清心开窍方对老年性痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响研究

清心开窍方对老年性痴呆模型大鼠学习记忆能力的影响研究
摘要目的：探讨AJ31—40对大鼠学习记忆能力的影响及清心开窍方的防治作用。

方法：将Aβ1—40注入大鼠双侧海马建立老年性痴呆动物模型，动物实验采用对照观察法。

治疗组与预防组用清心开窍方防治，对照组用双益平治疗，疗程结束后评定疗效，检测脑组织中海马区ChaT、Ache活性。

结果：预防组和治疗组大鼠的学习记忆能力改善显著高于模型组(P<0.05)。

脑内海马区ChaT和AchE活性，模型组ChaT活性显著降低，预防组和治疗组的ChaT活性升高，差异有显著性意义(P<0.05)。

结论：清心开窍方对Aβ1—40所致老年性痴呆大鼠模型具有预防和治疗作用。

关键词老年性痴呆学习记忆能力清心开窍方实验研究
老年性痴呆(简称AD)是老年人的常见病、多发病。

其首要症状是智力、记忆力、感官定向能力、判断力、语言思维能力不可逆的进行性退化，并常伴有性格改变。

该病的发病率随年龄增长而增加，65岁以上的老年人口中约占5％，75岁以上的老年人中则上升为20％。

AD目前已成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四位死亡原因，由于其发病的隐匿性和不可逆性，给家庭和社会带来很大负担与危害。

清心开窍方已运用临床多年，疗效确定。

现将其对AD模型大鼠学习记忆能力和脑组织ChaT和AchE活性的影响总结如下。

1、材料
1.1 动物：SD雄性大鼠80只，清洁级，体重90～115g，购自中国科学院上海实验动物中心。

购后饲养在屏障系统内。

饲养条件：温度控制在20～25℃，湿度40％～70％。

光照12小时明，12小时暗，饲以60钻辐照全价营养颗粒饲料和高压灭菌水，垫料每周更换两次。

1.2 药物与试剂：分述如下。

1.2.1药物：清心开窍方汤剂药物组成：生地、麦冬、白芍、石菖蒲、丹皮、茯神、苦参各6g，陈皮4g，知母5g等，制成含生药浓度为0.91g/ml药液。

用真空塑料袋包装，储存于4℃冷藏室，灌胃剂量为8.7ml/kg。

双益平：50μg/片，上海复旦复华药业有限公司生产，批号为：051001，用前配制，浓度为：3.5μg/ml，灌胃剂量为10ml/kg。

Aβ1—40：500μg/瓶，Sigma公司生产，产品号：A1075，批号为：104K4771。

用前加200μl注射用水溶解，浓度为2.5μg/μl，置于37℃恒温水槽中孵育1周。

1.2.2试剂：乙酰胆碱酯酶(AchE)测试盒、乙酰胆碱转移酶(ChaT)测试盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3主要仪器：水迷宫设备：Morris水迷宫视频分析系统(上海吉量软件科技有限公司生产)，通过电脑同步记录大鼠运动轨迹。

图象处理系统为DigBehv 动物行为分析系统。

训练期间迷宫外参照物保持不变。

722型分光光度计(上海第三分析仪器厂生产)。

5417R离心机(德国EPPENDORF公司生产)。

2、方法
2.1 动物分组及造模：SD雄性大鼠80只，体重90～115g。

动物购来后秤重，随机分为正常对照组、假手术组、模型组、阳性治疗组、预防组和治疗组6组，每组10只。

具体处理如下：①正常对照组：正常饲喂2周后，用生理盐水灌胃3周；②假手术组：正常饲喂2周后，双侧脑内注射灭菌注射用水，再用生理盐水灌胃3周；③模型组：正常饲喂2周后，双侧脑内注射Aβ1—40，再用生理盐水灌胃3周；④阳性治疗组：正常饲喂2周后，双侧脑内注射Aβ1—40，再用双益平(10ml/kg/d)灌胃3周。

⑤预防组：正常饲喂同时用清心凉血开窍方灌胃给药，2周后，双侧脑内注射Aβ1—40，再用清心凉血开窍方灌胃给药3周；⑥治疗组：正常饲喂2周后，双侧脑内注射A131—40，再用清心凉血开窍方灌胃给药3周。

双侧脑内注射法：双侧脑内注射用由第二军医大学生理教研室研制的江湾I 型C脑立体定位仪。

左右海马定位P3.0mm，L2.0mm，H3.0mm。

氯胺酮(0.1～0.2ml/100g)腹腔麻醉，用立体定向仪固定头部，酒精棉球局部消毒，剪开头顶皮肤，暴露头骨，经初步定位后，用骨钻钻开头骨，于前囟后 3.0mm，左右旁开2.0mm进针，深3.0mm缓慢注入2μ Aβ1—40，双侧共4μl，5min内注射完毕，留针5min后缓慢退出(正常对照组不注射，假手术组注射等量的灭菌用注射用水)，缝合头皮，最后肌肉注射青霉素，操作完毕后将其放回笼盒，注意观察麻醉未醒的大鼠，防止其窒息死亡。

2.2观测指标：分述如下。

2.2.1 水迷宫试验：全部给药结束后开始水迷宫测试。

训练时选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，图象处理系统将观察并记录大鼠在水中游泳寻找并爬上平台的路线图、所需时间(即大鼠找到平台所需时间)。

