牛乳铁蛋白抗菌肽_Lactoferricin_基因的克隆与表达质粒构建

品研究所， 浙江杭州 ３１００１３； ３．复旦大学上海医学院， 上海 ２０００３２； ４．中国药科大学生命科学与技术学院， 江苏南京 ２１０００９）
摘要 按大肠杆菌偏爱密码子设计了牛乳铁蛋白肽的 ３ 段引物序列， 通过 ＰＣＲ 合成 ＢｅＬ１!２!３， 经双酶切后克隆入 ｐＥＤ 质粒的 ＢａｍＨⅠ 和 ＨｉｎｄⅢ位点之间， 构建出牛乳铁蛋白肽的表达载体， 转化至 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ!２１（ ＤＥ３） ， 获得牛的乳铁蛋白肽基因克隆菌。该克隆菌经诱导后， 可表达出 可观的融合蛋白， 且表达量与诱导时间呈一定相关性。 关键词 乳铁蛋白； 牛乳铁蛋白肽； 基因克隆； 融合表达 中图分类号 Ｑ７８６ 文献标识码 Ａ 文章编号 ０５１７－ ６６１１（ ２００８） １１－ ０４４４２－ ０３
乳 铁 蛋 白（ Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ， ＬＦ） 是 一 种 天 然 的 铁 结 合 蛋 白 ， 存在于人及大多数哺乳动物的乳汁中， 也存在于唾液、泪液、 胰液以及其他的身体分泌物中。乳铁蛋白活性多肽（ Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ， Ｌｆｃｉｎ） 是 ＬＦ 在消化道内经酸性胃蛋白酶水解后的小肽。大量 研 究表 明 ， Ｌｆｃｉｎ 具 有 广 谱 抗 细 菌 、抗 病 毒 、抗 真 菌 活 性 ， 它 们 虽然 没 有 铁 离 子 结 合 位 点 ， 但杀 菌 活 性 却 比 ＬＦ 高［１－２］， 可 用于开发新型的保健食品和绿色食品添加剂。但开发 Ｌｆｃｉｎ 会遇到许多困难， 其中， 遇到的最大问题是制造成本太高， 大量制造较困难， 难以实现商品化。应用基因工程技术将牛 乳 铁 蛋 白 肽（ Ｌｆｃｉｎ Ｂ） 基 因 转 入 其 他 生 物 中 表 达 ， 是 解 决 工 业用 Ｌｆｃｉｎ Ｂ 来源不足的最具潜力的途径， 但国内关于 Ｌｆｃｉｎ Ｂ 基因层次的研究于 ２００２ 年后才起步［３］。因 此 ， 构 建 基 因 工 程菌生产 Ｌｆｃｉｎ Ｂ 具有重要意义。
Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｎｓｔｒ ｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｏｖｉｎｅ Ｌａｃｔｏｆｅｒ ｒ ｉｃｉｎ ＤＥＮＧ Ｑｉａｎｇ ｅｔ ａｌ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００９０） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ ｉｎ ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ， ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＬｆｃｉｎＢ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ＢｅＬ１!２!３ ｗａｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ ＰＣＲ． Ａｆｔｅｒ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ， ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＢａｍＨⅠａｎｄ ＨｉｎｄⅢ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＤ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ!２１ （ＤＥ３）． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ＬｆｃｉｎＢ ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ． Ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ， ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ ａｍｏｕｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｄｅｐｅｎｄｅｄ ｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ； Ｂｏｖｉｎｅ Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ； Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ； Ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
３６ 卷 １１ 期
