高速逆流色谱法分离制备波棱瓜子中波棱芴酮

高速逆流色谱法分离制备波棱瓜子中波棱芴酮巩法强1，2，杨丽1，周洪雷1，王岱杰2，方磊2，王晓2（1.山东中医药大学，山东济南250355；2．山东省分析测试中心，山东济南250014）摘要：目的：建立了常规柱色谱结合高速逆流色谱法（HSCCC ）分离纯化波棱瓜子中波棱芴酮的方法。

方法：首先采用聚酰胺和硅胶柱色谱富集波棱芴酮，再用HSCCC 进行分离制备，HSCCC 最佳溶剂体系为石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水（4ʒ9ʒ6ʒ8，V /V ），上相为固定相，下相为流动相，从200mg 富集物中一次分离得到80mg 纯度为98.3%的波棱芴酮，所得产物经ESI －MS 和NMR 鉴定结构。

结论：本方法所得产物纯度高，重现性好，适合于波棱芴酮的制备型分离。

关键词：高速逆流色谱；波棱瓜子；波棱芴酮中图分类号：R284文献标识码：A 文章编号：1000－1719（2012）05－0897－03Separation of Herpetfluorenone from the Seeds of Herpetospermum CaudigerumWaill．by High-Speed Counter-Current ChromatographyGONG Fa-qiang 1，2，YANG Li 1，ZHOU Hong-lei 1，WANG Dai-Jie 2，FANG Lei 2，WANG Xiao 2（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine ，Ji'nan 250355，Shandong ，China ；2.Shandong Analysis and Test Center ，Shandong Academy of Science ，Ji'nan 250014，Shandong ，China ）Abstract ：Objective ：A method was established for the separation and purification of herpetfluorenone from the seeds of Her-petospermum caudigerum Waill．using conventional column chromatography and high-speed counter-current chromatography．Meth-ods ：The herpetfluorenone was first enriched with polyamide and silica gel．HSCCC was used for the further separation with a two-phase solvent system composed of petroleum-ethyl acetate-methanol-water （4：9：6：8，V /V ）．The upper organic phase was used as stationary phase ，while the lower aqueous phase as mobile．The separation yielded a total of 80mg of herpetfluorenone from 200mg of enriched extract in one step separation with the purity of 98．3%，respectively ，as determined by HPLC．The chemical structure of herpetfluorenone was identified by EI-MS and NMR．Conclusion ：This method fits the preparative separation of herpet-fluorenone for the high-purity and reproductive．Key words ：high-speed counter-current chromatography （HSCCC ）；Herpetospermum caudigerum Waill．；herpetfluorenone收稿日期：2011－11－22基金项目：山东省中青年科学家科研奖励基金（BS2009SW047）；山东省科技发展计划项目（20100816632）作者简介：巩法强（1985－），男，山东莱芜人，硕士研究生，研究方向：中药及复方活性成分与质量控制研究。

通讯作者：王晓（1971－），男，山东临沂人，研究员，硕士研究生导师，研究方向：天然产物研究开发。

波棱瓜（Herpetospermum caudigerum Waill．）是一种常用的藏药，为葫芦科波棱瓜属单属种植物，主要分布于我国西藏、云南以及印度和尼泊尔地区［1］。

波棱瓜子为波棱瓜的干燥成熟种子，味苦，性寒，具有清热解毒、去火降热和助消化作用，可用于治疗肝热黄疸型传染型肝炎和胆囊炎［2－3］。

波棱瓜子中含有多种化学成分，主要为波棱芴酮、波棱醛、波棱醇等化学成分［4］。

现代药理研究表明，波棱瓜子具有较强的抗乙肝病毒保肝降酶活性，乙酸乙酯提取物为其主要有效活性部位，故乙酸乙酯提取物化学成分的研究受到国内外学者的广泛关注［5］。

由于波棱芴酮含量少，常规柱色谱分离方法死吸附严重，难以制备足够量的样品，用于进一步活性研究［5－7］。

高速逆流色谱（HSCCC ）是不使用固态载体的液液分配色谱，根据样品在两相溶剂中分配系数的不同实现样品的分离，避免了固相载体对样品的死吸附、变性等缺点，已广泛应用于天然产物的分离纯化领域［8］。

本研究首次采用常规色谱预处理结合HSCCC 法对波棱瓜子进行分离纯化，制备得到纯度为98．3%的高纯度波棱芴酮单体，为波棱芴酮的快速制备提供了一种有效方法（结构式见图1）。

图1波棱芴酮的化学结构式1仪器、试剂与材料1.1仪器GS10A 型高速逆流色谱仪（北京艾美林科技有限公司）；TBP5002型双柱塞恒流泵（上海同田生物技术有限公司）；3057－记录仪（重庆川仪总厂有限公司）；8823B －紫外检测器（北京宾达英创新科技有限公司）；旋转蒸发器R －3（瑞士BUCHI 公司）；Waters600型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Varian INOVA－600核磁共振波谱仪（美国Varian公司）；Agilent1100series6320ion－trap质谱仪（美国Agilent公司）。