设定最长游动时限为70秒，如果大鼠在70s内未找到平台，需将其引至平台并停留10s，这时所需时间记为70s。

每天训练2次，共6天。

2.2.2AchE、ChaT的测定：按试剂盒要求进行。

2.3 数据统计：实验数据用均数±标准差(x±s)表示，两个样本比较采用t检验，多个样本均数比较采用单因素方差分析，按统计学规定，P<0.05为有统计学意义。

所有统计由SPSS12.0 for windows软件处理。

3、实验结果
3.1 清心开窍方对痴呆大鼠水迷宫训练成绩的影响(x±s)：结果见表1。

从表1可见，与模型组比较：阳性治疗组第5、6天有显著性差异(P<0.05)，表明双益平对痴呆大鼠有治疗作用，可以使其记忆能力改善；预防组第5、6天有显著性差异(P<0.05)，表明清心凉血开窍方有改善学习记忆能力的功效，对痴呆大鼠有防治作用；治疗组第4、5天有显著性差异(P<0.05)，表明清心凉血开窍方有改善学习记忆能力的功效，对痴呆大鼠有防治作用。

与阳性治疗组比较：预防组、治疗组寻找并爬上平台的平均时间明显缩短，第4、6天有显著性差异(P<0.05)，表明清心凉血开窍方和双益平均有改善记忆能力的作用，对痴呆大鼠均有治疗和预防作用，但清心凉血开窍方略优于双益平。

3.2 清心开窍方对痴呆大鼠ChaT、AchE的影响(x±s)：结果见表2。

与模型组比较：阳性治疗组ChaT活性明显升高，有显著差异(P<0.05)，表明双益平有提高ChaT活性的作用，可能能改善大鼠痴呆症状；预防组、治疗组ChaT活性有显著差异(P<0.05)，表明清心开窍方能提高ChaT活性，对痴呆大鼠可能有预防及治疗作用。

与阳性治疗组比较：治疗组有显著差异(P<0.05)，预防组无显著差异，但阳性治疗组的ChaT活性比治疗组高，可能双益平对ChaT活性的影响比清心开窍方明显。

AchE活性各组没有显著差异，但从测定值来看：模型组与正常组和假手术组比较，AchE活性高，说明脑内注射淀粉样蛋白Aβ1—40对大鼠脑内AchE活性有影响；预防组、治疗组、阳性治疗组与正常组和假手术组比较，虽无显著差异，但测定值水平有高低差别，说明双益平和清心开窍方均可以影响痴呆大鼠的AchE活性，预防组和治疗组比阳性治疗组作用明显。

4、讨论
祖国医学将AD归属于呆病、文痴、善忘、郁证、癫证等范畴，认为其病位
在脑，与心肾肝脾关系密切。

其主要病机分为虚实两端。

虚证以肝肾阴亏、心脾气虚及阳虚为主；实证以痰、瘀、火、郁为主。

临床治疗多以补肾填精、活血通窍、益气养血、清热涤痰开窍等为治疗大法。

清心开窍方具有清心凉血、开窍清脑作用，临床运用多年，疗效显著，本次实验研究也证实了其治疗AD的良好作用。

乙酰胆碱(Ach)是进行及维持高级神经系统功能的一种重要介质。

目前认为，中枢胆碱能递质系统与学习记忆关系密切，Ach即为促进学习记忆的递质。

胆碱能系统的代谢酶为胆碱乙酰化酶(CAT)和乙酰胆碱脂酶(AchE)，两者活性变化在一定程度上可以反映胆碱能功能状况。

有研究认为，乙酰胆碱脂酶的量及其活性大小在某种程度上恰好是每次神经冲动刚刚能够应付所释放的AchE的量。

同时，现代研究表明，老年性痴呆临床上主要表现为记忆和认知功能障碍，而活检和尸检均发现痴呆患者脑内ChaT与AchE的活性明显低下，显示了痴呆与胆碱能系统功能紊乱密切相关。

本实验是用Aβ1—40注入大鼠左右两侧海马制成老年痴呆模型，通过术前和术后用中药复方清心开窍方给药，观察其给药前后学习记忆能力及ChaT、AchE活性变化，来阐明中药复方清心开窍方是否对老年痴呆模型大鼠有防治作用。

从实验结果可以看出，Aβ1—40沉积能导致大鼠空间学习记忆能力下降，表现为水迷宫试验中寻找并爬上平台的平均时间延长，而清心开窍方给药后均能缩短寻找并爬上平台的平均时间，对改善大鼠空间学习记忆能力具有一定预防和治疗作用。

实验结果表明，与西药阳性对照组比较，中药复方清心开窍方可改善痴呆大鼠的症状，表现为在水迷宫试验中预防组和治疗组大鼠的学习记忆能力显著高于模型组。

在脑内海马区ChaT和AchE活性测定中，表现为模型组ChaT活性显著降低，而AchE增高；经过造模前后给药，预防组和治疗组的ChaT活性升高，差异有显著意义，而AchE活性降低，与文献报道的一致。

所以清心开窍方对Aβ1—40所致老年痴呆大鼠模型具有一定的预防和治疗作用。