核酸探针技术

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核酸探针技术
------ 苗俊杰 庞震
? 定义:能与特定目标核酸序列发生杂交,并 含示踪物的核酸片段(DNA或RNA)。
? 原理:核酸探针技术原理是碱基配对。互补 的两条核酸单链通过退火形成双链,这一过 程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物 的已知序列的核酸片段,它能和与其互补的 核酸序列杂交,形成双链,所以可用于待测 核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病 原体都具有独特的核酸片段,通过分离和标 记这些片段就可制备出探针,用于疾病的诊 断等研究。
玻璃板上DNA探针阵列
? 二、按标记物划分
? 有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放 射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性 同位素是最早使用,也是目前应用最广泛的探针标 记物。常用的同位素有 32P、3H、35S。其中,以 32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高, 可以检测到 Pg级;缺点是易造成放射性污染,同位 素半衰期短、不稳定、成本高等。因此,放射性标 记的探针不能实现商品化。目前,许多实验室都致 力于发展非放射性标记的探针。
? 目前应用较多的非放射性标记物是生物素 (Biotin)和 地高辛(digoxigenin) 。
源自文库高辛结构
核酸探针技术的优越性
? 被放射性或非放射性元素标记的探针以原位杂交、 Southern 印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹杂交等不 同的方法 ,可直接用来探测溶液中、细胞组织内或 固定在膜上的同源核酸序列。由于核酸分子杂交的 高度特异性及检测方法的高度灵敏性 ,使得核酸分 子杂交技术广泛应用于对环境中微生物的检测 ,定 性、定量分析它们的存在、分布、丰度和适应性等 研究目标。 DNA标记直接提供了遗传物质的信息 , 因而被广泛应用。以 mRNA为基础的分子标记能更 灵敏地反映污染条件对生物的作用 ,反映变异水平 高。
核酸探针的应用
? 核酸探针技术是目前分子生物学中应用最 广泛的技术之一,是定性或定量检测特异 RNA或DNA序列的有力工具。核酸探针可用 以检测任何特定病原微生物,并能鉴别密切 相关的毒 (菌)株和寄生虫。目前,各种常见 病毒病的诊断和研究都已应用到核酸探针技 术,这方面的研究报道数以万计且与日俱增。 但该项技术的操作毕竟比常规方法复杂,费 用较高。
杂交信号的检测
? 当探针是放射性标记时,杂交信号的检测通过放射自显影进 行。即利用放射线在X光片上的成影作用来检测杂交信号。 操作时,在暗室内将滤膜与增感屏、X光片依序放置暗盒中, 再将暗盒置-70℃曝光适当时间,取出X光片,进行显影和定 影处理。
? 对于非放射性标记的探针,则需将非放射性标记物与检测系 统偶联,再经检测系统的显色反应来检测杂交信号。以地高 辛的碱性磷酸酶检测反应为例,地高辛(Dig)是一种半抗原, 杂交反应结束后,可加入碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体,使 之在膜上的杂交位点形成酶标抗体Dig复合物,再加入酶底 物如氮蓝四唑盐(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸甲苯胺盐 (BCIP),在酶促作用下,底物开始显蓝紫色。其基本反应程 序类似ELISA,杂交信号的强弱,通过底物显色程度的深浅、 有无来确定。
核酸探针的种类
? 一、按来源及性质划分 :可将核酸探针分为基因组 DNA探针、 cDNA 探针、 RNA探针和人工合成的寡 核苷酸探针等几类。
? 作为诊断试剂,较常使用的是基因组 DNA探针和 cDNA探针。其中,前者应用最为广泛,它的制备 可通过酶切或聚合酶链反应 (PCR)从基因组中获得 特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中,随 着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的 DNA探针。将 RNA进行反转录,所获得的产物即为 cDNA。cDNA探针适用于 RNA病毒的检测。 cDNA 探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中,以便大量制 备。
利用核酸探针进行病毒检测
The End!
? 核酸探针技术具有很高的灵敏度和高度的特 异性,因而该技术在分子生物学领域中已广泛 地使用于 克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、
基因组中特定基因序列的定性、定量检测和 疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物 学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上 的应用也日趋增多。
? 在医学上,目前已用于多种遗传性疾病的基因 诊断(gene diagnosis),恶性肿瘤的基因分析, 传染病病原体的检测等领域中,其成果大大促 进了现代医学的进步和发展。
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