1.2试剂柱层析聚酰胺（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；柱层析硅胶（青岛海洋化工厂分厂）；HPLC用甲醇为色谱纯（美国Tedia公司）；高速逆流色谱和提取用试剂均为分析纯（中国医药集团上海化学试剂有限公司）；水为蒸馏水。

1.3材料波棱瓜子药材采购于四川康定地区，经过四川中医药研究院方清茂研究员鉴定为葫芦科波棱瓜属波棱瓜（Herpetospermum caudigerum Waill.）的干燥成熟种子。

2实验方法2.1提取取波棱瓜子15kg粉碎，石油醚脱脂，过滤，残渣用乙酸乙酯回流提取3次，每次2h，过滤，并滤液，减压浓缩得乙酸乙酯浸膏450g。

将上述乙酸乙酯浸膏经聚酰胺柱色谱分离，先用45%乙醇洗脱，再用50%乙醇洗脱，回收50%乙醇洗脱部分，蒸干得浸膏45g。

将该浸膏进行硅胶柱色谱分离，收集石油醚－乙酸乙酯（2ʒ1 1ʒ1）部位，用旋转蒸发仪减压蒸干，得浸膏2.5g，供HSCCC进一步分离。

2.2溶剂体系的选择取适量样品于10mL试管中，加入等量的上下相各2mL，剧烈振荡，使样品充分溶解，静止分层，取上下相各5μL，分别进行HPLC检测，上相峰面积为A1，下相峰面积为A2，分配系数为K D=A1/A2。

2.3两相溶剂体系及样品溶液的制备HSCCC溶剂体系为石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水（4ʒ9ʒ6ʒ8，V/ V），按比例配制于分液漏斗中并振荡使溶液充分混合，室温下静置分相。

以上相为固定相，下相为流动相，使用前超声波脱气30min备用。

取波棱瓜子柱色谱富集物200mg，加入上下相各5mL，振荡使其完全溶解，以备HSCCC分离。

2.4HSCCC分离过程将固定相以20mL/min流速泵入HSCCC螺旋管中，待充满整个螺旋管后，缓慢调节主机转速到850r/min顺时针旋转，同时以2.0mL/min 的流速泵入流动相，同时开启紫外检测器，待两相达到平衡后进样，检测波长为254nm，根据色谱图收集馏分。

2.5HPLC条件波棱瓜子粗提物和HSCCC分离馏分采用HPLC分析。

色谱柱：Inertsil ODS－3（4.6mm ˑ250mm，5μm）；柱温：25ħ，检测波长260nm。

流动相A为水，B为乙腈。

梯度洗脱程序：0 30min，乙腈30% 50%；30 60min，50% 100%；60 65min，乙腈100% 100%；流速1mL/min；进样量：20μL。

3结果与讨论3.1波棱芴酮的预纯化由于波棱瓜子乙酸乙酯部位成分较为复杂，没有相应的主峰，并且各成分在数量上分布比较均匀，没有显著差别，采用HSCCC对其乙酸乙酯总提取物直接进行分离难度较大。

同时波棱瓜子的有效成分多为带有羟基的木质素类化合物［9］，采用聚酰胺色谱能起到富集带有羟基类化合物的作用［10］，硅胶柱色谱对波棱芴酮可进行进一步的预纯化。

故本文采用常规色谱前处理的方法对乙酸乙酯部位进行聚酰胺和硅胶色谱进行预纯化，再用HSCCC进行制备分离。

3.2HPLC条件的优化本文考察了甲醇－水、甲醇－乙腈－水、乙腈－水作为HPLC流动相时，对波棱瓜子粗提物中各组分的分离效果。

结果表明：当采用梯度洗脱程序：0 30min，乙腈30% 50%；30 60min，50% 100%；60 65min，乙腈100% 100%进行洗脱，流动相的流速为1mL/min时，可以得到良好分离效果（图3A）。

3.3HSCCC分离条件的优化选择合适的两相溶剂体系是HSCCC分离纯化天然药物中活性成分的关键。

通常对HSCCC最合适的分配系数KD值范围是0.5 2。

如果分配系数KD过小，出峰时间太快，不能实现样品的有效分离；而分配系数KD过大，分离时间太长且峰行变宽［11］。

本研究中根据所分离化合物的特性，考察了目标产物在不同比例石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水中的分配系数（见表1）。

结果表明，当采用石油醚－乙酸乙酯－甲醇－水（4ʒ9ʒ6ʒ8，V/V）时，KD 较为合适，因此选择溶剂体系石油醚－乙酸乙酯－甲醇水（4ʒ9ʒ6ʒ8，V/V）进行波棱芴酮的HSCCC分离。