免疫组化操作步骤
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作流程
1.60℃烤片1-2h，二甲苯脱蜡三次，各10min。
2.依次侵入100%、95%、75%和纯水中，各3min。
3.PBS缓冲液清洗3次，每次3min。
4.柠檬酸钠修复液高压修复2min。
5.自来水下冷却10min。
6.侵入过氧化物酶阻断剂中10min。
7.PBS缓冲液清洗3次，每次3min。
8.滴加适量的抗体于组织玻片上，放入水湿盒中，4℃过夜。
9.PBS缓冲液清洗3次，每次3min。
10.滴加放大剂A试剂，放入水湿盒，室温孵育15min。
11.PBS缓冲液清洗3次，每次3min。
12.滴加多聚酶结合物B，放入水湿盒，室温孵育15min。
13.PBS缓冲液清洗3次，每次3min。
14.DAB显色液显色，待到组织颜色变成黄褐色时，侵入自来水中终止反应。
15.苏木素染色，自来水返蓝。
16.依次侵入75%、95%、100%和二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3中各1min。
17.从二甲苯中取出玻片，擦干，滴加中性树胶，加盖玻片封片。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。
免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。
下面是免疫组化的操作流程。
1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。
样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。
对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。
2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。
为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。
常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。
3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。
抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。
这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。
4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。
一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。
待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。
5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。
洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。
6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。
二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。
这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。
7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。
8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。
最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。
其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。
9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。
可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。
总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。
免疫组化操作步骤(自编)
免疫组化操作步骤一免疫组化( LP 法)操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2。
缓冲液洗 3min/2 次。
3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟.4。
缓冲液洗 5min/2 次。
5。
滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。
(注：孵育不要超过 10 分钟,否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有 5 － 10％正常羊血清，这一步可以省略。
）6。
