要参考文献
[1]吴乃虎.基因工程原理.第二版.北京:科学出版社,1998.372
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