6_第六章__基因的转移与重组体的筛选和鉴定
基因的转移与重组体的筛选和鉴定-2
基因的转移与重组体的筛选和鉴定-2二、重组DNA分子转入真核细胞1. 根癌农杆菌Ti质粒介导法农杆菌介导的Ti质粒载体转化法是目前研究最多、机制最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。
迄今为止约8096的转基因植株都是利用农杆菌介导转化系统获得的。
农杆菌是一类土壤习居菌，革兰氏染色呈阴性，能感染双子叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物无侵染能力。
植物受伤后，伤口处细胞分泌大量的酚类化合物，如乙酰丁香酮（AS）和羟基乙酰丁香酮（OH－As），它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。
具有趋化性的农杆菌移向这些细胞，并将其Ti质粒上的T－DNA的转移至细胞内部。
根据这一性质，将待转移的目的基因组入Ti质粒载体，通过农杆菌介导进人植物细胞，与染色体DNA整合，得以稳定维持或表达。
步骤：（1）外植体选择与预培养；（2）接种活化的农杆菌工程菌；（3）共培养；（4）选择培养；（5）转化植株再生2. 高压电穿孔法利用脉冲电场将DNA导入受体细胞的方法叫做高压电穿孔法。
利用这种方法，可以将DNA导入动、植物及细菌细胞。
具有简单方便、对细胞毒性低以及转化效率高等优点。
（1）标准的操作程序——将高浓度的含有克隆基因的质粒DNA加到原生质体的悬浮液中，然后置于200～600V／cm的电场下进行电脉冲刺激。
经过如此电穿孔处理的原生质体在组织培养基中培养1～2星期之后，选择已经捕获了转化DNA的细胞，作进一步的继续培养，以便获得再生植株。
应用这种方法已成功地转化了玉米和水稻的原生质体，其转化效率在0．1％～1．0％之间。
（2）影响电穿孔导入DNA效率的因素：① 外加电场的强度：250～750 V／cm较宜；② 电脉冲的时间：20～100ms；③工作温度：对不同类型细胞所要求的条件不同，可以在0℃至室温（25℃）之间进行选择；④ DNA的构象和浓度：线性 DNA比环状 DNA要好，浓度控制在1～ 40μg／mL。
⑤工作缓冲液的离子成分：也对其DNA导入效率发生作用，一般用盐溶液悬浮细胞要比用非离子溶液更易DNA的导入。
实验17-重组体筛选与鉴定
一 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
四 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研 究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl） 制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
重组体筛选和鉴定PPT课件
标志基因筛选
免疫学筛选
利用载体上的标志基因对重组 体进行筛选，如利用lacZ基因进 行β-半乳糖苷酶活性检测。
利用抗体与目的蛋白的特异性 结合，通过免疫学方法对重组 体进行筛选。
荧光标记筛选
利用荧光标记的目的基因或蛋 白质进行筛选，通过荧光检测 仪检测荧光信号。
重组体在生物工程中的应用
生物制药
利用重组技术生产具有治疗价 值的重组蛋白、抗体或细胞因 子等生物药物。
基因工程菌构建
通过基因重组技术构建具有特 定功能的基因工程菌，用于工 业微生物发酵和物质转化。
农作物改良
通过基因重组技术改良农作物 性状，提高产量、抗逆性和品 质等。
重组体在医学中的应用
诊断试剂开发
剂的安全性。
05
重组体的未来发展
重组体技术的发展趋势
基因编辑技术的进步
随着CRISPR等基因编辑技术的不断完善，重组体的构建将更加高 效和精确。
人工智能与大数据的结合
人工智能和大数据技术的应用将有助于提高重组体筛选和鉴定的准 确性和效率。
细胞工厂的构建
利用重组技术构建细胞工厂，实现微生物生产的高效转化，为生物 制药等领域提供有力支持体的环境安全性评估
评估重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力，以及可能对生态环 境造成的影响。
重组体的食品安全性评估
对重组体作为食品或食品添加剂的安全性进行评估，确保其食用安 全。
重组体的安全性检测方法
02
01
03
生物学检测
通过生物学实验检测重组体的生物学特性、遗传稳定 性等。
环境适应性检测
检测重组体在环境中的存活、繁殖和扩散能力。
第六章基因的重组与转移-文档资料
37℃过夜
5. 影响转化率的因素
(1)分子质量较小的重组质粒DNA分子转化率较高，分子质量 较大的重组质粒DNA分子转化率较低，对于大于15kb的重组 质粒则很难进行转化。
(2)组成重组DNA分子的载体类型及其构型。与受体细胞亲和 性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体，而 处于自然双螺旋闭环结构的质粒载体比开环结构、成线性结 构的质粒载体有更高的转化率。
4℃离心 收集菌
On ice 30 min
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
4℃离心 收集菌
用冰冷的 60mMCaCl2 重悬
分装、-70 ℃ 冻存
二、重组DNA导入大肠杆菌 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （1）转化（transformation)
P-P
Blunt-ended DNA
5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’
BamHI adapter
5‘p-GATCCCGGGGCC-