缓冲液洗 5min/2 次.7。
滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次。
9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer（增强子），在室温下孵育 20 分钟.10 ．缓冲液洗 5min/2 次。
11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗） ,在室温下孵育 30 分钟.（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12 ．缓冲液洗 5min/2 次。
13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ），混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟.（具体时间由染色深浅决定。
）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水，透明，封片。
二．免疫组化（三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（ 2 ）、 3％H 2 O 2 室温孵育 5—10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（ 4 )、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟,倾去血清，勿洗。
免疫组化的操作流程
免疫组化的操作流程免疫组化是一种常用的分子生物学技术，用于检测细胞和组织中特定分子的存在和表达水平。
它可以帮助科学家深入了解细胞和组织的功能和病理改变，是研究和诊断疾病的重要工具之一、以下是免疫组化的操作流程简介：1.样本制备：根据实验目的，选择合适的样本，可以是细胞培养物、冻存组织切片或石蜡包埋的组织切片。
对于细胞培养物，通常直接进行固定处理，而对于组织切片，则需要进行脱水、清洁等预处理。
2.细胞固定：将细胞或组织切片进行固定处理。
常用的固定剂包括甲醛、醋酸乙酯和乙醇等。
固定过程中需要注意不同抗原固定条件的优化，以保持抗原的完整性和免疫反应的灵敏性。
3.抗原恢复：某些抗原在固定过程中可能会丧失其免疫原性，需要进行抗原恢复处理。
常用的恢复方法包括加热诱导抗原修复（如煮沸、蒸汽加热或微波辅助加热）和酶解法等。
4.阻断非特异性结合：在进行免疫组化反应之前需要对样本进行非特异性结合的阻断处理，以减少背景信号。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶和奶粉等。
5.标记抗体：选择合适的一种一抗和二抗，一抗通常是用于识别目标抗原的物质，可以是单克隆抗体或多克隆抗体；二抗是特异性地识别一抗，并携带标记物，如荧光素或酶。
6.免疫反应：将样本与一抗和二抗进行免疫反应。
通常，一抗在特定的条件下与目标抗原结合，然后二抗与一抗结合。
标记物将被聚集在含有目标抗原的区域，形成可视化的免疫复合物。
7.信号增强：为了增强免疫反应的信号，可以使用信号增强剂，如生物素-亲和素体系和酶联免疫吸附法（ELISA）等。
这些方法可以增加检测的灵敏性和特异性。
8.示性显示：为了观察并记录实验结果，可以使用荧光显微镜、电子显微镜或者染色反应等方法来可视化免疫反应。
9.数据分析和解释：根据实验结果进行数据分析和解释。
通过比较免疫反应的强度和位置，可以确定目标抗原的存在和表达水平。
总结起来，免疫组化的操作流程包括样本制备、固定处理、抗原恢复、非特异性结合阻断、标记抗体、免疫反应、信号增强、示性显示以及数据分析和解释等步骤。
免疫组化步骤总结
免疫组化步骤总结免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定分子在组织和细胞中的表达情况。
本文将对免疫组化的步骤进行总结，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
免疫组化步骤主要包括样本制备、抗原修复、阻断非特异性结合、一抗孵育、二抗孵育、信号放大、显色与染色、显微镜观察和结果分析等环节。
下面将对这些步骤进行详细介绍。
1. 样本制备：首先，需要选择合适的组织样本或细胞，可以通过切片、细胞培养等方法获得。
然后，将样本固定在载玻片上，常用的固定剂有福尔马林和乙醛等。
固定后，需要进行脱水和透明化处理，使样本适合于免疫组化的进一步步骤。
2. 抗原修复：有些抗原在固定和加工过程中可能会丧失免疫反应性，需要进行抗原修复。
常用的方法有热处理、酶解等，目的是使抗原恢复其免疫原性，提高抗体的特异性和敏感性。
3. 阻断非特异性结合：在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、牛血清、小鼠血清等，进行预处理，将其涂覆在样本上，阻断不特异性结合位点。
4. 一抗孵育：将特异性抗体（一抗）与样本接触，孵育一定的时间，使抗体与靶分子发生特异性结合。
一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体选择要根据实验需求和抗体的特异性来确定。
5. 二抗孵育：一抗与抗原结合后，需要加入与一抗来源物种不同的二抗。
二抗是与一抗来源物种的免疫球蛋白发生反应的抗体。
