如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性
DNA序列比对同源性分析图解BLAST
1、进入网页：/BLAST/
2、点击Search for short, nearly exact matches
3、在search栏中输入引物系列：
注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
（1）输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。
这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。
（2）简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。
A、输入上游引物空格输入下游引物
B、输入上游引物回车输入下游引物
4、在options for advanced blasting中：
select from 栏通过菜单选择Homo sapiens
Expect后面的数字改为10
5、在format中：
select from 栏通过菜单选择Homo sapiens Expect后面的数字填上0 10
6、点击网页中最下面的“BLAST！”
7、出现新的网页，点击Format！
8、等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。（1）图形格式：
图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分
图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补
图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配
图解blast验证引物教程1
图解blast 验证引物教程
——以文献报道的人类的ABCG2的引物为例
1、 进入网页：/BLAST/
2、 点击Basic BLAST 中的nucleotide blast 选项
3、 完成2操作后就进入了Basic Local Alignment Search Tool 界面 （1）在Enter Query Sequence 栏中输入引物序列：
注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
简便的做法是同时输入上下游引物。输入上下游引物系列都从5’— 3’。 输入上游引物后，加上≥20个字母n ，再输入下游引物，如下图：
生 物 秀
（2）在Choose Search Set 栏中：
Database 根据预操作基因的种属定了，本引物可选Human genomic + transcript
或Others (nr etc.)。本人倾向于选后者，觉得此库信息更多。如下图：
（3）在Program Selection 中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图：
（4）在此界面最下面：如下图
生物秀-专心做生物
w w w .b b i o o .c o m
Show results in a new window 项是显示界面的形式，可选可不选，在此我们选上了。关键要点击Algorithm parameters 参数设置，进入参数设置界面。
4. 参数设置：
（1）在General Parameters 中：Expect thresshold 期望阈值须改为1000，大于1000也可以；在Word size 的下拉框将数字改为7。如下图：
Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具
Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具
一、Primer-BLAST介绍
Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。Primer-Blast可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接用下面的链接进入：/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。
二、Primer-BLAST的输入
Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。跟其它的BLAST 一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。
（1）模板（Template）
在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。
引物验证方法范文
引物验证方法范文
1.比较序列法（比对法）：这是一种基于引物与目标序列的比对，通过比较两者的相似性来进行引物验证的方法。首先，将引物序列与目标序列进行比对，然后利用一些比对算法计算两者之间的相似性分数。如果相似性分数较高，则说明引物与目标序列非常匹配，可以用于实验。相反，如果相似性分数较低，则需要重新设计引物。
2. 引物特异性验证：这是一种通过引物特异性验证引物与目标序列之间的选择性结合的方法。主要包括两个方面的验证：第一是通过BLAST 等工具对引物序列进行比对，确保引物与目标序列是唯一匹配的；第二是通过在PCR反应中引入阻断试验（Melt curve analysis）等技术来检测引物的特异性。阻断试验可以通过观察引物与非特异性序列之间的结合情况来验证引物的特异性。
3.引物稳定性验证：这是一种通过分析引物的理化性质来验证引物的稳定性的方法。稳定性是指引物是否会发生降解、氧化或变性等情况，这些都会影响引物与目标序列的结合。常用的验证引物稳定性的方法主要有电泳、测序等。通过在实验室条件下模拟引物受到的各种环境因素，观察引物的稳定性变化情况，并根据变化情况选择最佳的引物。
4.引物效能验证：这是一种通过实验检测引物的效能的方法。它可以通过PCR扩增、酶切等实验来检测引物的效能。首先，将引物与目标序列一起进行PCR扩增，观察扩增产物的纯度、数量、特异性等。如果扩增产物满足预期的要求，则说明引物的效能较高。此外，还可以通过酶切反应来验证引物的效能。将引物与目标序列一起与特定的酶进行反应，观察酶切产物的大小和数量。
blast验证引物
（3）结果详细信息
序列的信息
上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的 匹配情况： 共有21个碱基匹配，得分42.1分【21×2＋ 0.1＝42.1】，E值为0.014 上游引物与序列的1～21位点匹配
