凝胶渗透柱层析法
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种常用的分
离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）的方法。该方法基于分子的大
小和形状的差异，利用一种孔隙较小的基质（凝胶）将分子按照大小分离，从而达到纯化的目的。凝胶过滤层析是一种非亲和层析法，因为分离是通
过分子与基质之间的排斥效应进行的，而不是通过特定的信号配对。
1.准备样品：将待纯化的生物大分子样品（如蛋白质溶液）处理成适
合进行层析的条件。这通常包括调节样品的pH值、离子强度、缓冲剂等。
2. 准备层析柱：选择合适的凝胶填料，并根据需要选择合适的柱尺寸。凝胶填料可以是聚合物凝胶或硅胶凝胶。聚合物凝胶（如Sephadex、Sepharose等）常用于分离中等分子量的生物大分子，而硅胶凝胶（如Sephacryl等）则适用于分离较大分子量的生物大分子。
3.平衡柱：将层析柱与缓冲液平衡。通常用适当的缓冲液（如甘氨酸
盐缓冲液）进行平衡，以确保柱内填充物的孔隙充满均匀。
4.样品加载：取适量的样品，在不破坏填充物的情况下缓慢地、连续
地将样品滴入柱顶端。加载速度要缓慢，以确保样品充分进入柱内而不是
渗漏到填充物外。
5.洗脱：在缓冲液的作用下，样品溶液逐渐沿柱体下滤。较小的分子
会占据填充物内较小的孔隙，因此会与缓冲液一起快速通过填充物，而较
大的分子则会在填充物中逐渐滞留。洗脱时间的长短取决于目标分子的大小。
6.收集洗脱液：用收集管接收洗脱液，以便将目标分子收集起来。
7.考虑后续处理：根据需要，纯化后的生物大分子可以进一步进行其他处理，如浓缩、冻干或储存等。
层析柱柱效
层析柱柱效
层析柱柱效是一种用于分离和分析混合物的技术，广泛应用于化学、生物、环境等领域。本文将介绍层析柱柱效的原理、应用和发展趋势。
一、层析柱柱效的原理
层析柱柱效是基于层析技术的一种分离方法，它利用不同物质在固定相和流动相之间的相互作用力差异来实现分离。层析柱柱效中，两根柱子分别填充不同的固定相，流动相从两根柱子的顶部进入，经过固定相的作用，不同组分被分离出来，并从两根柱子的底部分别收集。
层析柱柱效的分离原理主要包括吸附、离子交换、分配和凝胶渗透等。吸附层析柱柱效是利用固定相对样品中的目标物质具有吸附作用，实现目标物质的分离。离子交换层析柱柱效则是通过样品中的离子与固定相上的离子交换，实现目标物质的分离。分配层析柱柱效是利用样品中的目标物质在两个不同的相中分配比例不同，实现目标物质的分离。凝胶渗透层析柱柱效是利用固定相的孔隙大小选择性地限制目标物质的渗透，实现目标物质的分离。
层析柱柱效在化学、生物、环境等领域具有广泛的应用。在化学领域，层析柱柱效被广泛用于有机合成中的分离纯化、药物分析、天然产物提取等。在生物领域，层析柱柱效被广泛应用于蛋白质纯化、
酶活性分析、基因组分离等。在环境领域，层析柱柱效被广泛用于水质分析、土壤污染物检测等。
层析柱柱效具有分离效果好、分离速度快、操作简单等优点，因此得到了广泛的应用。同时，层析柱柱效也存在一些挑战和问题，如样品复杂性、固定相选择、柱效和流量控制等方面的优化。因此，不断改进和发展层析柱柱效技术对于提高分离效果和提高分析速度具有重要意义。
三、层析柱柱效的发展趋势
生物制药：凝胶层析法
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分离过程
三种不同分子量物质 的混合样品用某种规 格的凝胶柱进行分离。
样品加入，以水或其 他溶液进行洗脱，即 得洗脱曲线 。
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分离过程
最先流出物质A，A分子量最大，完全不能 进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其流经体积最小，等于外水体 积V0。
18
第二节 凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
突出优点：凝胶不带电荷、吸附力弱、不需再生处 理可反复使用、操作条件温和、对分离成分不变 性和破坏、对高分子物质有很好的分离效果。
第一节 凝胶层析的基本原理
凝胶层析的分离过程是在装有 多孔物质填料的柱中进行的。
柱的总体积为VA，它包括填料 的 骨 架 体 积 VGM ， 填 料 的 孔 体 积Vi(内水体积)以及填料颗粒 之间的体积V0（外水体积）。
交联葡聚糖离子交换剂
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（三）Supperdex系凝胶
由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。
（四）Sephacryl系凝胶
凝胶渗透色谱法的原理
凝胶渗透色谱法的原理
凝胶渗透色谱法（Gel Permeation Chromatography, GPC），也称为分子筛色谱法，是一种基于溶液中分子大小分离的技术。该技术被广泛应用于生化、制药、
食品、环境等领域中，用于分离、纯化、鉴定高分子化合物。
凝胶渗透色谱法的原理是利用一系列具有不同孔径大小的凝胶颗粒（Gel）填
充在柱中，样品在柱内由于凝胶颗粒的孔径大小不同而被分离。样品分子大小与孔径大小相似的凝胶颗粒被卡在凝胶层内部，而分子大小较小的样品则能够进入凝
胶颗粒内部，从而在凝胶层内通过相互作用分离出来。分子大小大的化合物被挡住，难以进入凝胶颗粒，所以在柱头出现较早的峰；分子大小小的化合物可以进入凝胶颗粒内部，所以在柱头出现较晚的峰。
凝胶渗透色谱法通常使用列柱层析法进行，样品在柱内通过输送溶液、柱内平衡等步骤，实现分离纯化。在进行凝胶渗透色谱分析时，需要根据样品分子大小的不同选择合适的凝胶颗粒，以获得最佳的分离效果。同时，在样品分析时还需要注意样品的稳定性、浓度等因素，以避免对分析结果的干扰。
凝胶渗透色谱法具有分离效率高、重复性好、分析速度快等优点，广泛应用于高分子材料的研究与生产领域。
凝胶渗透层析法
离子交换纤维素
分辨率高，分离效果好 纤维素的洗脱条件温和，不影响生物大分 子的构型 样品回收率高
1/2 0 Ve II Ve II1