二抗可以标记有荧光物质、酶物质等，以便于后续的信号放大和显色。
二抗的选择要根据一抗的来源物种和实验需要来确定。
6. 信号放大：为了增强免疫反应的信号，可以使用一些信号放大的技术。
常用的信号放大方法有生物素-链霉亲和素系统(Biotin-Streptavidin System)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。
这些方法可以使目标物质的信号增强，提高实验的灵敏度和准确性。
7. 显色与染色：信号放大后，需要进行显色与染色步骤。
这一步骤可以根据实验需要选择适当的染色剂，如荧光染料、酶标记物等。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
简化的免疫组化步骤
免疫组化
注意：全程不能干片。
1. 石蜡切片，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水。
2. 3% H2O2去离子水室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性（有人也不消除，刚开始做，建议使用）。
PBS冲洗，5min×3 次。
根据需要选择抗原修复方式及强度。
热修复、酶修复或不修复。
3. 热修复抗原：将切片浸入到EDTA 修复液中，微波炉加热到沸腾后断电（不可持续沸腾），间隔10-15min 再修复1-2 次，冷却至室温。
4. 用PBS过度，擦干周围PBS，滴加5% BSA 封闭液37℃孵育30min，甩干，勿洗。
5. 滴加适当稀释的一抗（稀释参考说明书），37℃孵育2 小时或4℃过夜（过夜效果会更好一些）。
PBS 冲洗，5min×3 次。
6. 擦干周围PBS，滴加生物素标记山羊抗大鼠IgG（二抗），37℃孵育30min。
PBS 冲洗，5min×3 次。
7. 滴加SABC，37℃孵育30min。
PBS 冲洗，5min×3 次。
8. 显色：光镜下控制反应时间。
显色剂可选DAB。
自来水背面充分冲洗。
9. 苏木素复染，染色时间为0.5-2min。
梯度酒精脱水，二甲苯透明。
10. 选用中性树胶封片。
免疫组化步骤
免疫组化步骤1、烤片：放于60℃烘箱内，20—25min;2、脱蜡：二甲苯I、II、III，3次，5min/次；注：从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中，防止蜡凝；3、复水：100%酒精-——100％酒精——-95%酒精--—90%酒精—-—80％酒精--—70％酒精-——50%酒精，5min/次；4、ddH2O洗2次,5min/次；5、抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新MVS—0100），125℃，5min；注:1x修复液:198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x，混匀；抗原修复高压锅的使用：确定垫圈和导热片的放入，加入700ml ddH2O，放入铁架固定切片盒，注意不要压到导热片，盖上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转，锅盖上的“close"对准白点,“open”所指处与边缘无缝隙,设置程序，开始；结束后等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖；6、修复结束后冷却至室温（30min），1xPBS洗2次,5min/次；7、去除H202酶：3％H202,15min；注意遮光；注：用1xPBS稀释30% H202至3% H202（如5ml 30% H202+45ml02)50ml 3%H8、PBS 2次，PBST 1次，5min/次;9、封闭(blocking)：先将片子擦干，注意保持组织部分的湿润，再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈，然后加入封闭液，室温1h，湿盒;封闭液不要过多,以免溢出；注：封闭液：1xPBS，0.3％Triton X-100，10% goat serum(如:870ulPBS+30ul 10% Triton X—100+100ulserum 1ml封闭液）;10、孵一抗:用封闭液稀释一抗，不同的抗体稀释的倍数不同，4℃，过夜（有的抗体是室温1h)，湿盒。
对照组加不含抗体的封闭液；注：拿到4℃冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈外；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；常用抗体的稀释比例：GFAP-—1：200，Ki67-—1：200，CD31-—1：20～1：40,Flag——1:200,Nestin——1：200,III-Tubulin——1：100011、室温,30min；(从冰箱拿出时动作也要缓慢）12、PBST洗3次，5min/次；注：PBST：1L 1xPBS+10ml 10％Triton X-1000 ；13、①加荧光标记的二抗(封闭液稀释抗体1:1000），1h,室温，湿盒;②加HRP标记的二抗(封闭液稀释抗体1：10000），室温30min；注：加二抗前可以重新画圈，以防二抗外流；14、PBST洗3次，5min/次；15、若①复染:DAPI染色,避光，5min;若②TSA放大3～10min，PBST洗3次，5min/次，再复染DAPI；注:DAPI:50uM DAPI用1xPBS稀释1000倍16、封片:直接向组织滴加抗荧光淬灭剂,注意不要产生气泡，盖盖玻片时也要注意不要产生气泡，避光4～5min后即可拍片。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或者组织中特定的分子，如蛋白质、核酸和糖等。