-CCGG -GGCCCTAG-P5’
CCGG GGCCCTAG-P5’
接头自我连接
5‘p-GATCCCGGGGCC-
CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5’
（3）DNA接头 (adapter)连接法
1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。 ① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。
BamHI adapter 5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’
② adapter的作用
用T4DNA连接酶连到DNA分子的两 端，直接成为人工粘性末端。
复习题 2基因重组与基因工程
复习题 2 基因重组与基因工程一、A型题1.实验室内常用的连接外源性DNA和载体DNA的酶是：（ A ）A．DNA连接酶B．DNA聚合酶ⅠC．DNA聚合酶ⅡD．DNA聚合酶ⅢE．反转录酶2.用来鉴定DNA的技术是：（ B ）A．Northern印迹B．Southern印迹C．Western印迹D．亲和层析E．离子交换层析3.下列那项不是重组DNA技术中常用的工具酶：（ D ）A．限制性核酸内切酶B．DNA连接酶C．DNA聚合酶Ⅰ D．RNA聚合酶E．反转录酶4.关于限制性核酸内切酶的叙述，下列哪项是错误的？（ E ）A．限制性核酸内切酶分为三类，用于基因工程的为Ⅱ酶B．限制性核酸内切酶切割后可产生粘性末端或平端C．识别的核苷酸序列个数可以是6个或8个D. 识别的序列一般具有回文结构E．识别的DN A为单链5.关于基因工程的叙述，下列哪项是错误的？（ B ）A．基因工程也称基因克隆B．只有质粒DNA可作为载体C．重组体DNA转化或转染宿主细胞D．需获得目的基因E．需对重组DN A进行纯化、筛选6.有关质粒的叙述，下列哪项是错误的？（ E ）A．小型环状双链DNA分子B．可小到2～3Kb大到数百个KbC．能在宿主细胞中独立自主地进行复制D．常含有耐药基因E．只有一种限制性核酸内切酶切口7．下列哪项不是重组DN A的连接方式？（C ）A．粘性末端与粘性末端的连接B．平端与平端的连接C. 粘性末端与平端的连接D．人工接头连接E．同聚物加尾连接8．DNA克隆不包括下列哪项步骤？（ E ）A．选择一个适合的载体B．限制性核酸内切酶在特异位点裂解质粒和目的基因C．用连接酶连接载体DNA和目的DNA，形成重组体D．用载体的相应抗生素抗性筛选含重组体的细菌E．重组体用融合法导入细胞9．基因重组是指DNA分子的：（ A ）A．共价连接B．氢键连接C．离子键连接D．交换E．退火10．在分子生物学中，重组DNA又称为：（ D ）A.酶工程B.蛋白质工程C.细胞工程D.基因工程E.DNA工程11．基因工程中，不常用到的酶是（ E ）A．限制性核酸内切酶 B．DNA聚合酶C．DNA连接酶D．逆转录酶E．DNA解酶12．能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶称为：（ B ）A. DNA内切酶 B．限制性内切核酸酶C．非限制性内切核酸酶 D．限制性外切核酸酶E．非限制性外切核酸酶13．cDNA是指：（ A ）A．在体外经反转录合成的与RNA互补的DNAB．在体外经反转录合成的与DNA互补的DNAC．在体外经反转录合成的与RNA互补的RNAD．在体内经反转录合成的与RNA互补的RNAE．在体内经反转录合成的与RNA互补的DNA14．质粒的分子结构是：（ A ）A．环状双链DNA B．环状单链DNA C．环状单链RNAD．线状双链DNA E．线状单链DNA15．聚合酶链式反应常常缩写为：（ E ）A．PRC B．PER C．PDR D．BCR E．PCR16．用于PCR反应的酶是：（ E ）A．DNA连接酶B．碱性磷酸酶C．逆转录酶D．限制性内切核酸E．Taq DNA聚合酶17．基因工程中使目的基因与载体拼接的酶是：（ C ）A．DNA聚合酶B．RNA聚合酶C．DNA连接酶D．RNA连接酶E．限制性核酸内切酶18．α互补筛选属于：（C ）A．抗药性标志筛选B．酶联免疫筛选 C．标志补救筛选D．原位杂交筛选E．免疫化学筛选19．确切地讲，cDNA文库包含：（ E ）A．一个物种的全部基因信息B．一个物种的全部RNA信息C．一个生物体组织或细胞的全部基因信息D．一个生物体组织或细胞的全部RNA信息E．一个生物体组织或细胞所表达mRNA信息20．下烈描述最能确切表达质粒DNA作为克隆载体特性的是：（D ）A．小型环状双链DNA分子B．携带有某些耐药基因C．在细胞分裂时恒定地传递给子代细胞D．具有自我复制能力E．获得目的基因21.基因工程中常用限制性内切酶Ⅱ的识别序列，正确的说法是：（ E ）A.聚胞苷酸B.聚腺苷酸C.6或8个任意核苷酸D.4或6个任意核苷酸E 具有回文结构22．基因工程的基本过程不包含：（ E ）A.DNA重组体的形成及转化B.限制酶的切割C.载体及目的基因的分离D.重组体的筛选与鉴定E.重组体的序列分析23.有关理想质粒载体的特征，正确的是：（ B ）A.其复制受宿主控制B.含有多种限制性内切酶的单一切点C．含有同一限制酶的多个切点D．为线性单链DNAE．不含耐药基因24.下列那个物质一般不用作基因工程的载体：（ C ）A．噬菌体B．质粒C．大肠杆菌基因组D．反转录病毒DNAE．人工酵母染色体25.基因工程的操作程序可简单的概括为：（E ）A．将重组体导入宿主细胞并筛选B．限制酶的应用C．将载体和目的基因接合成重组体D．目的基因和载体的分离提纯与鉴定E．分、切、接、转、筛26.基因表达的多级调控不包括：（ A ）A．DNA复制B．转录起始C．转录后加工D. 翻译起始E. 翻译后加工27.下列基因工程中的目的基因的来源，最不常用的是：（ C ）A. 