结果判断： ①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示 的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性 没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分 值很低，该引物就可能不适合用 ②检测该对引物是否可与其它序列匹配，引起PCR的非 特异性扩增。如果找到了你的目的基因名称，而且找到 了一大批同物种的不同基因，（上下游引物分别搜索到 相同的基因），而且分数也较高。这时表明你的引物设 计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特 异性产物。
特殊blast
先将待查询的核酸序列和核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻 译成蛋白质序列，然后再将两种翻译结果从蛋白质水平进行查询。
ATGTTGGGGAAATGCTTGACC
引物序 列输入 窗口 数据库的选择 在此，我们选择 第三个数据库 输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样 方法在进行下游引物的blast程序。在结果分析特异 性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下 游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。 显示结 果在新 的窗口
1. 进入网页： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi
blast验证引物
特殊blast
先将待查询的核酸序列和核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻 译成蛋白质序列，然后再将两种翻译结果从蛋白质水平进行查询。
ATGTTGGGGAAATGCTTGACC
引物序 列输入 窗口 数据库的选择 在此，我们选择 第三个数据库 输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样 方法在进行下游引物的blast程序。在结果分析特异 性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下 游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。 显示结 果在新 的窗口
Байду номын сангаас
1. 进入网页： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi
Blast的页面
常见生物基因组的blast
核酸序列数据库查询；
蛋白质序列数据库 先将待查询的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列，然后将翻译结果 对蛋白质序列数据库进行查询； 先将核酸序列数据库中的核酸序列按六种可读框架翻译成蛋白质序列， 然后将待查询的蛋白质序列及其互补序列对其翻译结果进行查询；
（3）结果详细信息
序列的信息
上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的 匹配情况： 共有21个碱基匹配，得分42.1分【21×2＋ 0.1＝42.1】，E值为0.014 上游引物与序列的1～21位点匹配
结果判断： ①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示 的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性 没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分 值很低，该引物就可能不适合用 ②检测该对引物是否可与其它序列匹配，引起PCR的非 特异性扩增。如果找到了你的目的基因名称，而且找到 了一大批同物种的不同基因，（上下游引物分别搜索到 相同的基因），而且分数也较高。这时表明你的引物设 计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特 异性产物。
如何用Primer-Blast设计和验证引物
如何⽤Primer-Blast设计和验证引物
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今天⽼谈给⼤家推荐NCBI的⼀款在线⼯具Primer-BLAST，⽤于PCR的特异性引物设计和特异性检验。
推荐的指数：5颗星。
理由：操作简单，使⽤⽅便，不需要安装程序，⽽且和NCBI数据库已⽐对，不⽤担⼼特异性问题。
理由：
⼀、Primer-BLAST介绍
Primer-BLAST可以直接从Blast主页（/）找到，或是直接⽤下⾯的链接进⼊：/tools/primer-blast/，这个⼯具整合了⽬前流⾏的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进⾏引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了⽤另⼀个站点或⼯具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接⽤Blast进⾏引物特异性验证。更强⼤的是Primer-BLAST能设计出只扩增某⼀特定剪接变异体基因的引物。Primer-BLAST有许多改进的功能，⽐单个的⽤Primer3和NCBI BLAST更加准确。
⼆、Primer-BLAST的输⼊
Primer-BLAST界⾯包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界⾯主要包括4部分：PCR Template（模板区）, Primer Parameters（引物区）, Exon/intron selection（外显⼦内含⼦设置）和specificity check（特异性验证区）。
Primer-BLASTNCBI的引物设计和特异性检验工具
Primer-BLAST：NCBI的引物设计和特异性检验工具
Primer-Blast介绍
Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（PCR）的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST可以直接从Blast主页（）找到，或是直接用下面的链接进入：
这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression（注：没办法准确的翻译，只好作罢，汗！）。Primer-BLAST有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。
Primer-BLAST的输入
Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分：target template（模板区）, the primers（引物区）, 和specificity check（特异性验证区）。跟其它的BLAST一样，点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。
模板（Template）
在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST 就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。
在NCBI上使用BLAST等工具的心得
第一部分 利用Map viewer 查找基因序列、mRNA
序列、
启动子（Promoter ）
下面以大鼠（rattus norvegicus ）的结缔组织生长因子（C T G F ）为例讲述一下具体的操作步骤
1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html 在search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。操作完毕如图所示：
2．点击“GO ”出现如下页面：
3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图： 生
物 秀
说明一下：1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。2、下面参考序列给出了三个，是不同的部门做出来的，经我验证，序列有微小的差异，但总体来说基本相同。尽管你分别点击后，序列代码、序列代码等有所差异，但碱基基本一致，不影响大家研究分析序列。现在普遍采用的是最上面的那个序列，这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的一个序列。我也推荐大家使用这个序列。
4．点击上述三条序列第一条序列（即reference）对应的"Genes seq"，出现新的页面，页面下方为：
5．点击上图出现的“Download/View Sequence/Evidence ”，即下载查看序列等功能，结果如图所示：
先对上面这张图做点简要的说明，在Sequence Format（序列输出格式）后面是一个下拉式选择菜单，默认的为FASTA 格式，还有一个是GenBank 格式。我推荐大家选择GenBnak 格式，因为这个格式提供了很多该基因的信息，而FASTA 格式只有基因序列。
使用 NCBI 查找DNA引物设计BLAST序列比对
最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用
BLAST 进行序列比对……，这些问题在 NCBI 上都可以方便的找到答案。现在我就结合我自己使用 NCBI的一些经历（经验）跟大家交流一下 BCBI 的使用。希望大家都能发表自己的使
用心得，让我们共同进步！
我分以下几个部分说一下 NCBI 的使用：
Part one 如何查找基因序列、mRNA、Promoter
Part two 如何查找连续的 mRNA、cDNA、蛋白序列
Part three 运用 STS 查找已经公布的引物序列
Part four 如何运用 BLAST 进行序列比对、检验引物特异性
特别感谢本版版主，将这个帖子置顶！
从发帖到现在，很多战友对该帖给与了积极的关注，在此向给我投票的（以及想给我
投票却暂时不能投票的）各位战友表示真诚的感谢，谢谢各位战友！
请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。关于NCBI 其他方面的使用也请水平较高
的战友给予补充
First of all，还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Map viewer 查找基因序列、mRNA 序列、
启动子（Promoter）
下面以人的 IL6（白细胞介素 6）为例讲述一下具体的操作步骤
1．打开Map viewer 页面，网址为：/mapview/index.html 在 search 的下拉菜单里选择物种，for 后面填写你的目的基因。操作完毕如图所示：
2．点击“GO”出现如下页面：
3．在步骤二图示的右下角有一个Quick Filter,下面是让你选择的几个复选框，在Gene 前面的小方框里打勾，然后点击Filter. 出现下图：
如何利用BLAST分析验证引物序列
如何利用BLAST分析验证引物序列
引物设计完成之后，需要用软件进行分析，找到最佳的引物对，采用Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。
先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。
可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links”，再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种的一些c-jun mRNA序列。
文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件分析引物比较好后再采用。通过BLAST 验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。
如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：
1. 打开Blast，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”
如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性
序列比对，绝大多数战友都会想到BLAST，但BLAST的使用确实又是一个很大的难题，因为他的功能比较强悍，里面涉及到的知识比较多，而且比对结束后输出的结果参数（指标）又很多。如果把BLAST的使用详细的都讲出来，我想我发帖发到明天也发不完，更何况我自己也不是完全懂得BLAST的使用。所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列为例来给大家介绍一下BLAST的使用，也算是BLAST的入门课程吧。请看帖的战友好好体会，如果你用心看，在看帖完毕之后BLAST的基本使用（包括其他序列的比对）应该没有问题了。一、打开BLAST页面，http://www.ncbi.nlm.nih.go/BLAST/ 打开后如图所示：
（缩略图，点击图片链接看原图）对上面这个页面进行一下必要的介绍：
BLAST的这个页面主体部分（左面）包括了三部分：BLAST Assembled Genomes、Basic BLAST、Specialized BLAST。相信大家可以看懂这三个短语的意思，我就不多说了；我要说的是，可以认为这是三种序列比对的方法，或者说是BLAST的三条途径。