下面是免疫组化的详细步骤：1.样本准备：a.细胞或组织准备：首先需要获取细胞或组织样本，可以通过培养细胞或直接取得组织切片。
b.保存和处理：细胞或组织样本需要保存在合适的液体中，如福尔马林或液氮，以保证样本的完整性和保存时间。
c.切片：对于组织样本，需要将其切割成薄片，常用的方法是冰冻切片或石蜡包埋切片。
2.抗原的暴露：a.反应原位：对于固定的细胞或组织样本，可以直接进行免疫组化实验。
b.透化处理：对于未固定的细胞或组织样本，需要进行透化处理，以使抗体能够穿透细胞膜或组织间隙。
3.抗原检测步骤：a.抗原恢复：有时，抗原可能会受到固定或透化处理的损伤，需要进行抗原恢复步骤。
常见的方法有热处理、酶消化和抗体消除等。
b.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要对样本进行阻断处理，可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼胶。
4.抗体标记检测：a.一抗：选择特异对应抗原的一抗（原抗体），将其加入到样本中，与样本中的特定抗原结合。
b.二抗：将含有特异对一抗的二抗（辅助抗体）标记的溶液加入到样本中，与一抗结合。
二抗通常会与荧光染料、酶或金颗粒等标记结合。
5.洗涤：a.用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
6.反应可视化：a.荧光标记：对于荧光染料标记的样本，可以通过荧光显微镜观察到标记物的信号。
b.酶标记：对于酶标记的样本，需要使用合适的基质使酶产生染色反应，并通过显微镜观察到染色的结果。
7.整理和分析：a.包装：用透明性的封片将样本封装，以便保存并观察。
b.分析：使用显微镜分析样本的结果，例如观察染色的细胞或组织的形态、信号定位等。
免疫组化步骤
免疫组化步骤
1，拷片：在烘干器拷片25-30分钟，温度设置为50摄氏度。
2，脱蜡：二甲苯Ⅰ液10min，二甲苯Ⅱ液10min。
3，复水：100％乙醇Ⅰ液5min，100％乙醇Ⅱ液10min，90％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min
4，PBS清洗3次，每次5min。
5，抗原修复：将枸橼酸放入沸腾的高压锅里预热2min，枸橼酸液沸腾后将切片浸入，盖锅盖，在高压锅内加热至沸腾（98℃-100℃），5分钟，取出冷却至室温；6，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；
7，在湿盒内滴加3％内源H2O2酶，室温10min；
8，PBS洗涤3次，每次5min
9，封闭，湿盒内滴加5％BSA，室温下15-20min，甩去多余液体；
10，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；（如在4摄氏度内过夜需要提前在37摄氏度水浴箱内复温30min。
）
11，PBS洗涤3次，每次5min；
12，滴加二抗，湿盒放于37℃水浴锅内，1h；
13，PBS洗涤3次，每次5min；
14，滴加DAB显色，37℃，10min；
15，PBS洗涤3次，每次5min；
16，苏木素复染2min，自来水冲洗；（如苏木素颜色过深，进行分化）
17，脱水：70％乙醇5min，80％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇Ⅰ5min，100％乙醇Ⅱ。
18，透明二甲苯Ⅰ10min；二甲苯Ⅱ10min。
19，树胶封片，镜检。
免疫组化操作程序
免疫组化化学步法操作程序操作方法一、脱蜡1.将组织切片至于玻片加上，65°C烘箱烘烤30min，是石蜡完全熔融。
2.将烘烤充分的切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第三缸二甲苯中，浸泡10min。
3.从二甲苯中取出切片，尽量沥干二甲苯，置入无水乙醇中，浸泡3min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3min；取出切片，再依次置入90%、80%、70%酒精中梯度水化，各浸泡3min。
二、抗原修复（以EDTA为例）1.用流水冲洗切片1-2min，洗净切片表面的酒精；取出切片，用蒸馏水润洗切片表面2-3次，每次3-5min。
2.将切片置入已经在电饭煲（沸水浴）中预热充分的EDTA中，持续水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min。
3.取出修复盒，使其自然冷却至室温。
三、封闭1.取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的EDTA3次，每次3min。
2.用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。