人工合成DNAB．从mRNA合成cDNAC. 从真核生物染色体DNA中直接分离D．从基因文库中获取E．从细菌基因组DNA中直接分离28.Ⅱ型限制性内切酶是：（ B ）A．有内切酶和甲基化酶活性B.仅有内切酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供C．有外切酶和甲基化酶活性D．限制性识别非甲基化的核苷酸序列E．仅有外切酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供29.基因工程操作应用的许多载体质粒都有抗生素的抗性基因，这是为了便于：（ D ） A．外源基因插入质粒B.宿主菌的生物繁殖C．质粒的转化D．带有目的基因的宿主菌的筛选E．目的基因的表达30.有关目的基因与载体连接的叙述错误的是：（ E ）A.可以同一限制酶切割产生粘性末端连接B.平末端切口可采用“尾接法”C．平末端切口可直接连接D．均需DNA连接酶参与E．不同限制型内切酶切割不能连接1．基因工程的单元操作顺序是（ A ）Ａ．酶切，连接，转化，筛选，验证Ｂ．酶切，转化，连接，筛选，验证Ｃ．连接，转化，筛选，验证，酶切Ｄ．验证，酶切，连接，筛选，转化Ｅ．酶切，连接，筛选，转化，验证2．下列五个DNA 片段中含有回文结构的是（D、E ）Ａ．GAAACTGCTTTGAC Ｂ．GAAACTGGAAACTGＣ．GAAACTGGTCAAAG Ｄ．GAAACTGCAGTTTCＥ．GAAACTGCAGAAAG3．T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是（ D ）Ａ．2' -OH 和5' -P Ｂ．2' -OH 和3' -PＣ．3' -OH 和2' -P Ｄ．3' -OH 和5' -PＥ．5' -OH 和3' -P4．噬菌体l-DNA 体外包装的上下限是天然l-DNA 长度的（D ）Ａ．25 - 50 % Ｂ．50 - 100 %Ｃ．75 - 100 % Ｄ．75 - 105 %Ｅ．100 - 125 %8．分子杂交的化学原理是形成（E ）Ａ．共价键Ｂ．离子键Ｃ．疏水键Ｄ．配位键Ｅ．氢键9．促红细胞生长素（EPO ）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为（ E ）Ａ．人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用Ｂ．人的促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定Ｃ．大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活Ｄ．人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感Ｅ．大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化10．鸟枪法克隆目的基因的战略适用于（ A ）Ａ．原核细菌Ｂ．酵母菌Ｃ．丝状真菌Ｄ．植物Ｅ．人类11．cDNA第一链合成所需的引物是（D ）Ａ．Poly A Ｂ．Poly CＣ．Poly G Ｄ．Poly T Ｅ．发夹结构12．cDNA法获得目的基因的优点是（ B ）Ａ．成功率高Ｂ．不含内含子Ｃ．操作简便Ｄ．表达产物可以分泌Ｅ．能纠正密码子的偏爱性13．人工合成DNA 的单元操作包括（ E ）I 去保护II 偶联III 封端IV 氧化Ａ．I + II Ｂ．II + IVＣ．I + II + III Ｄ．II + III + IV Ｅ．I + II + III + IV二、B型题A．抗药性筛选B．分子杂交筛选C．RNA反转录D．免疫学方法 E．体外翻译1．用于鉴定质粒是否转化的一般方法是：（ A ）2．用于鉴定转化子细胞是否含有目的基因的常用方法是：（ B ）3．利用目的基因表达产物的特异性抗体来筛选含有目的基因的转化子细胞价方法是：（D ）A．限制性核酸内切酶B．DNA连接酶 C．反转录酶D. Taq DNA聚合酶E．碱性磷酸酶4.识别DNA回文结构并对其双链进行切割的是：（ A ）5.用于PCR反应的酶是：（ D ）6.将目的基因与载体进行拼接的酶是：（ B ）A．转染B．转化C．感染D．转导E．转位7．以质粒为载体，细菌为宿主的导入方式是：（ B ）8．以噬菌体为载体，细菌为宿主的导入方式是：（D ）9．以病毒为载体，哺乳动物细胞为宿主的导入方式是：（ C ）A.94℃B.85℃C.50℃D.72℃E.100℃10.PCR变性温度一般为：（ A ）11.PCR退火温度一般为：（C ）12.PCR延伸温度一般为：（ D ）A分 B 切 C接 D 转 E 筛13．获取目的基因属于基因工程中的步骤是（ A ）14.DNA连接酶用于基因工程中的步骤是（ C ）15.DNA重组子转化宿主细胞的步骤是（ D ）16.限制性内切酶切割目的基因和载体的步骤是（ B ）17.对含有DNA重组体的宿主细胞进行筛选的步骤是（ E ）三、C型题A、含有该生物的全部基因B、含有该生物的结构基因C、两者都是D、两者都不是1、基因组文库（ A ）2、cDNA文库（ B ）A、需要逆转录酶B、需要限制性内切酶C、两者都是D、两者都不是3、建立cDNA文库（ C ）4、建立基因组文库（ B ）A、连接酶B、逆转录酶C、两者都是D、两者都不是5、建立cDNA文库需要（C ）6、建立基因组文库需要（ A ）四、X型题1.可用于基因工程载体的DNA分子有：( BDE )A．染色体DNA B．病毒DNA C．细菌DNAD．噬菌体DNA E．质粒DNA2.重组DNA技术的基本过程包括：( ACDE )A．目的基因的获取B．PCR反应C．克隆载体的构建D．目的基因与载体的连接E．重组体分子导入受体菌3.基因克隆又称为：( AC )A．