第一部分BLAST Assembled Genomes就是让你选择你要比对的物种，点击相应物种之后即可进入比对页面。
第二部分Basic BLAST包含了5个常用的BLAST，每一个都附有简短的介绍。
第三部分Specialized BLAST是一些特殊目的的BLAST，如IgBLAST、SNP等等，这个时候你就需要在Specialized BLAST部分做出适当的选择了。
图解blast验证引物教程2
图中①代表这些序列与引物匹配的得分值小于40分
图中②代表这些序列与引物匹配的得分值位于40～50分
图中③代表这些序列与引物匹配的得分值位于80～120分，
分值越高，特异性越好。线段代表上或下游引物，其颜色和上面对照后就可得出该条引物的分值。
图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配（Strand=Plus/Plus）、并与下游引物互补（Strand=Plus/Minus），理论上可以扩增出基因片断。没有连线的，表示单条引物与该基因一致。
点击线段，就能跳转到该基因的结果信息概要。
（2）结果信息概要：
Accession、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息Desscription、系列的简单描述
Total score高的就是有两线段间有连线的，如图划线的。
E value：代表被比对的两个序列不相关的可能性。【The E value decreases exponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequences increases】。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：
U代表：Unigene数据库
E代表：GEO profiles数据库
G代表：Gene数据库
（3）结果详细信息：
划线上代表上游引物与该序列的正链【Plus/Plus】的匹配情况：
划线下代表下游引物与该序列的负链【Plus/Minus】的匹配情况：
引物序列验证
引物序列验证
引物设计完成之后，需要用软件进行分析，找到最佳的引物对，采用Blast分析验证引物，可以知道序列的正确性，也能知道引物的特异性状况、引物的具体位置以及PCR产物的大小。
先找到需要设计引物的目标基因的在有引物序列的mRNA序列，可以通过全文（如最先发现该基因的文章），全文中有时可以找到大鼠c-jun mRNA序列的ACCESSION NUMBER，在PubMed中的“Nucleotide”中用此ACCESSION NUMBER就能找到序列。可以利用这个ACCESSION NUMBER在PubMed中的“Nucleotide”中搜索到序列后，点击右边的“Links”，再点击里面的“Related Sequences”就能找到所有的大鼠c-jun mRNA序列及其他物种的一些c-jun mRNA序列。
文献中的引物最好先验证其序列正确，并用软件分析引物比较好后再采用。通过BLAST 验证，既可知道序列是否正确，也可同时了解引物的特异性、引物的位置及PCR产物的大小等。
如果仅仅是为了验证引物序列是否正确（仅适合于基于完全匹配原则设计的引物），也可以用Blast的“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”搜索，具体方法为：
1. 打开Blast，点击“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn)”或“Search for short, nearly exact matches”
DNA序列比对同源性分析图解BLAST
1、进入网页：/BLAST/
2、点击Search for short, nearly exact matches
3、在search栏中输入引物系列：
注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;
5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’
（1）输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。
这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。
（2）简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。
A、输入上游引物空格输入下游引物
B、输入上游引物回车输入下游引物
4、在options for advanced blasting中：
select from 栏通过菜单选择Homo sapiens
Expect后面的数字改为10
5、在format中：
select from 栏通过菜单选择Homo sapiens Expect后面的数字填上0 10
6、点击网页中最下面的“BLAST！”
7、出现新的网页，点击Format！
8、等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。（1）图形格式：
图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分
图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补
图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配
PrimerBLAST操作说明
引物特异性分析
引物特异性分析
PrimerBLAST会通过比对引物序列和基因序列，评估引 物的特异性。如果引物在基因序列上有多个匹配位点， 则可能导致非特异性扩增。用户可以通过查看比对结果 ，了解引物的特异性情况。
引物特异性验证
为了进一步验证引物的特异性，PrimerBLAST提供了基 于PCR实验的引物特异性验证功能。用户可以将筛选得 到的引物送至指定的实验室进行实验验证，以确认引物 的特异性。
PrimerBLAST操作 说明
目录
CONTENTS
• PrimerBblast简介 • PrimerBLAST操作流程 • PrimerBLAST参数设置 • PrimerBLAST结果解读 • PrimerBLAST常见问题与解决方案
01 PrimerBblast简介
什么是PrimerBLAST
总结词
控制模板质量和浓度
详细描述
模板质量和浓度的控制同样重要。高质量的模板可以减少 非特异性扩增的可能性，而适当的模板浓度可以提高扩增 效率。根据PCR反应体系和仪器规格，选择合适的模板质 量和浓度并进行优化。
如何处理引物二聚体问题？
总结词
避免引物自身互补
详细描述
如前所述，引物自身互补会导致引物二聚体 。在设计引物时，应尽量避免引物自身互补 ，并使用软件工具进行引物二聚体的预测和