3.将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。
4.将切片置于湿盒上，滴加5%的BSA，37°C培养箱孵育30-40min（或4°C冰箱孵育过夜）。
四、一抗孵育1.取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的BSA 3次，每次3min。
2.用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。
（步骤1. 2 可不做，可直接擦拭干净BSA滴加稀释好的一抗）3.按照一定的稀释比例，用抗体稀释液稀释抗体。
4.将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。
5.将切片置于湿盒上，滴加一抗50μl，37°C培养箱孵育60min（或4°C冰箱孵育过夜）。
免疫组化操作规程
免疫组化操作规程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定蛋白质、抗原或标记物在细胞或组织中的表达和分布情况。
它被广泛应用于病理学、生物学和医学研究中。
以下是一份免疫组化操作规程的示例，供参考。
一、实验前准备1.准备所需材料：组织切片、抗体、缓冲液等。
2.检查试剂和设备是否正常，确保实验所需材料的质量和有效性。
3.清洗工作台和实验器具，确保无细菌和异物。
4.根据实验需要，制定实验计划和操作流程，合理安排实验时间。
二、标本处理1.取出组织切片，将其置于洗涤缓冲液中浸泡，去除可能存在的阻碍抗体结合的物质。
2.如果组织切片需要去除蜡质包埋，可在60°C恒温水浴中使其溶解。
3.将样本置于蛋白酶解液中，进行抗原修复，以使抗原暴露。
三、抗体操作1.根据实验目的和样本特性选择合适的一抗和二抗。
2.确定一抗和二抗的工作浓度，一般根据厂家推荐进行稀释。
3. 将抗体加入到含有牛血清白蛋白和Triton X-100的缓冲液中，制成一抗溶液。
4.将一抗溶液加入组织切片上，使其充分覆盖，孵育时间根据抗体性质而定。
5.用洗涤缓冲液进行洗涤，去除未结合的抗体。
6.加入二抗，孵育一段时间以进行特异性结合。
7.再次用洗涤缓冲液进行洗涤。
四、染色和显微镜观察1.加入显色底物，使目标分子显示出颜色或荧光。
2.使用显微镜观察样本，以获得目标蛋白质的表达和分布信息。
3.根据需要进行图像获取和数据分析。
五、清洗和保存1.清洗实验用具和工作台，防止污染和交叉污染。
2.保存样本和显微镜图像的数据，方便后续分析和检索。
3.处理和处置废弃物，遵循相关安全和环保规定。
注意事项：1.实验操作时应穿戴实验服和手套，采取必要的安全措施，尽量避免直接接触有害试剂。
2.操作过程中严格按照冷链保存抗体，并避免其受到高温和臭氧等破坏因素。
3.各操作步骤中的温度、时间等参数应根据具体实验需要进行优化调整。
4.实验结果的解释需要结合正常组织和阴性对照进行比较和分析。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理一、前言免疫组化是一种常用的实验技术，它可以用来检测组织或细胞中的蛋白质表达及其分布情况。
本文将详细介绍免疫组化的步骤及原理。
二、免疫组化的步骤1. 取材首先需要取得需要检测的样本，可以是活体组织或固定后的切片。
对于固定后的切片，需要进行脱水、透明化和包埋等处理。
2. 制备切片将取得的样本制备成厚度为4-6μm的切片，并将其放置在载玻片上。
然后进行脱蜡和再水化处理，以便后续步骤的顺利进行。
3. 抗原修复抗原修复是为了恢复经过固定和包埋处理后被破坏或掩盖了的抗原性位点，使其能够被抗体识别。
抗原修复方法有多种，如高温加压法、微波辅助法等。
4. 阻断非特异性结合位点在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点以减少假阳性结果。
常用的方法是使用牛血清白蛋白、小鼠IgG等。
5. 抗体孵育将特异性的一抗加入载玻片上，在恰当的条件下孵育一段时间，使其与靶分子结合。
然后用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
6. 二抗孵育加入与第一抗体来源物种不同的二抗，使其结合到第一抗体上。
通常二抗会标记有荧光素、辣根过氧化物酶等标记物，以便于检测。
7. 洗涤在每个孵育步骤之后都需要进行洗涤，以去除未结合的分子和杂质。
洗涤缓冲液可以是PBS、TBST等。
8. 显色对于标记有辣根过氧化物酶等标记物的二抗，需要使用底物进行显色。
底物包括DAB、VIP等，在加入底物之前需要在载玻片上加入过氧化氢等催化剂。
9. 盖片封装最后将载玻片盖上盖片，并使用透明胶水进行封装。
这样可以保持样本的湿度和防止样本污染。
三、免疫组化的原理免疫组化的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够被免疫系统识别并引起免疫反应的分子，如蛋白质、多肽等。
抗体是由B细胞分泌的一种具有特异性结合能力的分子，可以识别和结合到相应的抗原上。
在进行免疫组化实验时，首先需要选择一种特异性较高的一抗，使其与靶分子结合。
然后加入来源于不同物种的二抗，使其与第一抗体结合。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测和定位特定抗原在组织样本中的表达的技术。