重组DNA B．重组RNA C．DNA克隆D．RNA克隆E．蛋白质复制4.组成PCR反应体系的物质包括：( BD )A．RNA引物B．Taq DNA聚合酶C．RNA聚合酶D．DNA模板E．ddNTP5.对于重组体的筛选，属于直接选择法的是：( BCD )A．免疫化学法B．原位杂交法C．Southern印迹D．补救标志筛选E．抗药性标志筛选6.对于重组体的筛选，属于非直接选择法的是：( AE )A．免疫化学法B．原位杂交法C．Southern印迹D．补救标志筛选E．酶联免疫筛选7.限制性核酸内切酶切割DNA时可产生：( ABCE )A．5’粘性末端B．3’粘性末端C．平末端D．单链缺口 E．粘性末端8.基因工程中目的基因的来源有：( ABCDE )A．化学合成B．PCR合成C．cDNA文库D．基因组文库E．组织细胞中染色体DNA直接提取9.基因工程中外源性基因又称为：( ABD )A．目的基因 B．目的DNA C．目的RNAD．target DNA E．外源RNA10．重组DNA技术中常用的工具酶有：( ABCDE )A．限制性核酸内切酶B．DNA聚合酶ⅠC．DNA连接酶D．反转录酶E．末端转移酶11．作为基因工程的载体必须具备的条件是：( ABCD )A．能独立自主复制B．易转化C．易检测（含有抗药性基因等）D．具有限制性内切核酸酶的位点E．易提取获得五、填空题1．基因工程的一个理想的载体必须具备的条件有__至少有一个复制起点____、___有克隆位点、具备转化的功能、遗传标记基因___、___具有较高的装载能力___。
基因工程重组体克隆的筛选和鉴定
基因功能的正向遗传筛选技术
突变体库的构建
通过化学诱变、同源重组 等技术构建大规模突变体 库。
表型筛选
通过特定表型筛选出具有 特定功能的突变体。
突变基因的鉴定
通过测序等技术鉴定出突 变基因，并研究其功能。
05
克隆基因的应用前景
克隆基因在医学上的应用
疾病诊断与治疗
利用克隆技术获取特定基因，可用于疾病诊断、药物研发和个性化治疗。
基因敲入
将特定基因敲入生物体基因组，观察 生物体表型变化，以确定该基因的功 能。
基因表达干扰
通过转录因子或RNAi技术干扰特定 基因的表达，观察生物体表型变化， 以确定该基因的功能。
正向遗传筛选
通过突变体库筛选具有特定表型的突 变体，鉴定突变基因，以研究该基因 的功能。
基因敲除和敲入技术
基因敲除技术
基于测序的筛选
对转化子进行全基因组测序或目的基因片段测序，与已知序列进行比 对，判断是否含有目的基因。
蓝白筛选法
原理
步骤
利用载体上标记基因的表达产物对转化子 进行筛选，通过菌落颜色的变化判断是否 含有目的基因。
将转化子涂布在含有抗生素的培养基上， 培养后观察菌落颜色变化，蓝色菌落为阳 性克隆，白色菌落为阴性克隆。
基因表达的蛋白质印迹分析
原理
利用特异性抗体检测样品中特定蛋白质的表达情况，通过显 色反应或荧光信号对蛋白质进行定性或定量分析。
用等 方面的研究。
04
克隆基因的功能研究
基因功能研究的方法
基因敲除
通过基因工程技术将特定基因敲除， 观察生物体表型变化，以确定该基因 的功能。
Northern印迹杂交
原理
基于RNA的电泳分离和转移，将RNA 片段与标记的探针进行杂交，以检测 特异的RNA转录本。
实验17-重组体筛选与鉴定
9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分钟。
10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板 上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟
11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。
四、实验注意事项
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时 为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态
4）清洗掉未结合的二抗。 5）用HRPO的底物浸泡膜。 6）暗室里曝光，冲洗胶片。
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
2. 增加新性状
使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 例： 小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
三 DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
电泳buffer
电泳buffer
点样
电泳方向
③蛋白质电泳的分子
Da
量标准
已知分子量的蛋白质 混合液，与待测样品 一起电泳，为样品蛋 白质提供分子量估计。
商品化供应
道尔顿(质量单位, 等于 一氧原子质量的十六分 之一。 一克约为6×1023道尔顿
Dalton SDS PAGE
④凝胶中的蛋白质染色： 1）直接染色 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可 褪色回收。
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇 培养至OD600值达到0.5-0.6之间
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
(参考)基因工程 第六章 DNA重组的操作
(三) 酶联免疫吸附测定（ELISA） Enzyme-linked immunosorbant assay 1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