Ve I 、Ve II 、VeIII：分别表示三部分样品的洗脱体积。若 样品Ⅰ为蓝葡聚糖2000等大分子物质，则Ve I既表示样品 Ⅰ的洗脱体积亦表示外水体积Vo。 以--- 示洗脱曲线：表示上样量小时洗脱曲线，此时溶质 峰峰顶及后缘位置均与上样量较多时不同。
凝胶粒度对分离效果的影响
凝胶的粒度分为三级：40~60目属粗 粒 ； 100~200 目 属 中 粒 ( 细 粒 ) ； 200~400目属细粒(最细粒) 中粒应用较多，因为它能使洗脱曲线的峰区变 得对称和狭窄。粗粒凝胶能使色带散宽，且彼 此重叠。过细的凝胶，因洗脱阻力大，会延长 实验时间。
洗脱流速对分离效果的影响
选择曲线：以Kav对分子量的对数作图得一曲线 每一类型的化合物都有它自己的特殊的选择 曲线。可用以测定未知物的分子量，测定时 以使用曲线的直线部分为宜。
四、影响凝胶层析的因素 凝胶的选择 分离程度主要取决于凝胶颗粒内部孔隙的孔径 和混合物分子量的分布范围这两个因素
生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析
实验3 生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析
3.1 相关基础知识
凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、分子筛层析和凝胶渗透层析，是一种按分子大小分离物质的层析方法，广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且
呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合
物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛
孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的
程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel fi
ltration colu
实验原理
凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离
物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测
定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
sephadexg100柱层析原理
sephadexg100柱层析原理
Sephadex G-100柱层析是一种凝胶过滤柱层析方法，用于分离和纯化生物分子，例如蛋白质、核酸和多肽等。
基于凝胶过滤原理，Sephadex G-100是由纤维素经化学修饰得到的高分子化合物，具有高度多孔的三维网状结构。其孔径大小可根据需要进行调整，常用的G-100型号指的是其平均孔
径大小为100 Å。
在Sephadex G-100柱层析中，样品溶液首先被添加至柱层析
填料中，然后以缓冲液进行洗脱。由于Sephadex G-100的高
度多孔结构，较大分子无法进入凝胶内部而被排除在外，较小分子则能够进入凝胶内部并逐渐渗透到凝胶颗粒深处。因此，分离的结果是根据生物分子的大小而实现的，较大分子在柱顶部洗脱，较小分子则需要更长的时间才能出现在柱底部。
通过Sephadex G-100柱层析，可以实现蛋白质的初步纯化和
分子量测定，以及核酸和多肽的分离纯化。此外，Sephadex
G-100柱层析方法简单、操作方便，并且具有较高的分离效率，因此在生物学和生物化学实验中得到广泛应用。
第七章 凝胶层析
编号
交联 吸液量 膨胀 凝胶 分离限 凝胶
度
速度 孔径
强度
大
小
（ Sephadex G－150 ）
小
大
（ Sephadex G－ 50 ）
大慢 小快
大
大
小
小
小
大
24
葡聚糖凝胶（G类）的规格
25
3.性质 稳定性。
能被强酸、强碱和氧化剂破坏，对稀酸稀碱和盐溶 液稳定，能耐受一定高温。
存在非特异性吸附
含少量羟基：对阳离子轻微吸附 环状结构：对芳香族化合物和杂环化合物出现滞留
4.保存
保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。
湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存 （6个月以内）。
常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。
干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶， 脱水收缩，抽滤，用60~80℃吹干。
丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。
37
（四） Superose系凝胶 是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于
HPLC的高速凝胶过滤介质。 有6%和12%两个规格。
38
五、多孔玻璃微球(Bio-glas)
特点：1、化学稳定性高、强度大。
2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。
3、编号表示其孔径, 越大，分离分子量也越大。
凝胶层析试验报告
摘要
凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。 GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。本实验用凝胶色谱法对食用油中的甘油三酯进行了分离提取。
关键词：凝胶色谱甘油三酯食用油
第一章简介
凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。
一、凝胶的选择
根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
二、柱的直径与长度
根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