邓 强等 牛乳铁蛋白抗菌肽（ Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ） 基因的克隆与表达质粒构建
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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１．６ 阳性转化子（ Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＤ!ＬｆｃｉｎＢ） 融合蛋白表达量同乳 糖诱导时间的关系试验 选取自制的 优 化 培 养 基（ 胰 蛋 白 胨 大 豆 肉 汤 ２０ ｇ／Ｌ， 酵 母 粉 ５ ｇ／Ｌ， 氯 化 钠 ６．６７ ｇ／Ｌ） ， 于三角 烧瓶（ ２５０ ｍｌ） 中 装 液 量 ７５ ｍｌ， １８０ ｒ／ｍｉｎ、３７ ℃下 振 荡 培 养 ４ ｈ 后加入终浓度 ５ ｍｍｏｌ／Ｌ 的乳糖诱导 ５ ｈ， 诱导后每小时在 三角瓶中取菌液 １ ｍｌ， 收集及电泳方法同上。 １．７ 阳 性 转 化 子（ Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＤ! ＬｆｃｉｎＢ） 的 生 长 曲 线 ［９－１０］ 取 基因工程菌斜面种子接种２ 组， 每组 ３ 只装有优化培养基的 三角烧 瓶（ ２５０ ｍｌ） ， 装 液 量 ７５ ｍｌ， 在 １８０ ｒ／ｍｉｎ、３７ ℃下 振 荡 培养。其中， 诱导组在培养 ４ ｈ 后加入终浓度 ５ ｍｍｏｌ／Ｌ 的乳 糖， 诱导基因工程菌， 继续振荡培养 １１ ｈ， 自培养开始， 每小 时 在 三 角 瓶 中 取 菌 液 １ ｍｌ， 适 当 稀 释 后 测 定 菌 液 在 波 长 ６００ ｎｍ 处的吸光值。不诱导组不诱导， 其他操作同诱导组， 共培养 １５ ｈ。根据 每 个 时 间点 的 吸 光 值 绘 制 工 程 菌 在诱 导 状态下和非诱导下的生长曲线。 ２ 结果与分析 ２．１ 目标 ＤＮＡ 的 获 得 经 约 ２ ｈ 的 ＰＣＲ 循 环 扩 增 ， 得 到 ＢｅＬ２!３ 片 段 。经 １．７％琼 脂 糖 凝胶 电 泳 验 证 目 的 产 物 之后 ， 再 以 ＢｅＬ２!３ 为 模 板 ， 以 ＢｅＬ１ 和 ＢｅＬ３ 为 引 物 进 行 ＰＣＲ 循 环 扩 增 ， 得 到 目 的 产 物 ＢｅＬ１!２!３。产 物 进 行 １．７％琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 验 证 目 的 产 物 的 分 子 量 。ＰＣＲ 产 物 ＢｅＬ１ !２ !３ 经 ＢａｍＨＩ 和 ＨｉｎｄＩＩＩ 双酶切反应后用小量 ＰＣＲ 产物纯化试剂 盒纯化， 所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳验证， 结果如图 １ 所 示 。图 １ 中 ， １ 为 ５０～５００ ｂｐ Ｍａｒｋｅｒ， ２ 为 双酶 切 纯 化 后 产 物（ 目的基因：８１ ｂｐ） ， ３ 为第 １ 步 ＰＣＲ 产物（ ＢｅＬ ２!３：８３ ｂｐ） ， ４ 为 第 ２ 步 ＰＣＲ 产 物（ ＢｅＬ １!２!３：１１３ ｂｐ） ， 符 合 原 设 计 的 ＢｅＬ１!２!３ 的 分 子 量 。电 泳 结 果 表明， Ｌｆｃｉｎ Ｂ 基因 ＰＣＲ 合成 成功， 得到下一步试验所需的目标 ＤＮＡ 片段。
安徽农业科学， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉ． Ｓｃｉ． ２００８， ３６（ １１） ： ４４４２－ ４４４４， ４４７６
责任编辑 姜 丽 责任校对 况玲玲
牛乳铁蛋白抗菌肽（Ｌａｃｔｏｆｅｒ ｒ ｉｃｉｎ） 基因的克隆与表达质粒构建
邓 强 １， 王春晓 １， 鲁建章 ２， 朱 政 ３， 刘承初 １ ＊， 刘景晶 ４ （ １．上海水产大学食品学院， 上海 ２０００９０； ２．浙江省医学科学院保健食
为此， 笔者以 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ!２１ 为宿主菌， ｐＥＤ 质粒为表达 载体， 天门冬酰胺酶切除信号肽的 Ｃ 末端片段为融合伙伴， 并突变融合伙伴中的!Ａｓｐ!Ｐｒｏ!酸敏感位点； 在融合伙伴和 目的肽结合处引入!Ａｓｐ!Ｐｒｏ!酸敏感位点 ， 在 目 的 肽 Ｎ 端 引 入 额 外 的 Ｐｒｏ， 形 成 二 肽 酶Ⅳ识 别 的 Ｎ 端!Ｐｒｏ!Ｐｒｏ!位点。通 过对融合蛋白酸水解除去融合伙伴， 二肽酶切除 Ｎ 端多余 Ｐｒｏ!Ｐｒｏ 片 段 ， 就 可 以 使 目 的 肽 释 放 出 来 ， 这 为 进 一 步 获 得 大量可供试验研究和临床应用的 Ｌｆｃｉｎ Ｂ 创造条件。 １ 材料与方法 １．１ 材料 表 达 载 体 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＤ 和 宿 主 菌 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ!２１ 由 中国药科大学刘景晶教授馈赠。其中， ｐＥＤ 质粒是在商品化 质粒 ｐＥＴ ２８ ａ 基础上改造的， 是适合于短肽高效表达与加工 的重组质粒。该重组质粒是将消去唯一酸水解位 点 的 Ｌ!天 门冬酰胺酶Ｃ 末端 １２７ 肽基因以及 １ 组多克隆位点引入质 粒 ｐＥＴ ２８ ａ 的 ＮｃｏⅠ和 ＢａｍＨⅠ位 点 之 间 构建 而 成 的［４］； 限 制性内切酶 ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ购自上海晶美生物技术有限 公司； Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ， ＲＮａｓｅ Ａ， 硫酸卡那霉素， Ｐｆｕ ＤＮＡ 聚合