2. 酶联（enzyme-link）： 二抗上携带一种酶能催 化无色底物转变为有色的物质（或发光），再通 过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而
其中载体介导的转化方法是目前植物基因工程中使用最多、 机制最清楚、技术最成熟的一种转化方法，而转化载体中 又以Ti质粒转化载体最为重要。
26
（三）重组DNA导入动物细胞
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导感染法 显微注射法 病毒感染法 DEAE葡聚糖转染技术 电击法 血影细胞介导法
为了克服以上弊端，目前对平末端连接常采用同 聚物加尾法、衔接物连接法和DNA接头连接法等改 进方法。
9
三、PCR产物的连接
PCR扩增是获得目的基因的重要途径 PCR产物的连接是基因工程实验中经常性的工作， 其主要方法有：
引入酶切位点克隆法、T-A克隆法和平末端克隆法等
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（一）引入酶切位点连接法
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电转化的原理图（引自孙明，2006）
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（二）感染 将以λ噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒 颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染，由噬菌体 和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导 （transduction）
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二、重组DNA导入真核细胞的方法
常用的方法有电击法、磷酸钙沉淀法、脂质体 介导法等； 进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基 因组中，也可以在染色体外存在和表达。
第六章重组体的筛选与鉴定
一、根据载体表型特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 检测外源DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应。 DNA插入作用的一种通用方法是插入失活效应
1.以 1.以pBR322质粒为例 质粒为例
（1）pBR322质粒的一般特性 质粒的一般特性 在pBR322质粒上有两个抗生素基因，Ampr基因内有 pBR322质粒上有两个抗生素基因， 质粒上有两个抗生素基因 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点， PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点 一个PstⅠ限制性核酸内切酶的唯一识别位点，Tetr基 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 因内有BamHⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶单一识别 BamHⅠ 两种限制性核酸内切酶单一 位点。 位点。
如下图所示
一、根据载体表特征的筛选 （一）抗药性标记插入失活筛选法
Ampr pBR322 Tetr AmprTetr
菌落原位影印
pBR322
+
pBR322
AmprTets
Amp琼脂平板 琼脂平板
Tet琼脂平板 琼脂平板
图 应用抗生素抗性基因插入失活筛选重组体
一、根据载体表特征的筛选 （二）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法 1.乳糖操纵子的结构 1.乳糖操纵子的结构
二、根据插入基因遗传性状的筛选 (一)原理 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后, DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后 重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞后,如果 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表 达,而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 形成互补,那么就可以利用营养突变株进行筛选. 互补 (二)举例 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时 当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时,将该基因 亮氨酸的基因 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中 重组后转入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中,在仅仅缺 亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用 能利用表达产物亮 少亮氨酸的基本培养基上筛选,只有能利用表达产物亮 氨酸的细菌才能生长 因此,获得的转化子都是重组子 生长, 转化子都是重组子. 氨酸的细菌才能生长,因此,获得的转化子都是重组子.