实验八凝胶过滤法分离蛋白质
葡聚糖凝胶（Sephadex）
Sephadex不溶于溶剂，亲水性强，能 迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性 的环境中稳定。 Sephadex的分离范围与填料粒经和交联 度密切相关。
Superdex属于葡聚糖
以共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上的 球形凝胶，流速快、反压低。
聚丙稀酰胺凝胶 （Polyacrylamide）
根据实验中遇到的各种问题，总结做好 本实验的经验与教训，完成实验报告。 比较几种蛋白质分离方法的特点
附录：HPLC高压液相色谱
附录：凝胶过滤常用填料
1：葡聚糖凝胶（Polydextran），商品名 称是Sephadex 2： 聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide） 3：琼脂糖凝胶
一．目的要求：
学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与 方法。
二．原理
当不同大小的蛋白质混合 物流经凝胶层析柱时:
比凝胶网孔大的分子 不能进入珠内网状结 构，而被排阻在凝胶 珠之外，随着溶剂在 凝胶珠之间的孔隙向 下移动； 比网孔小的分子能不 同程度地自由出入凝 胶珠的内外。 大分子物质先被 洗脱出来，小分 子物质后被洗脱 出来。
实验操作
3、加样：
取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞 色素C溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各6滴混 合，即为上柱样品。 将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰 好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出 口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面。 打开出口，让样品进入床内，直至样品全部 进Sephadex凝胶柱，关紧出口。 滴加蒸馏水使之成2cm水柱 。
葡聚糖凝胶层析
葡聚糖凝胶层析
一、实验目的
1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；
2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排
阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水
体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的
筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出
柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小
分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这
些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶
层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂
1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤
1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样
装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集
打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
凝胶柱层析操作要点
(一) 基本原理
凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。+ Vi 时出现洗脱峰。
（二）凝胶的类型及性质
1.交联葡聚糖凝胶
交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质；而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。在中性条件下，交联葡聚糖凝胶悬浮液能耐高温，用120℃消毒10分钟而不改变其性质。如要在室温下长期保存，应加入适量防腐剂，如氯仿、叠氮钠等，以免微生物生长。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质ppt课件
气-固层析 气相层析
层析
液相层析
气-液层析 液-固层析
液-液层析
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
层析的分类
二、按操作方式分类
1 柱层析
1
22 纸层析
3 薄层层析
4
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
教学重点：
凝胶层析的原理和实验步骤。
教学难点：
掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。
教学对象：
临床医学五年制本科
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
凝胶柱层析操作要点
凝胶柱层析操作要点
(一) 基本原理
凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。+ Vi 时出现洗脱峰。
(二)凝胶的类型及性质
1.交联葡聚糖凝胶
交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质;而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。