它是病理学和分子生物学中非常常用的技术之一，广泛应用于疾病的诊断、治疗和研究。
1.取样和制片：首先从活体组织中取得样品，这可以通过标本切片、穿刺活检或手术切取的方式来获取。
然后，将样本固定在福尔马林等适当稳定固定剂中，以保持组织的形态结构和抗原的完整性。
接下来，将固定的组织块进行脱水和包埋，制作成薄片，以便于后续的染色和分析。
2.抗原恢复：对于一些抗原，固定和包埋过程可能会导致其空间和/或结构性改变，并使其与抗体的结合受到抑制。
因此，在进行染色之前，需要通过抗原恢复步骤来恢复抗原的原始状态。
这通常包括对组织样本进行煮沸处理或酶解等热或化学诱导方法，以打开抗体与抗原结合的位点。
3.抗体染色：在免疫组化中，抗体是关键的组分。
通常，会使用特异性的初级抗体与目标抗原结合。
该初级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
这些抗体通常是经过酵素、荧光或放射性标记的，以便于可视化抗原的位置和定位。
4.第二抗体标记：在免疫染色中，为了提高信号的强度，需要使用能够与初级抗体结合的第二抗体。
这个第二抗体通常是与荧光物质、酵素或金颗粒等标记物结合的。
这样，在光学或电子显微镜下可以更容易地观察到抗原的位置。
5.可视化：通过对样本进行可视化，可以观察到抗体与抗原的结合情况。
染色的结果可以是可见的颜色、荧光等。
在可见染色中，通常使用染色剂，如二氧化硅染剂、二氮化钼染剂等。
对于荧光标记的样本，可以使用相应的激光或滤光片来观察荧光信号。
最后，在显微镜下观察和记录染色结果。
6.结果分析：在免疫组化结果分析中，需要对染色的结果进行定性和定量的评估。
这可以包括测定抗原的表达强度、局部化和分布等。
可以使用计算机软件和图像分析算法来辅助结果的定量和分析。
总的来说，免疫组化是一种可以检测和定位特定抗原在组织中表达水平的重要技术。
免疫组化操作流程及注意事项
免疫组化操作流程及注意事项免疫组化是一种常用的生物技术方法，在医学、药物研发、疾病诊断等领域有着广泛的应用。
在进行免疫组化实验时，需要遵循一定的操作流程和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。
一、实验前准备1.检查仪器和试剂：在进行实验前，需要检查使用的仪器和试剂是否正常工作，以避免实验出现错误。
2.样本处理：选择合适的样本来源，并根据实验要求进行样本处理和处理，如组织切片、蛋白抽提等操作。
3.实验区域准备：为了避免实验中的交叉污染，需要保持实验区域的清洁和干净，避免灰尘、细菌等干扰实验结果。
二、抗体处理1.抗体选择：根据实验需要选择合适的抗体，包括一抗和二抗，并进行正确的防止步骤。
2.抗体稀释：需要根据实验所需稀释抗体浓度，以确保实验中的可靠性和准确性。
3.透析：透析是为了去除抗体中的杂质和保持抗体的活性，可以使用多种透析方法，如葡萄糖、盐溶液透析等。
三、标记和显色1.标记：将选择好的一抗和二抗进行标记，例如利用荧光标记、酵素标记等。
2.显色：根据实验需要，将标记好的抗体显色，可以使用多种方法，如荧光染色、染色素染色、酶标记染色等。
四、防止步骤1.防止非特异性结合：在实验过程中需要使用防止多余的非特异性结合，如使用BSA、牛奶等进行防止。
2.防止地基自身活性：在实验中需要使用防止地基自身活性的方法，如将地基胶体蛋白进行处理。
3.防止非特异性染色：在实验中需要使用防止非特异性染色的方法，如对实验组和对照组进行多次染色。
五、实验数据分析1.图像采集：采用高清数码系统进行图像采集。
2.数据分析：使用统计软件进行实验数据的处理，进行可靠性检测、误差范围的确定、结果的图表化呈现等等。
以上就是免疫组化操作流程及注意事项的一些基本介绍，虽然操作流程较为复杂，但是只有遵循操作流程和注意事项，才能够稳定的获得实验结果并进行进一步的研究分析。
免疫组化实验具体步骤及说明
免疫组化实验具体步骤及说明免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织部分或特定分子的表达、定位和定量的技术。
它基于抗原抗体相互作用的原理，通过特异性的抗体与目标分子结合形成复合物，再通过染色反应显示出目标分子的位置和数量。
IHC广泛应用于癌症诊断、疾病研究和药物开发等领域。
以下是免疫组化实验的具体步骤及说明：1.标本制备：首先，取得切片的组织标本，通常是经过固定和包埋的组织。
然后，将组织切片取下玻片，用去离子水处理。
最后，将切片分别置于乙醇溶液中进行脱水，再用苯酚或其他抗氧化剂处理，以保护切片的蛋白质结构。
2.去蜡：将切片置于细胞清洗液中，用搅拌器在室温下搅拌，去除蜡层。
然后，分别使用乙醇降级脱水和再次用去离子水处理，以去除残留的蜡。
3.抗原检出：使用特定的抗体来检测目标分子。
首先，在切片中添加抗原修复溶液，进行退火和抗原修复，以恢复抗原的免疫原性。
然后，用PBS洗涤切片，去除剩余的抗原修复液，并将切片与蛋白质阻断剂孵育，以防止非特异性结合。
最后，将切片与特异性的初级抗体孵育，以形成抗原-抗体复合物。
4.特异性结合检测：添加特异性的二级抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠IgG，与初级抗体特异性结合。
此外，还可以使用荧光标记的二级抗体，以便通过显微镜直接检测目标蛋白质的荧光信号。
完成二级抗体与抗原复合物的结合后，用PBS洗涤切片。