基因工程6重组体克隆的筛选与鉴定.pptx
此外，在pBR322质粒的Ampr基因序列中， 也有一个Pst I限制酶的唯一识别位点。Ampr基 因正常情况下表达产生-内酰胺酶，在其作用 下青霉素会变成青霉酮酸，当加入碘-青霉素指 示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M 的pH 6.4的磷酸缓冲液），AmprTetr菌落为无 色透明。但当pBR322质粒的Ampr基因插入失 活后，AmpsTetr菌落在碘-青霉素指示液中不褪 色，仍呈碘的蓝灰色。根据菌落周围指示液颜
先将含有DHFR-mRNA的小鼠总mRNA制 嘧啶呈 现抗性这种性状特征，将转化的细菌生长在含 有三甲氧苄二氨嘧啶的培养基中（其含量水平 为可以抑制大肠杆菌的DHFR的活性），选择 转化子。这样分离出来的抗性克隆，显然都是 由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，赋予寄 主细胞新的抗性表型所致。
6.1.3 利用噬菌斑形态选择重组体分子
把DNA包装成有活性的噬菌体颗粒，主 要取决于两个因素：一是要具有能被噬菌体 包装蛋白和头部前体所识别的区域，即cos区； 二是DNA的长度，只有重组体DNA是野生型 DNA的75~105%的长度时，才能在培养平板上 形成清晰的噬菌斑，而单一的载体DNA是不 会包装成பைடு நூலகம்的噬菌体颗粒的。
对于这些由混合的DNA制剂转化而来的大 量的克隆群体，需要采用特殊的方法，才能选 择和鉴定出可能含有目的基因的重组体克隆。 目前已发展和应用了一系列重组体克隆检测法， 包括遗传检测法、物理检测法、使用特异性探
针的核酸杂交法，以及免疫化学法等。
6.1 利用表型特征选择（遗传检测法）
表型是指机体遗传组成同环境相互作用 所产生的外观或其他特征。这里所说的供筛 选用的表型特征来自两个方面：一个是克隆 载体提供的，另一方面是插入的外源DNA序 列提供的，前者应用较多。
重组基因的导入和鉴定
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（2）叶盘共培养法
该方法最早由Horsch(1985)首创， 用于烟草转化 。
优点：适用性广，对于那些能 被农杆菌感染的、并能从叶子 再生植株的各种植物均适用。
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（3）悬浮细胞或愈伤组织共培养
原则上，该种共培养与原生质体共培养的 方法和步骤是相同的，在供体上，则必 须是有侵染和感染能力的载体系统，如 带有Ti质粒的根癌农杆菌。
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(3)脂质体转染法
将磷脂、胆固醇或其他脂类的乙醚溶液 加入到DNA溶液中，经特殊处理得到单 层或双层的带DNA的脂质体小泡，通过 与细胞膜融合，被细胞内吞而实施基因 转移。这类方法基因转移效率很高，据 报道最高时，100％离体细胞可以瞬时 表达外源基因。
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三、基因转移的生物方法
(一）载体介导
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（1）原生质体共培养法
取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长 出细胞壁的原生质体作短暂的共培养， 促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物 质的转化。
1、共培养法(cocultivation)
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烟草原生质体与Ti质粒转移的共培养法程序为：
①从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。 ②原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度l05／ml、农杆 菌l07／ml，20℃下保温32小时。 ③冲洗去游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mg／L 万古霉素，200mg／L羧苄青霉素，200mg／L链霉素)的培养基 中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。 ④3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周内， 转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快 速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。
当CaCl2、DNA和磷酸盐缓冲液缓慢混合
重组体的筛选和鉴定
8.1
遗传学检测法
一、利用载体提供的表型特征筛选重组体 1 抗药性标记及其插入失活选择法 原理： pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;
Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
因插入外源DNA而导致基因失活的现象称之为插入失活效应。
无环丝氨酸培养基
氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
2.蓝白斑筛选法
乳糖
-半乳糖苷酶
半乳糖
Xgal
半乳糖
+ +
葡萄糖
5-溴-4-氯靛蓝
深蓝色
原理：
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段 （氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌 基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺 失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因 组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。
Autoradiogram
Transfer protein
Autoradiography
Protein band detected by specific antibody
SDS-Polyacrylamide gel
Polymer sheet
Autoradiogram
8.4 免疫化学类检测法
对表达产物的检测。蛋白—蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
筛选哺乳动物转基因细胞常用的报告基因
在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶 (Cat) 基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳 动物转基因细胞的筛选。 常用的标记基因还有： -- 胸腺核苷激酶基因（TK） -- 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） -- 黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（XGPRT）