交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。在中性条件下，交联葡
凝胶柱层析
（二）装柱
1.装柱前，可以用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将 凝胶上面过多的溶液倾出（此步不做）。
2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约5cm高度柱 容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连 续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后， 打开柱的出口，调节合适的流速（0.5 mL/min）左右， 使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约 5cm处时停止装柱，关闭出水口。
二、原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、分子排阻层析，是
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离。
内水体积Vi
外水体积Vo
柱床体积Vt
洗脱体积Ve
Vt=Vo+Vi+Vg
Ve=Vo+KdVi
Kd=(Ve-Vo)/Vi
Kd=0
Kd=1
五、注意事项
1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求 的操作压下装柱，流速不宜过快。 3 ）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发， 凝胶变干。要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡， 影响样品的分离效果。
六、思考题 1.在本实验中要注意哪些重要环节？
洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪
凝胶的保存方法
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凝胶渗透柱层析法
南大生科院基础实验中心庄苏新、罗喜牛
4、试剂与配制：
4-1、试剂：
(1)、葡聚糖凝胶
(2)、磷酸氢二钠
(3)、磷酸二氢钠
(4)、血红蛋白
(5)、核黄素
4-2、试剂配制：
(1)、磷酸缓冲液（0.05 mol / L,pH 7.4）的配制：
分别称取磷酸二氢钠克；磷酸氢二钠克于一烧杯中，加蒸馏水毫升，搅拌溶解即可。
(2)、样品溶液的配制：
分别称取血红蛋白20.0毫克;核黄素20.0毫克于一烧杯中，加磷酸缓冲液10.0毫升，
搅拌溶解即可(2.0mg/ml)。
5、操作步骤：
（1）、选择固定层析柱：
观察层析柱底端过滤及其它部件连接是否完好？将选择的层析柱垂直固定到台式铁架上，关闭柱底端出口，并向柱内注入一定量的平衡缓冲液，然后再打开柱底端出口，排除柱低端和连接出口的塑料管道内气泡，气泡排除完毕，再次关闭柱底端出口，并在层析柱内留有适量的平衡缓冲液。
（2）、装柱方法：
将烧杯中处理好的葡聚糖凝胶，用玻棒充分搅拌成悬浮液，随即用玻棒引流缓缓倒入层析柱中，静置约5分钟（或出现明显分层现象），再打开层析柱底端出口，让其柱内液体流出，同时柱内葡聚糖凝胶此时也向柱底端下沉，当柱床体积表面不下沉时，此时的高度即为柱床体积的实际高度，观其柱床体积高度是否与实验要求相一致。如果柱床体积过高或过低，则需要弃去多余或添加适量的葡聚糖凝胶，但是，无论是弃去多余葡聚糖凝胶还是添加适量的葡聚糖凝胶，首先需要关闭层析柱底端出口。然后用玻棒将柱床体积上部（要有足够的磷酸缓冲液，便于搅匀）1/3处充分搅匀，搅匀后用滴管吸去多余的葡聚糖凝胶或继续添加适量的葡聚糖凝胶悬浮液，如此反复多次操作，直至沉积高度达到实验所需的柱床体积高度为止。同时在装柱过程中要防止柱床流干。柱装好后，应无节痕，气泡，斑纹，界面平整等。（3）、平衡方法：
柱装好后，使柱床体稳定5.0—10.0分钟，然后接上恒流泵，打开柱下端的出口，用
2.0倍于床体积的磷酸缓冲液进行充分的平衡。同时也使层析柱床体稳定。平衡完毕，关闭恒流泵，打开柱上端端口，让其柱内平衡缓冲液继续流出至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备加样。
（4）、加样方法：
加样前先启动已调试完毕的色谱工作站（如：电脑、紫外检测仪和恒流泵等装置），使整个装置处于工作状态。然后按实验要求吸取1.0毫升样液沿柱管内壁缓缓加入，加样完毕，打开层析柱底端出口，等样液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备洗涤。（5）、洗涤方法：
a、洗涤柱内壁：取少量磷酸缓冲液（与上样量等体积），沿柱内壁四周缓缓加入柱内，加完毕，打开层析柱底端出口，等洗涤液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口。
重复上述方法洗涤柱内壁2次。为防止冲坏床体表面，最后一次洗涤完毕后，将柱内洗涤溶液加至2-3cm高，连接柱上端端口与已调好流速的恒流泵。
b、洗涤吸附剂表面的杂质：继续用恒流泵以0.8ml/min的流速，自动洗涤至该条件下被洗涤的峰回到基线后10分钟止，停止洗涤。洗涤完毕后，关闭恒流泵，打开柱上端端口，让其柱内洗涤缓冲液继续流出至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备洗脱。（6）、洗脱方法：
为防止冲坏柱床体表面，先将柱内加洗脱溶液至2-3cm高，此时接上已调好流速的恒流泵进行自动洗脱。当电脑屏幕出现的第二个洗脱峰回到基线后，继续洗脱10分钟，停止洗脱（约60—80分钟）。
（7）、保存和打印结果：
层析完毕，将结果保存到老师要求的文件夹中，并给出结论性的结果。
（8）、结束实验：
最后移去层析柱，回收柱内的葡聚糖凝胶，清洗层析柱和梯度混合仪装置，同时用恒流泵输送蒸馏水清洗所有与紫外检测仪相连的管道10分钟。并将所有器皿也清洗干净，结束实验。