5.信号放大与检测：对于HRP标记的二级抗体，使用辣根过氧化物酶底物，如DAB（二氨基苯类胺）或TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。
这些底物在酶作用下会形成可见的棕色沉积物。
对于荧光标记的二级抗体，在显微镜下直接检测荧光信号。
6.染色和显微镜观察：将切片用PBS洗涤，然后用余晖蓝染色溶液浸泡，以增强显微镜下观察的对比度。
最后，用水轻轻冲洗切片，除去多余的染色剂。
用显微镜观察切片，评估目标蛋白质的表达和定位。
免疫组化步骤
免疫组化步骤
1.石蜡切片60度烤箱2h.
2.迅速置于二甲苯中脱蜡，分别二甲苯I、II各10分钟，然后依次
100%酒精、95%酒精、80%酒精、75%酒精各5分钟。
3.PBS液洗5min×3次
4.抗原修复：将组织切片放入0.01mol的枸橼酸钠缓冲液中在微波
炉中高火加热至沸腾后，换至中火加热10min，拿出静置冷却至室温。
5.将组织切片用PBS溶液洗5min×3次
6.小心擦净周围水分，滴加3﹪的过氧化氢溶液遮盖组织，湿盒中
孵育15min以充分灭活内源性过氧化物酶。
7.将组织切片用PBS液洗5min×3次
8.擦去组织周围水分，滴加正常山羊血清遮盖组织，湿盒中孵育
20min以封闭非特异性抗原。
9.弃去血清，滴加稀释好的一抗工作液，湿盒内4度冰箱过夜，或
者，37度温箱孵育2h.
10.滴加二抗，室温孵育10～20min；PBS冲洗，5min×3次
11.滴加三抗，室温孵育10～20min；PBS冲洗，5min×3次
12.DAB显色5-10分钟，显微镜下观察，自来水冲洗终止。
13.苏木素复染，盐酸酒精分化，显微镜下观察复染结果。
14.梯度酒精脱水（酒精从低向高），二甲苯透明，中性树胶封片。
1)切片，
2)蜡块
3)盖玻片
4)PBS缓冲液
5)枸橼酸盐修复液
6)一抗
7)二抗、三抗修复盒
8)EP管
9)双蒸水。
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免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程
试剂准备
1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L，
KH2PO4 L。
2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。
即抗原修复液
: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST
4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。
操作流程
免疫组织化学染色
SP法：
1. 脱蜡、水化：
脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。
从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；
无水乙醇中浸泡3分钟；
95%乙醇中浸泡3分钟；
70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）；
50%乙醇中浸泡3分钟；
自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡
2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）
高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。
电磁炉1000W 2min。
3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略
4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。
5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的
H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。
目的为阻断内源性过氧化物酶)；
6. PBST洗3次各3分钟(过三缸)
7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。
用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。
8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。
4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
）。
9. PBST洗3次各3分钟；
10. 滴加兔或鼠二抗一滴，先滴辅助剂，再滴二抗，之间用PBST洗三次，每次3min，每次室温各静置15分钟；所用试剂盒为中杉金桥的超敏二步法免疫组化检测试剂。
11. PBST洗3次各3分钟；
12. DAB显色几秒至几分钟，在显微镜下掌握染色程度；DAB为福州迈新试剂，先配现用。
13. PBST或自来水冲洗10分钟；
14. 苏木精复染20秒，自来水分化；
15.自来水冲洗30分钟；
16. 酒精梯度脱水（酒精浓度从低到高，每缸浸泡数秒即可）、透明、封片、镜检。