重组克隆的筛选与鉴定.ppt
18
③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很 灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、 IPDG的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它 能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子 克隆因Lac Z基因被破坏，不能合成完 整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而 呈白色。
②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不 同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体 培养基表面接触一下。
③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培
养基上去找那些原始的克隆。 ⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就
是含有重组pBR322质粒的重组子。
6
图 pBR322的结构图
42
2. 同源序列
不同来源的核酸单链只要彼此之间有一 定程度的互补顺序，即某种程度的同源 性，就可形成杂交双链。
分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与DNA（Northern blot） 或RNA与RNA（In situ）的二条单链之 间进行。
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3. 分子杂交法
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第四节 核酸的分子杂交
核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70 年代建立，应用DNA或RNA探针，与 靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸 纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。
核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转 化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选 将转化后生长的菌落，复 印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落， 释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的 核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在 含有目的序列的菌落DNA上。
重组体的筛选和鉴定
1975年，英国Southern创建
针对DNA的杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探 针进行检测的方法。
原理：将重组菌的基因组或质粒DNA提取出来，经合适的限制
性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，把定位在凝胶 中的DNA碱变性处理，使其双链DNA分开，再将凝胶中变性的 DNA转移到硝酸纤维素膜上，用制备的标记探针与其充分混合， 进行同源性DNA杂交。
为Tcr表型．而质粒为Tcs表型。
转化菌涂在Tc平板上，只有含有外源DNA插入片段
的阳性重组子的转化菌能生长成菌落。
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（3）显色反应筛选：蓝白斑筛选
乳糖 -半乳糖苷酶 X-gal 半乳糖 + 葡萄糖 + 5-溴-4-氯靛蓝 α-互补 深蓝色 （酶活）
半乳糖
β—半乳 糖苷酶
α链（lacZα） ：四聚体装配
A
T T
表型筛选加酶切筛选
T A A T
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二、目的克隆的鉴定
（一）核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下(适宜的温 度和离子强度)可按碱基互补的原则退火形成双链.
杂交分子可在DNA和DNA、DNA和RNA、RNA和RNA以及人工合
18
19
20
pUC18/19
5’
lacZ’
EcoRI SacI
EcoRI SacI
KpnI SmalI BamHI XbaI SalI
pUC18
PstI
SphI Hind III
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTG
重组体的筛选与鉴定优秀课件
1. 原理： pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
pBR322
2. pBR322抗菌素标记选择
（1）四环素：
抑制细菌生长，但不杀死细菌。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
酶切前
酶切后
载体
插入片断
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA,并 进行克隆,在前者的克隆 中筛选到A基因,但在后者的克 隆中未筛选到A基因,请说明原因.
2. 受体细胞
受体细胞除了具备限制重组缺陷性状外，还与所转化载体 DNA性质相匹配
3. 转化操作方面
受体细胞的预处理 感受态细胞的制备
如：Ca2+诱导的转化细胞与菌 龄、氯化钙处理时间（12~24h） 感受态的保存期、热脉冲时间等
4. 转化后重组子的整合与表达
筛选的两层含义：将携带有外源插入DNA片段的克隆挑选出来，将携 带有外源插入片段的重组体挑选出来
Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环 丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长， 反而被环丝氨酸杀死。
无环丝氨酸培养基
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程
如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二、-半乳糖苷酶显色反应选择法
受体菌：his外源基因：his+
在不含组氨酸的 培养基中生长
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通过农杆 菌侵染植 物外植体
将含有外源目的基因的 TDNA整合到植物细胞基因 组中，获得转基因植株
叶 盘 法 的 具 体 操 作
在饲养平皿的滤 纸上培养2天