基金项目 作者简介 收稿日期
上海市重点学科建设项目（ Ｔ１１０２） ； 上海水产大学项目（ ０５! ２０７） 。 邓强（ １９８２－ ） ， 男， 山西大同人， 硕士研究生， 研究方向： 食品 营养与卫生方向的研究。＊ 通讯作者， 博士， 教授。 ２００８! ０１!２８
酶， 离心柱型 ＤＮＡ 产物纯化试剂盒购自北京天维生物技术 有限公司； 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。 １．２ 表 达 牛 乳 铁 蛋 白 肽 的 基 因 片 段 的 合 成［４－ ５］ 依 据 Ｌｆｃｉｎ Ｂ 的 氨 基 酸 序 列 ＰＰＦＫＣＲＲＷＱＷＲＭＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲＲＡＦ， 选用 大 肠 杆 菌 偏 爱 的 密 码 子 设 计 ３ 段 寡 核 苷 酸 片 段［４－ ５］， Ｂ ｅＬ １： ５′ＡＡＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＧＡ ＴＡＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＴＧＣ ＣＧＴ ＣＧＴ ＴＧＧ ＣＡＧ ＴＧ ３′（ 引 入 ＢａｍＨＩ 位 点） ， ＢｅＬ ２ ： ５′ＡＡＡ ＴＧＣ ＣＧＴ ＣＧＴ ＴＧＧ ＣＡＧ ＴＧＧ ＣＧＴ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＴＧ ＧＧＴ ＧＣＴ ＣＣＧ ＴＣＣ ＡＴＣ ３′， ＢｅＬ ３： ５′ＧＧ ＣＣＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＧＡＡ ＡＧＣ ＡＣＧ ＡＣＧ ＡＡＣ ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＡＴ ＧＧＡ ＣＧＧ ＡＧＣ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＴＴ３′（ 引 入 ＨａｎｄⅢ 位 点） 。先 将 引物片段 ＢｅＬ ２ 和引物片段 ＢｅＬ ３ 退火连接， 再以得到的互 拼片段 ＢｅＬ ２!３ 为模板， 以引物片段 ＢｅＬ １ 和引物片段 ＢｅＬ ３ 为 引 物 经 ９４ ℃ ５ ｍｉｎ； ９４ ℃ ４５ ｓ， ５８ ℃ ４５ ｓ， ７２ ℃ ４５ ｓ， ３０ 个循环； ７２ ℃ １０ ｍｉｎ ＰＣＲ 扩增目的 ＤＮＡ 片 段 ＢｅＬ１!２!３。经 小量 ＰＣＲ 产物纯化试剂盒纯化后， 用 ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ３７ ℃双酶切 ２ ｈ， 酶切产物再用小量 ＰＣＲ产物纯化试剂盒纯化。 １．３ 表达载体 ｐＥＤ 质粒的提取、酶切与纯化［６－７］ 采用碱抽 提法小量提取 ｐＥＤ 质粒， 之后用 ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ双酶切。 将酶切产物在 ０．８％琼脂糖凝胶上进行电泳分离， 切胶回收 质粒大片段， 由小量胶回收试剂盒回收。 １．４ ｐＥＤ!ＢｅＬ 表达载 体 的 构 建 Ｔ４ＤＮＡ 连 接 酶 连接 目 的 基因与 ｐＥＤ 质粒［６－７］， 转化 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ!２１（ Ｄｅ３） ［８］后硫酸卡那霉 素 ＬＢ 平 板 挑 取 转 化 子 ， 送 样 至 上 海 捷 瑞 生 物 工 程 有 限 公 司， 测定转化子质粒的 Ｔ７ 启动子后核苷酸序列。 １．５ 重组 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＤ!Ｌｆｃｉｎ Ｂ 的 诱 导 表 达 转 化 子 在装 有 ＬＢ 液体培养基的试管中培 养 ６ ｈ 后 ， 加 入 终 浓 度 ５ ｍｍｏｌ／Ｌ 的乳糖， 诱导表达融合蛋白。以不经诱导的转化子及平行培 养的经过诱导的 Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＤ 作为对照。诱导 ４ ｈ后， ８ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 ２ ｍｉｎ， 收集菌体。菌体中加入 ５０ μｌ ＳＤＳ!ＰＡＧＥ 上样缓冲 液， 于沸水中煮 １０ ｍｉｎ 后， ８ ０００ ｒ／ｍｉｎ 再次离心 ４ ｍｉｎ。ＳＤＳ! ＰＡＧＥ 电 泳［６－７］， 确 定 融 合 蛋 白 ＡｎｓＢ!Ｃ!ＬｆｃｉｎＢ 的 表 达 状 况 ， 筛选阳性转化子并作甘油管保存。