2. 基因枪法（gene gun） 又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微 粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。 1.2m钨弹头 外植体制备 基因枪 轰击
② 加尾－碱基互补
分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。
③优点：
能把任何片
段连接起来
④缺点： 操作繁琐；
外源片段难以回收；
同聚物尾巴影响外源 基因表达。 非酶切位点
（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （2）衔接物（linker）连接
Linker： 用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数
（一） 直接连接
T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低， 只有粘性末端的1~10%。 5’ P3’ HO-OH 3’ 5’ P-P 5’ 3’ HO-OH 3’ -P 5’ -OH 3’ -P 5’
5’ P3’ HO-
（二） 人工加尾形成 “粘性末端”
（1）同聚加尾法 ① 原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞
1. 原生质体转化 2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 3. PEG1000转化法
4. 电击法
（二）导入植物细胞
（三）导入动物细胞
1. 利用原生质体进行转化 酶去壁 酵母 CaCl2 PEG
原生质体
感受态 转化
插入外源基因的载体 转化细胞达原生质体总数的1%~2%，转化率受再生率影响
Blunt-ended DNA
5‘p-GATCCCGGGGCC-
BamHI adapter -CCGG -GGCCCTAG-P5’
② 优点：
连上后就能用。 ③ 缺点： 接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接 CCGG GGCCCTAG-p5’ 5‘p-GATCCCGGGGCC-
④ 防止自我连接
三、 PCR 产物的连接 2. 与 T载体直接连接 PCR产物 载体
dNTP
A
Taq DNA聚合酶
dTTP T
A
T
TA
TA
第二节 重组体导入受体细胞
一、重组DNA导入大肠杆菌
（一）转化（transformation） 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （二）转导（transduction） 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 （三）转染（transfection） 受体菌直接捕获噬菌体DNA的过程。
1. 2. 3. 4. 磷酸钙沉淀法 脂质体介导法 显微注射法 DEAE-葡萄糖转染法
作业
1 农杆菌介导的转化方法的原理及优点。
2 基因枪法的一般步骤。
个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸
EcoR I linker：
GGAATTCC CCTTAAGG
（1）多核苷酸激酶处理
（2）T4连接酶连接
（3）限制性内切酶消化
（4）目的片段与载体连接
（二） 人工加尾形成 “粘性末端” （ 3）DNA 接头 （adapter ）连接法
① adapter
一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列） P-P 5’p-GATCCCGG-OH3’ 3’HO-GGCC-p5’
3. PEG1000转化 PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化 4. 电击转化
（1）适于原生质体和完整细胞 （2）转化率高，105个 / g DNA
（3）单链转化率高于双链
单链含有酵母复制子可转化为双链并复制，无复制子 可同源整合到受体菌染色体上
缺点：需要特定仪器，成本较高
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞
第六章 基因的转移与重组体的 筛选和鉴定
第一节 DNA的体外重组
DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组 合的DNA称为重组DNA。 一、粘性末端的连接 DNA 连 接 酶 把 相 互 靠 近 的 5’ 端 磷 酸 与
3’-OH连到一起
单酶切、双酶切
二、平末端（blunt end）的连接
DNA
吸附
装入
外植体培养及选择
金属微粒加速，进入受体细胞
具 体 操 作
1. DNA微弹的制备
3. DNA微弹轰击
2. 外植体的制备
3. 电击法（电穿孔法） 纤维素酶 植物细胞
和果胶酶
原生质体
DNA
电击处理 选择培养
愈伤组织
混合入 电击缓冲液
分化
幼苗
二、重组DNA导入真核细胞 （一）导入酵母细胞 （二）导入植物细胞 （三）导入动物细胞
5’HO-GATCCCGGGGCC
CCGG -GGCCCTAG-OH5’
nick缺口 虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5’磷酸化
三、PCR产物的连接 1.在引物的5’端设计酶切位点 （1）设计原则
符合载体的多克隆位点；
避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。 （2）带酶切位点的引物的结构 3’端15～20bp与模板互补； 5’端内切酶识别序列＋保护碱基
带酶切位点的PCR产物 5’- GCAGAATTC
PCR产物 PCR产物
GGATCCGCG 3’- CGTCTTAAG
EcoR I位点
EcoR I BamH I 5’AATTC 3’- G PCR产物 PCR产物 G -3’ CCTAG -5’
两头各有一个粘性末端！
共转化的原生质体占转化子总数的25%~33%
共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法
2. 碱金属离子介导的完整细胞转化 酵母 0.1mol/L LiCl处理
感受态
热激
插入外源基因的载体
40% PEG 4000
涂布选择性平板，筛选转化子
吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍
转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少
1. 载体介导的转化（农杆菌介导）
2. DNA直接导入（基因抢法、电击法等）
3. 种质系统法（花粉管通道法等）
（三）导入动物细胞
（二）导入植物细胞
1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法
将 重 组 DNA 转 入含有 Vir 致 病 基因的农杆菌
将目的基因插入到 载体的T-DNA区， 形成重组DNA
先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其 5’端的磷酸，防止自我连接。
BamHI adapter
5’p-GATCCCGG-3’ GGCC-p5’ CIP处理 5’HO-GATCCCGG3’ GGCC-OH5’
nick缺口
Blunt-ended DNA -OH P-P HO-
T4 ligase